Прикладная биохимия и микробиология, 2022, T. 58, № 4, стр. 330-337

МЕТОДИКА

Реактивы. В работе использовали рестриктазу BglII, ДНК-полимеразу Taq, Т4 ДНК-лигазу (“Thermo Scientific”, Литва), а также высокоточную ДНК-полимеразу Kapa HiFi (“Roche”, Швейцария). ПЦР-продукты очищали электрофорезом в агарозном геле и выделяли с помощью QIAquick Gel Extraction Kit (“Qiagen”, США). Олигонуклеотиды (“Евроген”, Россия) представлены в табл. 1. Компоненты питательных сред, соли и другие реактивы были произведены фирмами “Panreac” (Испания) и “Sigma” (США).

Бактериальные штаммы, плазмиды и среды. Штамм E. coli K-12 MG1655 (ВКПМ B-6195) и ранее сконструированный штамм E. coli BOX3.1 ∆4 P_L-atoB P_L-tesB ∆yciA [12], обозначенный как BOX3.3 ∆4, с измененной регуляцией экспрессии генов, кодирующих ключевые ферменты аэробного β-окисления жирных кислот и тиоэстеразу II, а также лишенный путей смешанно-кислотного брожения и активности неспецифичной тиоэстеразы YciA, были использованы в качестве исходных для конструирования всех полученных в работе штаммов. Использованные в работе бактериальные штаммы и плазмиды представлены в табл. 2. Для культивирования бактерий применяли полноценные среды LB, SOB, SOC и минимальную среду М9 [13], при необходимости в них добавляли ампициллин (100 мкг/мл) или хлорамфеникол (30 мкг/мл).

Конструирование штаммов. Введение целевых модификаций в хромосому E. coli осуществляли с использованием методики, описанной ранее [14].

Конструирование фрагментов ДНК для замены нативных регуляторных областей генов fadE, fabI, ydiO и ydiQRST искусственным генетическим элементом P_trc-ideal-4-SD_φ10, содержащим сильный LacI-зависимый промотор и эффективный сайт связывания рибосом гена φ10 из фага Т7, осуществляли в несколько стадий. На первой стадии, с помощью ПЦР были получены фрагменты ДНК, содержащие на 5'-конце участок узнавания BglII, затем промотор P_trc-ideal-4, последовательность SD гена φ10 из фага Т7 и, наконец, 36 нуклеотидов, комплементарных 5'‑концам кодирующих областей генов fadE, fabI, ydiO и ydiQRST. Фрагменты получали в два этапа. На первом этапе, с использованием в качестве матрицы плазмиды pMW-O_lac-ideal-P_trc/O_lac-ideal-lacZ [15], был получен фрагмент ДНК, содержащий на 5'‑конце участок узнавания BglII, затем промотор P_trc-ideal-4 и часть последовательности SD гена φ10 из фага Т7. ПЦР проводили с использованием праймеров Р1 и Р2. Полученный ПЦР-продукт служил матрицей в следующих раундах ПЦР с использованием пар праймеров Р1 и Р3, P1 и P4, P1 и P5, P1 и P6. Праймеры Р3, P4, P5 и P6 содержали область комплементарную 3'-концу промотора P_trc-ideal-4, последовательность SD гена φ10 из фага Т7 и 36 первых нуклеотидов из рамок считывания генов fadE, fabI, ydiO и ydiQRST, соответственно. Параллельно осуществляли вторую стадию конструирования фрагментов ДНК. Фрагменты ДНК, содержащие участок узнавания BglII, маркер устойчивости к хлорамфениколу (ген cat) и 36 нуклеотидов, гомологичных участкам ДНК, непосредственно предшествующим кодирующим областям генов fadE, fabI, ydiO и ydiQRST, были получены при помощи ПЦР с использованием пар праймеров P7 и P8, P7 и P9, P7 и P10, P7 и P11, и плазмиды pMW118-(attL-Cm-attR) [16] в качестве матрицы. Полученные фрагменты ДНК были обработаны эндонуклеазой рестрикции BglII и лигированы Т4 ДНК-лигазой. Продукты лигирования амплифицировали с использованием пар праймеров P3 и P8, P4 и P9, P5 и P10, P6 и P11.

