Прикладная биохимия и микробиология, 2022, T. 58, № 4, стр. 338-351

МЕТОДИКА

Штаммы. В работе исследованы 77 штаммов B. anthracis и 2 штамма B. cereus, имеющих различное географическое происхождение (табл. 1). При этом 37 штаммов были выделены на территории России и сопредельных государств, и депонированы в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора (ГНЦ ПМБ, Оболенск, Россия). Другие 40 штаммов B. anthracis, 1 штамм B. cereus biovar anthracis и 1 штамм B. cereus, геномы которых депонированы в базе данных GenBank, были включены в выборку в качестве аутгруппы. Для всех исследуемых штаммов B. anthracis ранее была определена canSNP-группа.

Праймеры. В качестве ПЦР-праймеров для амплификации локуса VNTRacpA использовали V-NTRacpAF – 5'-ATAGGGAAACAACATAATATAAA-3' и VNTRacpAR – 5'-TATTTGCTTGCAAAGATTCCTA-3'.

Полногеномное секвенирование. Культуры штаммов B. anthracis выращивали на твердой питательной среде ГРМ-агар (ГНЦ ПМБ, Россия) в течение 12 ч при 37°C. Геномная ДНК была выделена с помощью набора “Genomic DNA Purification Kit” (“Thermo Fisher Scientific”, США). Библиотеки были подготовлены с помощью набора “Nextera DNA Library Preparation Kit” (“Illumina”, США). Полногеномное секвенирование осуществляли с использованием приборов “MiSeq” (“Illumina”, США) и “Ion Torrent PGM” (“Thermo Fisher Scientific”, США) и соответствующих наборов реагентов: “Miseq Reagent Kit v3” (“Illumina”, США), “Ion PGM Reagents 400 Kit”, “Ion 318 Chip Kit” (“Thermo Fisher Scientific”, США).

Обеззараживание материала проводили в соответствии с СП 1.3.3118-13 и МУ 1.3.2569-2009.

Биоинформатический анализ. Сборки нуклеотидных последовательностей исследуемых генов по результатам полногеномного секвенирования осуществляли с использованием программного пакета Lasergene (“Dnastar”, США) (dnastar.com). В качестве референсного генома, на последовательность которого осуществляли сборку, использовали геном штамма B. anthracis Ames Ancestor (GenBank: GCA_000008445.1).

Поиск нуклеотидных последовательностей штаммов B. anthracis и B. cereus, геномы которых депонированы в GenBank, проводили с использованием программы BLAST (http:// www.ncbi. nlm.nih.gov/blast).

Трансляцию in silico нуклеотидных последовательностей в аминокислотные и множественные выравнивания осуществляли с помощью программного пакета MEGA 7.0 (http://www.megasoftware.net).

Филогенетический (кластерный) анализ проводили с помощью программного пакета MEGA 7.0. Филогенетические древа (дендрограммы) были построены с использованием метода невзвешенного попарного среднего (UPGMA). Для филогенетического анализа использовали слитые in silico последовательности исследуемых генов.

MLVA-генотипирование. MLVA-генотипирование (multiple locus variable number tandem repeats analysis) проводили согласно протоколу, описанному в работе [17] с использованием сконструированных в данной работе праймеров.

ПЦР осуществляли для амплификации VNTR-локуса с использованием набора “Taq DNA Polymerase” (“Thermo Fisher Scientific”, США). Состав ПЦР-смеси: 10× ПЦР-буфер; MgCl₂ – 2.5 мM; дНТФ – 0.2 мM; праймеры – по 10 пмоль каждого на реакцию; Taq-ДНК-полимераза – 1 ед.; в качестве источника матрицы добавляли по 1 мкл раствора ДНК исследуемых штаммов в ТE-буфере (5–20 нг); Н₂О – до 25 мкл. В качестве отрицательного контроля амплификации использовали ТE-буфер. Амплификацию проводили на приборе “Т100 Thermal Cycler” (“Bio-Rad”, США).

Определение длины амплифицированного фрагмента проводили методом гель-электрофореза, рассчитывая результаты путем подсчета числа повторов в VNTR-локусе. Гель-электрофорез проводили в 3%-ном агарозном геле (“Хеликон”, Россия) в 0.5×TBE-буфере с последующим окрашиванием в водном растворе бромистого этидия (100 мг/л). Результаты регистрировали с использованием трансиллюминатора “ECX-F15.L” (“Vilber ourmat”, Франция) при длине волны 254 нм и системы гель-документирования “Взгляд” (“Хеликон”, РФ), а также программного обеспечения “IC Measure” (“Imaging Source Europe GmbH”, Германия).