Сконструированные фрагменты ДНК были индивидуально интегрированы в хромосому штамма E. coli MG1655, несущего плазмиду-помощник pKD46. Соответствие запланированных и экспериментально полученных нуклеотидных последовательностей нового регуляторного элемента, введенного перед кодирующими областями генов fadE, fabI, ydiO и ydiQRST, было подтверждено секвенированием с помощью пар праймеров P12 и P13, P14 и P15, P16 и P17, P18 и P19.

Соответствующие индивидуальные генетические модификации были введены в состав хромосом целевых рекомбинантных штаммов с помощью P1-зависимых трансдукций [13]. Удаление маркера, фланкированного att-сайтами фага лямбда, из хромосом целевых штаммов, проводили с использованием плазмиды pMWts-Int/Xis, как описано ранее [17]. Трансформацию штаммов плазмидами осуществляли по стандартной методике.

Культивирование штаммов. Рекомбинантные штаммы выращивали в течение ночи в среде М9, содержащей 2 г/л глюкозы, при 37°C. По 5 мл полученных ночных культур разбавляли в 10 раз, добавляя 45 мл среды М9, содержащей 10 г/л глюкозы и 10 г/л дрожжевого экстракта. Полученные культуры выращивали в колбах объемом 750 мл на роторной качалке при 250 об./мин в течение 8 ч при 37°C. Для индукции экспрессии генов, находящихся под контролем LacI-зависимого промотора P_trc-ideal-4, спустя 3 ч от начала инкубации в среды культивирования добавляли изопропил-β-D-тиогалактозид (ИПТГ) до конечной концентрации 1.0 мМ. Клеточные суспензии центрифугировали в течение 15 мин при 2000 g при 4°C. Осадки ресуспендировали в 15 мл среды М9, содержащей 10 г/л глюкозы и 1.0 мМ ИПТГ. В дальнейшем культуры инкубировали анаэробно в течение 24 ч в пробирках объемом 15 мл, закрытых завинчивающимися крышками, при 37°C на роторной качалке при 250 об./мин. Клеточные суспензии центрифугировали при 10 000 g в течение 10 мин, в полученных супернатантах определяли концентрации секретированных метаболитов и остаточной глюкозы. Все эксперименты повторялись не менее трех раз.

Аналитические методы. Концентрации органических кислот в культуральных жидкостях, освобожденных от биомассы центрифугированием, определяли методом ВЭЖХ с использованием системы “Waters” HPLC system (США). Применяли ион-эксклюзионную колонку Rezex ROA-Organic Acid H+ (8%) (“Phenomenex”, США) с детекцией при длине волны 210 нм. В качестве подвижной фазы использовали водный раствор серной кислоты (2.5 мМ) со скоростью потока 0.5 мл/мин. Для измерения концентрации глюкозы, система была укомплектована рефрактивным детектором “Waters” 2414 и колонкой Spherisorb-NH2 (“Waters”, США). Подвижной фазой служила смесь ацетонитрил-вода в соотношении 75/25 об./об. при скорости потока 1.0 мл/мин.

Концентрации этанола в культуральных жидкостях определяли методом газовой хроматографии на колонке OmegaWax (30 м, 0.25 мм в.д., 0.25 μм толщина пленки, “Supelco”, США). Использовали хроматограф GC-17A (“Shimadzu”, Япония), оснащенный пламенно-ионизационным детектором и автосамплером AOC-20i.

Для количественного анализа содержания в культуральных жидкостях карбоновых кислот продуктов обращения БОЖК использовали газовый хроматограф GC-2010 Plus (“Shimadzu”, Япония), укомплектованный капиллярной колонкой Stabilwax-DA (“Restek”, США) длинной 30 м с внутренним диаметром 0.25 мм и толщиной пленки 0.25 мкм. В качестве газа-носителя служил гелий при постоянной объемной скорости 1.2 мл/мин. Пробы, объемом 0.5 мкл, вводили в испаритель в режиме деления потока 1:20. Температура испарителя и пламенно-ионизационного детектора составляла 150 и 250°C, соответственно. Температурная программа термостата колонки: начальная изотерма – 2 мин при 90°C с последующим линейным градиентом до 200°C со скоростью 10°C/мин и конечной изотермой – 2 мин при 200°C.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В качестве базового для оценки эффективности функционального обращения БОЖК при действии различных нативных ацил-КоА-дегидрогеназ был использован ранее сконструированный штамм E. coli BOX3.3 ∆4 [12] (табл. 2). В данном штамме были инактивированы гены ackA, pta, poxB, ldhA и adhE, кодирующие ферменты путей смешанно-кислотного брожения, вовлекающие в побочные реакции пировиноградную кислоту и ее прямое производное – ацетил-КоА – ключевой метаболит предшественник в реакциях обращенного БОЖК. Кроме того в штамме была усилена экспрессия генов atoB и fadB, кодирующих ферменты БОЖК, которые обеспечивают формирование 3-гидроксибутирил-КоА из ацетил-КоА, а также экспрессия гена тиоэстеразы II, tesB, способной служить терминирующим ферментом, обеспечивающим формирование карбоновых кислот из ацил-КоА-интермедиатов БОЖК. В штамме был инактивирован ген неспецифичной тиоэстеразы YciA с целью дополнительного снижения конкурентной конверсии ацетил-КоА в уксусную кислоту, а также инактивирован ген основной ацил-КоА-дегидрогеназы, fadE, с целью предотвращения множественного обращения БОЖК. В результате, при ферментации в пробирках штамм был способен к синтезу из глюкозы до ~6 мМ 3-гидроксимасляной кислоты в микроаэробных и до ~4 мМ 3-гидроксимасляной кислоты в анаэробных условиях за счет частичного однократного обращения БОЖК [12].

Реакции обращенного БОЖК, катализируемые 3-гидроксиацил-КоА дегидрогеназой и ацил-КоА дегидрогеназой, являются НАДН-потребляющими. Таким образом, анаэробные условия, исключающие интенсивное окисление восстановленных эквивалентов в дыхательной электрон-транспортной цепи с участием кислорода в качестве терминального акцептора электронов, являются более предпочтительными для поддержки многократного обращения цикла. Поэтому эффективность обращения БОЖК в исследуемых штаммах оценивали по концентрациям маркерных соединений, секретированных рекомбинантами в анаэробной стадии двух-фазной аэробно-анаэробной ферментации. Соответствующий процесс культивирования, включающий аэробную стадию накопления биомассы с последующей анаэробной продуктивной стадией, был выбран потому, что штаммы E. coli, дефицитные по путям смешанно-кислотного брожения, не способны к анаэробному росту [17], однако сохраняют метаболическую активность в отсутствие аэрации.

При анаэробной утилизации глюкозы базовый штамм BOX3.3 ∆4 синтезировал уксусную и молочную кислоты, а также этанол (табл. 3) в качестве основных продуктов потребления углеродного субстрата, не секретируя при этом, в силу делеции гена fadE, детектируемых количеств продуктов полного и, тем более, многократного обращения БОЖК (табл. 4).

Следует отметить, что секреция штаммом карбоновых кислот производных ацил-КоА отсутствовала, несмотря на наличие в хромосоме интактных генов fabI и ydiO. Это указывало на то, что природные уровни экспрессии соответствующих генов не могли обеспечить в клетке активность ацил-КоА-дегидрогеназы достаточную для полного функционального обращения БОЖК. Действительно, в случае FabI ацил-КоА-дегидрогеназная активность является побочной по отношению к основной еноил-АЦП-редуктазной активности этого белка [18] и для обеспечения эффективного восстановления кротонил-КоА, необходимого для обращения БОЖК в рекомбинантных штаммах, требуется усиление экспрессии гена fabI [10]. С другой стороны, экспрессия гена ydiO, кодирующего ацил-КоА дегидрогеназу анаэробного БОЖК [11], может быть репрессирована в присутствии кислорода [19]. Аэробные условия, использованные для накопления биомассы штамма BOX3.3 ∆4, препятствовали, таким образом, формированию в клетках в стадии роста такого уровня соответствующего белка, который был бы достаточен для его эффективного действия в последующей биосинтетической стадии. Кроме того, при отсутствии в среде жирных кислот экспрессия генов fad-регулона, в том числе fadE, репрессируется в E. coli транскрипционным регулятором FadR и активность соответствующих ферментов в клетке резко ограничена [20]. В совокупности, это указывало на то, что для обеспечения в клетках рекомбинантов активностей ацил-КоА-дегидрогеназ, необходимых для эффективного обращения БОЖК, усиление экспрессии соответствующих генов являлось обязательным условием.