Размер фрагмента определяли с помощью маркера молекулярных масс “EZ Load 20 bp Molecular Ruler” (“Bio-Rad”, США) с использованием программы “PhotoCamptMw 99.04” (“Vilber Lourmat”, Франция).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Аллельный полиморфизм. В работе были исследованы 77 штаммов возбудителя сибирской язвы, в том числе штаммы, выделенные на месте крупной эпизоотии среди северных оленей на полуострове Ямал (Россия) летом 2016 г. и штаммы, выделенные из вечной мерзлоты из почвы в Якутии [10, 11]. При этом в выборку также были включены штаммы B. cereus, содержащие pXO2-подобные плазмиды (B. cereus bv. anthracis CI и BC-AK). Такие штаммы способны вызывать схожее с сибирской язвой заболевание у человека и человекообразных обезьян [18–20].

Для штаммов исследуемой выборки на основе данных полногеномного секвенирования осуществлена сборка последовательностей генов, локализованных на плазмиде вирулентности pXO2, а именно генов capBCADE-оперона (capB, capC, capA, capD, capЕ), ответственного за синтез капсулы возбудителя сибирской язвы, а также генов acpA и acpB, кодирующих регуляторные белки биосинтеза капсулы.

По результатам работы были выявлены и описаны мутации, а выборка разбита на сиквенс-типы (ST). В исследуемой выборке, состоящей из 79 штаммов, было выявлено 9 ST гена capD (D = 0.3546 [0.2178–0.4915]), по 5 ST генов capA (D = 0.2691 [0.1436–0.3947]), acpA (D = 0.3636 [02347–0.4925]) и acpB (D = 0.1654 [0.0542–0.2767]), 4 ST гена capC (D = 0.2293 [0.1073–0.3514]), 3 ST гена capB (D = 0.0731 [–0.0066–0.1529]), и 2 ST гена capE (D = 0.0491 [–0.0173–0.1155]). Выявленные ST, с указанием их отличий от ST референсного генома, которые заключаются в наличии ряда мутаций, перечислены в табл. S1–S6 . Для каждого гена сиквенс-тип, к которому относится референсный штамм Ames Ancestor, обозначен как ST1. Далее нумерация велась в порядке уменьшения численности входящих в них штаммов B. anthracis, после чего нумеровались ST, к которым относятся штаммы B. cereus. При этом все ST отличались между собой нуклеотидными заменами либо инсерцией, как в случае с геном acpA.

Для оценки фенотипического проявления выявленного нуклеотидного полиморфизма, то есть того, является ли нуклеотидная замена в каждой выявленной позиции синонимичной или приводит к аминокислотной замене соответствующего белка, либо его инактивации из-за появления стоп-кодона, была проведена in silico трансляция нуклеотидных последовательностей в аминокислотные (табл. S7–S12 ). Координаты аминокислотных замен указаны нами для полной последовательности транслированных белков, не учитывая их посттрансляционной модификации, которая описана только для белка CapD и заключается в отщеплении N-концевой сигнальной последовательности размером 28 аминокислотных остатков [21]. В литературе не описаны кристаллические структуры белков, кодируемых исследуемыми генами, за исключением CapD [21, 22], поэтому аминокислотные замены описаны без указания локализации в том или ином домене белка.

Распределение исследованной выборки по последовательностям транслированных белков CapB, CapC, CapA, CapD, AcpA и AcpB указано в табл. S13–S18 . Распределение штаммов осуществляли аналогично тому, как это было сделано для ST-нуклеотидных последовательностей. Всего выявлено 6 изоформ белка CapD, 5 изоформ белка AcpA, 4 изоформы белка AcpB, по 3 изоформы белков CapB и CapA, и по 2 изоформы белков CapC и CapE.

В таблицах не приводятся данные для гена capE, так как исследованная по последовательности этого гена выборка оказалась мономорфной, за исключением штамма B. cereus BC-AK, у которого обнаружено две SNP – 49T → G (17L → V) и 138C → T (синонимичная). Такая низкая вариабельность может быть отчасти объяснена небольшой длиной гена capE (всего 144 п.н.), поскольку при равной частоте возникновения мутаций по всему cap-оперону вероятность того, что мутация возникнет именно на столь небольшом его отрезке, довольно невелика.

Распределение штаммов исследуемой выборки по генотипам (GT), каждый из которых включает определенную комбинацию ST изучаемых генов указано в табл. 2. Нумерацию генотипов осуществляли по указанному выше принципу – GT, в который вошел референсный штамм, обозначенный как GT1. Последующие GT нумеровались в порядке уменьшения количества штаммов, у которых они были выявлены, последние номера присвоили GT, характерным для B. cereus. Всего выявлено 17 GT (D = 0.8908 [0.8604–0.9212]).

Филогенетическое дерево, отражающее отношения выявленных GT приведено на рис. 1.

Рис. 1.

UPGMA-дендрограмма, иллюстрирующая филогенетические отношения выявленных GT. Скобками и цветом выделены GT, принадлежащие к различным эволюционным линиям B. anthracis: A (красный), B (синий) и C (зеленый) или к виду B. cereus.

Таким образом, в настоящей работе был описан аллельный полиморфизм генов капсулообразования B. anthracis и регуляторных генов экспрессии cap-оперона, локализованных на плазмиде pXO2. Были выявлены их ST и кластеризованы штаммы изучаемой выборки по GT, включающие определенный набор ST отдельных генов. То есть по сути, к возбудителю сибирской язвы был применен метод MVLST (Multi-Virulence-Locus Sequence Typing). Ранее этот метод был впервые применен авторами по отношению к данному микроорганизму на основе последовательностей генов токсинообразования, расположенных на плазмиде pXO1. Такая схема была обозначена как MVLST_pXO1-генотипирование. Соответственно, схему генотипирования, предложенную в данной работе, можно обозначить как MVLST_pXO2, а выявленные GT – как MVLST_pXO2-GT.

Анализ кластеризации исследуемой выборки на основе MVLST_pXO2-GT штаммов показал, что MVLST_pXO2-профили коррелируют с видовой принадлежностью (то есть отличаются у B. anthracis и B. cereus) и с принадлежностью к эволюционным линиям в рамках вида B. anthracis. Однако MVLST_pXO2 не позволило четко разделить выборку в соответствии с принадлежностью штаммов к canSNP-группе. При этом в работе [24] была обнаружена ярко выраженная корреляция между MVLST_pXO1-GT и canSNP-группами штамма, а также, в некоторых случаях их привязка к географической зоне. Надо отметить, что MVLST_pXO2-генотипирование, основанное на последовательностях генов, локализованных на плазмиде pXO2, обладало меньшей разрешающей способностью (D = = 0.6148 [0.488–0.7416]), по сравнению с ранее осуществленном аналогичном подходе, основанном на генах плазмиды pXO1 (D = 0.8951 [0.8656–0.9245]) [24].

Среди линии A наиболее распространен MVLST_pXO2-GT1, к которому принадлежат штаммы практически всех canSNP-групп. Другие GT линии A отличались от GT1 одной или двумя SNP и содержали один штамм или объединяли небольшие подгруппы штаммов одной canSNP-группы.

Исключение составлял корейский штамм H9401 (canSNP-группа A.Br.005/007), который отличался от MVLST_pXO2GT1 двумя SNP – capD 796G → A (266V → I) и acpB 495A → G (синонимичная). Однако однозначно считать эти два маркера специфичными для группы A.Br.005/007 едва ли возможно, так как они с такой же вероятностью могут оказаться специфичными для штамма H9401 [25]. Проверить наличие этих двух мутаций у других штаммов группы A.Br.005/007 не представлялось возможным, так как на момент написания работы не было обнаружено данных полногеномного секвенирования штаммов этой canSNP-группы в открытом доступе.

Кроме штамма H9401 уникальными маркерами обладали еще два штамма. Штамм Tangail-1 (A.Br.001/002) обладает SNP capB 230T → C (77V → → A). Штамм Pollino (A.Br.011/009) отличается наличием синонимичной SNP capC 147T → C.

Как указано выше, в нескольких случаях уникальными маркерами обладали не только отдельные штаммы, но и небольшие группы штаммов в рамках canSNP-групп линии A. Так в MVLST_pXO2-GT3 вошли четыре штамма австралийской группы A.Br.Aust94, выделенные в Кавказском регионе – Ставропольском Крае, Чеченской республике и Азербайджане. Эти штаммы образуют отдельный GT благодаря наличию уникальной синонимичной SNP capC 351A → G (capC-ST2). Однако данный маркер отсутствует у штамма 1199 группы A.Br.Aust94, выделенного в том же регионе – в Дагестане.

Для проверки специфичности SNP capC 351A → → G для “кавказских” штаммов A.Br.Aust94 было дополнительно проверено ее наличие в геномах 23 штаммов этой группы, выделенных в различных регионах за пределами Кавказа (табл. 3). В результате искомую SNP не удалось обнаружить ни у одного штамма дополнительной выборки. Таким образом, можно предположить, что подгруппа A.Br.Aust94 capC 351A → G сформировалась именно на территории Кавказа, где и циркулирует совместно с “родительской” формой, и SNP capC 351A → G может быть использован как маркер, наличие которого свидетельствует о регионе происхождения штамма.