В штамме BOX3.3 ∆4 экспрессия генов ацетил-КоА-С-ацетилтрансферазы, atoB, и тиоэстеразы II, tesB, контролировалась промотором P_L фага лямбда, являющегося одним из “сильнейших” для E. coli, в то время как перед геном 3-гидроксиацил-КоА-дегидрогеназы, fadB, был расположен промотор P_trc-ideal-4, несколько уступающий по “силе” P_L-промотору [15]. Соответствующие промоторы, в составе искусственных регуляторных элементов, содержащих эффективный сайт связывания рибосом гена φ10 из фага Т7, были расположены перед указанными генами для обеспечения, в первую очередь, возможности эффективной инициации обращения БОЖК и последующего формирования детектируемых продуктов из КоА-интермедиатов цикла, тогда как интенсивность протекания промежуточных реакций могла быть несколько снижена. Таким образом, с целью предотвращения потенциального дисбаланса между инициацией обращения БОЖК, формированием интермедиатов цикла и синтезом конечных продуктов, природные регуляторные области генов fadE, fabI и ydiO в штаммах производных BOX3.3 ∆4 были также заменены искусственным регуляторным элементом P_trc-ideal-4-SD_φ10.

Все соответствующие рекомбинанты формировали при анаэробной утилизации глюкозы профили основных секретированных метаболитов, сходные с таковым, продемонстрированным родительским штаммом BOX3.3 ∆4 (табл. 3). Основными продуктами утилизации глюкозы, сформированными штаммами, являлись уксусная кислота и этанол, выходы которых составляли ~0.5 и ~0.3 моль/моль, а также молочная кислота, выход которой достигал ~0.35 моль/моль.

Секреция штаммами значительной доли потребленной глюкозы в виде уксусной кислоты и этанола, являющихся прямыми производными ацетил-КоА, ключевого предшественника в реакциях обращенного БОЖК, а также молочной кислоты, являющейся, наряду с этанолом, продуктом НАДН-потребляющих реакций, указывала на невысокую интенсивность функционирования в рекомбинантах целевого биосинтетического пути. Тем не менее, штаммы BOX3.3 Δ4 P_trc-id-4-fadE и BOX3.3 Δ4 P_trc-id-4-fabI секретировали заметные количества масляной, капроновой и каприловой кислот (табл. 4), являющихся четырех-, шести- и восьмиуглеродными продуктами полноценного однократного, двухкратного и трехкратного обращений БОЖК. При этом количество синтезированной штаммами масляной кислоты кратно превосходило количество сформированных ими шести- и восьмиуглеродных карбоксилатов. По-видимому, это было связано, в первую очередь, с недостаточно высокой специфичностью ацетил-КоА-С-ацетилтрансферазы AtoB к ацил-КоА-субстратам, содержащим в углеводородной цепи более 4 атомов углерода [21]. Действительно, этот фермент предпочтительно принимает участие в катализе терминальных стадий деградации липидов, тогда как в расщепление более высокомолекулярных интермедиатов вовлекается 3-кетоацил-КоА-тиолаза FadA [21].