CanSNP-группа A.Br.Vollum в исследованной выборке разделилась на три GT. Два штамма, выделенных в Средней Азии принадлежат GT1, общим для линии A. Четыре американских штамма, принадлежащих GT5 (n = 3), отличались от GT1 наличием уникальной SNP acpB 1381 A → G (461I → V). Для GT5 характерно наличие только этой SNP. У GT12 (n = 1) помимо нее обнаруживается уникальная SNP acpB 563C → T (188S → L). При дополнительном поиске этих SNP мы обнаружили девять штаммов дополнительной выборки группы A.Br.Vollum различного географического происхождения, принадлежащих GT1 (n = 4) и GT5 (n = 8) (табл. 4). Таким образом, можно как минимум говорить о том, что группа A.Br.Vollum разделилась на две подгруппы, обладающие разными GT: GT1 (сюда входят оба штамма этой группы, выделенные на территории бывшего СССР) и GT5. GT12, видимо, является штаммоспецифичным генотипом.

Отдельно стоит остановиться на маркерах, характерных для линий В и С. Было обнаружено, что штаммы линий B и C среди всей исследуемой выборки отличаются от штаммов линии A наличием общей SNP acpA 853G → A.

Штаммы canSNP-группы B.Br.CNEVA, выделенные в Центральной Европе, обладают синонимичной SNP capD 234T → C. Однако, у единственного штамма этой группы из ГКПМ-Оболенск данная мутация не выявлена. К сожалению, информация о месте выделения этого штамма не сохранилась, поэтому наличие или отсутствие SNP capD 234T → C нельзя однозначно считать маркером, указывающим на географическое происхождение штамма. Однако в тоже время, наличие этого штамма в “ГКПМ-Оболенск” с большой долей вероятности указывает на то, что данный штамм был выделен именно на территории бывшего СССР. В этом случае есть некоторые основания предполагать, что эта SNP все же обладает некоей филогеографической значимостью. Однако штамм 44 – единственный доступный штамм группы B.Br.CNEVA, у которого местом выделения не значится Центральная Европа, поэтому провести дополнительные исследования распространенности SNP capD 234T → C среди штаммов группы B.Br.CNEVA, выделенных за пределами этого региона, не представлялось возможным.

Эволюционная линия С (canSNP-группа C.Br.001) в исследованной выборке представлена двумя штаммами (2002013094 и 2000031021), выделенными на территории США. Эти штаммы имеют одинаковые нуклеотидные последовательности по всем исследуемым генам и, следовательно, попадают в один GT по результатам филогенетического анализа слитых последовательностей. По результатам проведенного в работе анализа данные штаммы оказались филогенетически ближе к B. cereus, чем другие штаммы исследуемой выборки. С неантрацидными (B. cereus) штаммами их объединяют SNP capC 239C → T (80T → M), capD 208C → T (70H → Y), capD 667A → → G (223K → E), и capD 1135T → A (379F → I).

Одной из задач при написании данной работы являлось рассмотрение возбудителя сибирской язвы как одной из инфекций, возникновение вспышек которой возможно вследствие изменения климата, например, таянии вечной мерзлоты и прорастании спор штаммов, ранее находящихся в замороженных слоях почвы [10]. Ранее рядом исследователей высказывались предположения о возможном возникновении вспышек ряда заболевания, в том числе и сибирской язвы, вызванных изменением климата [26–28].

Штаммы, выделенные во время вспышки на Ямале, а также один из штаммов, выделенных из замороженных слоев почвы Якутии, были ранее отнесены к эволюционной линии В. Здесь, а также в предшествующих работах, в геномах этих штаммов был описан ряд мутаций, являющихся филогенетически значимыми маркерами [23, 24]. Интересной представляется находка бацилл сибирской язвы в аллювиальных отложениях голоцена в Якутии [10]. Хотя наиболее вероятное генетическая датировка указывала на консервацию этих штаммов в период XIII–XVI веков. Геологическое положение находки – ниже слоя сезонного протаивания, возможно, свидетельствует об их возрасте в несколько тысяч лет. Если последнее справедливо, то бациллы сибирской язвы (вероятно, в виде спор) способны предотвращать накопление мутаций в соответствии с ходом “молекулярных часов” в течение длительного сохранения в вечной мерзлоте, создавая эффект “современной ДНК у древней бактерии” [29]. Исследование таких штаммов интересно не только с точки зрения опасности появления вспышек, являющих следствием климатических изменений, но и для лучшего понимания эволюционной истории возбудителя сибирской язвы и других видов бацилл.

При анализе 40 штаммов B. anthracis и двух штаммов B. cereus, геномы которых депонированы в GenBank (табл. 1), в процессе MVLST_pXO2-генотипирования у некоторых штаммов линии В и линии С нами была обнаружена инсерция размером девять пар нуклеотидов в гене acpA, которая при более детальном рассмотрении оказалась частью несовершенного тандемного повтора ATA**GATA. Причем выявлено, что число повторов у штаммов эволюционной линии А равно трем, а у штаммов линии B, принадлежащих группам B.Br.001/002 (n = 3) и B.Br.CNEVA (n = 4) и линии С – четырем. Таким образом мы обнаружили ранее не описанный VNTR-локус в геноме возбудителя сибирской язвы на плазмиде pXO2, названный нами VNTRacpA.

Сама по себе структура тандемных повторов обуславливает специфический характер наиболее вероятных мутаций этих локусов – инсерций и делеций определенной повторяющейся последовательности. Кроме того, частота таких событий значительно превышает среднюю частоту других мутаций в геноме [30, 31]. Поэтому наличие всего двух аллелей данного тандемного повтора в гене acpA в выборке из 42 филогенетически различных штаммов указывает на его низкую вариабельность. Можно предположить, что четыре повтора этого мотива были характерны для “предкового генома” вида B. anthracis до разделения на географически и генетически обособленные группы. Возможно, снижение его кратности до трех приводило к экспрессии варианта белка AcpA, обеспечивающего штамму селективное преимущество, например, за счет более эффективной регуляции экспрессии факторов патогенности. При этом архаичная форма с четырьмя повторами сохранилась лишь у штаммов линий B и C (табл. S5 ).

Ранее для MLVA-генотипирования возбудителя сибирской язвы было предложено использовать ряд VNTR-локусов, в том числе расположенных на плазмиде pXO2. Однако локусы, расположенные на данной плазмиде, представляют участки повторов длиной 2–3 п.н., для определения длины которых требуется дорогостоящее оборудование [32]. Обнаруженный нами локус представляет участок, состоящий из 3 или 4 тандемных повторов длиной 9 п.н., что позволяет разделять амплифицированные фрагменты в агарозном геле.

Полученные результаты показали, что выявленный полиморфизм позволяет использовать число повторов в данном локусе как диагностический признак для дифференцирования эволюционных линий, поэтому в настоящей работе была проведена оценка возможности прикладного использования VNTRacpA для MLVA-генотипирования.

К сожалению, использованный в работе принцип сборки нуклеотидных последовательностей на основе данных полногеномного секвенирования не позволил однозначно определить число повторов в регионе VNTRacpA у штаммов из ГКПМ-Оболенск, в том числе относящихся к линии В. Поэтому были сконструированы ПЦР-праймеры, фланкирующие описанный повтор и протестированы на ДНК коллекции штаммов B. anthracis из “ГКПМ-Оболенск”, вошедших в исследуемую выборку. Был применен подход MLVA-генотипирования путем амплификации локуса VNTRacpA и разделения полученных фрагментов в агарозном геле.

На рис. 2 приведен пример применения локуса VNTRacpA для MLVA-типирования штаммов B. anthracis и дифференцирования эволюционных линий А и В. Результаты анализа с уверенностью позволили дифференцировать штаммы эволюционных линий А и В и подтвердить гипотезу о наличии двух аллелей тандемного повтора, каждая из которых специфична для двух эволюционных линий возбудителя сибирской язвы. Однако в результате проведенного анализа было выявлено, что теоретическая длина амплифицированных фрагментов отличалась от наблюдаемой. Так, теоретическая длина фрагмента, содержащего 3 тандемных повтора, составляла 245 п.н., а четыре – 254 п.н. (рис. 2). Наблюдаемые длины соответствующих фрагментов составляли 300 и 309 п.н.

Рис. 2.

MLVA-генотипирование штаммов B. anthracis из коллекции “ГКПМ-Оболенск” с использованием локуса VNTRacpA. Номера дорожек соответствуют штаммам: 1 – 555/288; 2 – 7(992); 3 – 1056/51; 4 – 44; 5 – 531/17; 6 – 822/7; 7 – 1173; 8 – Yamal-2; 9 – I-364; 10 – 157(B-1107); 11 – LP50/3YA; 12 – LP50/3YA; 13 – LP51/4YA; 14 – 1183. Дорожки 4, 8, 9 и 10 соответствуют штаммам линии В.