Использованные в настоящей работе рекомбинантные продуценты являлись модельными, тогда как при конструировании промышленных штаммов указанная проблема может быть решена при совместном усилении в клетках экспрессии генов atoB и fadA под контролем промоторов обладающих различной силой и регуляцией. Тем не менее, полученные данные позволяли заключить, что использование FabI в качестве ацил-КоА-дегидрогеназы в большей степени способствует многократному обращению БОЖК, нежели применение с данной целью FadE. Действительно, количество синтезированных штаммом BOX3.3 Δ4 P_trc-id-4-fabI капроновой и каприловой кислот в 3.8 и 2.6 раз превосходило аналогичные показатели штамма BOX3.3 Δ4 P_trc-id-4-fadE. Однако, в настоящее время ферментативные свойства FadE и FabI, как ацил-КоА-дегидрогеназ/еноил-КоА-редуктаз, изучены мало. Сообщалось о значительно различающихся показателях специфической ацил-КоА-дегидрогеназной активности для этих белков, составляющей 0.019 и 0.001 мкмоль/мг/мин для FadE и FabI в отношении бутирил-КоА для штаммов, экспрессирующих соответствующие гены в составе идентичных базовых плазмид [10]. При этом данные о константе Михаэлеса в отношении кротонил-КоА, полученные для очищенного варианта рекомбинантного FabI, свидетельствуют о его крайне низком сродстве к соответствующему субстрату.

Таким образом, с точки зрения прикладной биотехнологии, достижение эффективного обращения БОЖК должно основываться, на наш взгляд, на направленной манипуляции уровнями экспрессии ключевых генов с анализом эффективности конверсии субстрата в целевые продукты для последующего выбора стратегии рационального конструирования промышленных продуцентов, а не на данных об их ферментативной активности. Вместе с тем, сообщалось о специфической активности YdiO в отношении бутирил-КоА, составляющей 0.003 мкмоль/мг/мин, что сравнимо с показателем FabI [10]. Однако, штамм BOX3.3 Δ4 P_trc-id-4-ydiO при анаэробной утилизации глюкозы не синтезировал заметных количеств маркерных соединений, свидетельствующих о полном функциональном обращении БОЖК (табл. 4). Ацил-КоА-дегидрогеназа, принимающая участие в E. coli в анаэробном БОЖК, является, по аналогии с клостридиями, сложным ферментативным комплексом, вовлекающим в свое функционирование флавопротеины, обеспечивающие транспорт электронов к терминальному акцептору. Соответствующие белки в E. coli кодируют гены оперона ydiQRST [11], поэтому для обеспечения активности анаэробной ацил-КоА-дегидрогеназы YdiO экспрессия генов данного оперона была дополнительно усилена в клетках штамма BOX3.3 Δ4 P_trc-id-4-ydiO. Итоговый рекомбинант BOX3.3 Δ4 P_trc-id-4-ydiO P_trc-id-4-ydiQRST синтезировал полный спектр продуктов трехкратного обращения БОЖК (табл. 4) с эффективностью, тем не менее, сниженной по отношению к штаммам BOX3.3 Δ4 P_trc-id-4-fadE и BOX3.3 Δ4 P_trc-id-4-fabI. В данной связи нельзя было исключить необходимости участия других коллатеральных ферментов в обеспечении максимальной функциональной активности в E. coli анаэробной ацил-КоА-дегидрогеназы YdiO/YdiQRST, аналогичной таковой, принимающей участие в консервации энергии в клетках облигатных анаэробов и требующей скоординированного действия множества ферментов, вовлеченных в поддержание внутриклеточного окислительно-восстановительного гомеостаза [22]. С учетом сложности обеспечения полноценной функциональной активности анаэробной ацил-КоА-дегидрогеназы для обращения БОЖК в клетках рекомбинантов, полученные данные свидетельствовали о предпочтительном использовании аэробных ферментов для форсированной инверсии данного пути в биосинтетическую сторону.

В результате проведенных исследований охарактеризована способность нативных ацил-КоА-дегидрогеназ обеспечивать в рекомбинантных штаммах E. coli многократное обращение БОЖК для потенциальной продукции востребованных промышленностью соединений. Установлено, что максимальная эффективность оборачиваемости цикла достигается повышением уровня экспрессии в рекомбинантных штаммах гена, кодирующего еноил-АЦП-редуктазу/ацил-КоА-дегидрогеназу FabI. Альтернативой может служить усиление экспрессии гена ацил-КоА дегидрогеназы FadE при соблюдении оптимального баланса между активностями ферментов, вовлеченных в целевой биосинтетический путь.

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 18-29-08059). (18-29-08059).