1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Прикладная биохимия и микробиология
  4. T. 58, № 4, 2022

Прикладная биохимия и микробиология, 2022, T. 58, № 4, стр. 352-359

Роль антигенов Yersinia pestis в адгезии к макрофагам J774, оцененная методом оптической ловушки

И. В. Конышев 1, 2, С. А. Иванов 3, П. Х. Копылов 3, А. П. Анисимов 3, С. В. Дентовская 3, **, А. А. Бывалов 1, 2, *

1 Вятский государственный университет
610000 Киров, Россия

2 Институт физиологии Коми НЦ УрО РАН
167982 Сыктывкар, Россия

3 Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора
142279 Московская обл., Серпухов, р.п. Оболенск, Россия

** E-mail: info@obolensk.org
* E-mail: byvalov@nextmail.ru

Поступила в редакцию 12.10.2021
После доработки 15.12.2021
Принята к публикации 28.02.2022

Полный текст (PDF)

Аннотация

Проведена оценка роли поверхностных антигенов в адгезии Yersinia pestis к мышиным макрофагам J774. С помощью методов оптической ловушки и/ или пассивной адгезии подтверждена способность антигенов Ail и Psa адгезировать к эукариотическим клеткам. Впервые показано, что аутотранспортер YapF является адгезином чумного микроба. Высказано предположение, что указанные антигены не имеют комплементарных рецепторов на поверхности макрофага и их адгезивность носит неспецифический характер. Результаты оценки пассивной адгезии к макрофагам J774 полистироловых микросфер, сенсибилизированных капсульным антигеном F1, позволили предположить, что действие этого антигена в составе микробной клетки, ингибирующее адгезию к макрофагам, определяется не только пространственным экранированием капсулой глубже расположенных адгезинов, но и физико-химическими свойствами этого антигена.

Ключевые слова: Yersinia pestis, макрофаг, адгезия, антиген, оптическая ловушка

Начальный этап инфицирования макроорганизма, как правило, определяется адгезией патогенных бактерий к эпителию желудочно-кишечного тракта, респираторной или мочеполовой систем. Чумной микроб Yersinia pestis может проникать в организм млекопитающего не только в составе вдыхаемого аэрозоля, но и чрескожно в результате укуса инфицированным переносчиком. В последнем случае возбудитель чумы с током крови быстро достигает многих органов и тканей, вступая в контакт с клетками хозяина, включая, помимо профессиональных фагоцитов, эпителиальные, эндотелиальные клетки и фибробласты [1]. Исход такого взаимодействия во многом зависит от оснащенности бактерий адгезинами – специальными поверхностными структурами, способствующими прикреплению микробов к клеткам макроорганизма с последующей их инвазией. Чумной микроб располагает целым набором адгезинов, наличие или степень выраженности которых на наружной мембране зависит от окружающих условий. К числу таких молекул относят прежде всего белки Ail, Pla и Psa Y. pestis.

Родоспецифический белок Ail, кодируемый геном с хромосомной локализацией, имеет у различных видов и штаммов иерсиний незначительные отличия по аминокислотному составу, участвует в обеспечении устойчивости бактерий к комплементу сыворотки крови, их адгезии и инвазии в клетки хозяина [2–4]. Опосредуемая белком Ail адгезия чумного микроба к эукариотической клетке осуществляется путем связывания с компонентами внеклеточного матрикса – ламинином, фибронектином, гепарансульфат-протеогликаном. Это способствует, в частности, доставке в целевые клетки Yops-эффекторных белков наружной мембраны, кодируемых плазмидой кальций-зависимости иерсиний и участвующих в формировании их патогенетического потенциала [5].

Белок Pla (активатор плазминогена), являясь адгезином и протеазой, способствует связыванию возбудителя чумы с белками внеклеточного матрикса [6, 7] с последующей инвазией микроба в эукариотические клетки [8].

Psa (рН6-антиген) экспрессируется преимущественно при слабокислых рН, соответствующих внутриклеточному содержимому. Он может связываться с галактозильными остатками гликосфинголипидов и фосфатидилхолина на поверхности клеток хозяина, проявляя выраженные свойства адгезина [9]. Есть данные, указывающие на то, что Psa способствует адгезии бактерий Y. pestis к эпителиальным клеткам респираторного тракта, но препятствует их инвазии [10]. В то же время, показано, что способность к экспрессии Psa не повышает адгезию клеток возбудителя чумы к мышиным макрофагам RAW264.7 и участие в доставке Yops, но придает микробу резистентность к фагоцитозу [11].

Высокая степень структурной гомологии капсульного антигена F1 Y. pestis и человеческого интерлейкина 1b, а также их высокое сродство к соответствующим рецепторам на поверхности мышиных фибробластов (линии NIH 3T3) позволило авторам цитируемой работы предположить, что F1 может участвовать в адгезии Y. pestis к иммунокомпетентным клеткам хозяина [12]. Позднее было показано, что F1, напротив, ингибирует бактериальную адгезию, по-видимому, путем экранирования адгезинов на поверхности микроба, тем самым предотвращая фагоцитоз, ослабляя взаимодействие с фагоцитами [10, 13, 14].

“Мышиный” токсин (Ymt) не рассматривается в качестве адгезина Y. pestis. Вместе с тем, поверхностная локализация белка [15] и доказанная роль в образовании блока в преджелудке блохи [16], процессе, при котором значима адгезивность бактериальных клеток, не исключают вероятности участия этого антигена в непосредственном взаимодействии патогена со структурами и теплокровного хозяина.

Показана значимость ряда поверхностно расположенных аутотранспортеров Va-типа (около 10) во взаимодействии бактерий Y. pestis с клетками хозяина, однако механизм участия этих белков в чумной инфекции, в частности, в адгезии к клеткам млекопитающих, изучен недостаточно [17, 18].

Установлено, что клетки Y. pestis используют коровую область липополисахарида для адгезии к антигенпрезентирующим клеткам посредством взаимодействия с SIGNR1 (CD209b) – рецептором для последующей диссеминации в лимфатические узлы, селезенку, печень хозяина, инициируя системную инфекцию [19].

По-видимому, во всяком случае формально, к числу адгезинов можно отнести V-антиген Y. pestis, один из белков системы секреции 3 типа T3SS, который вступает в непосредственный контакт с клеткой макроорганизма. Установлен рецептор на поверхности иммунокомпетентных клеток человека – N-формилпептид (FPR1), с которым связывается V-антиген, инициирующий транслокацию эффекторных белков микроба в эукариотическую клетку [20]. Участниками этого процесса являются и другие адгезины возбудителя, в частности, белок Ail [5]. Очевидно, что процесс взаимодействия микробной клетки с клеткой хозяина в условиях in vitro, и тем более in vivo, не может быть описан какой-то одной схемой, так как зависит от типа и особенностей взаимодействующих клеток, а также разнообразия внешних условий. Предполагается, что могут быть идентифицированы и иные, в настоящее время неизвестные механизмы адгезии клеток иерсиний к клеткам макроорганизма [21, 22].

До настоящего времени связь вышеуказанных поверхностных антигенов с адгезивностью чумного микроба к эукариотическим клеткам оценивалась с помощью молекулярно-генетических, микробиологических, а также in silico методов.

Цель настоящей работы – изучение адгезивных свойств ряда поверхностных антигенов Y. pestis к макрофагам J774 с использованием методов оптической ловушки и пассивной адгезии.

МЕТОДИКА

Эукариотические клетки. Культура клеток макрофагов мыши линии J774 получена из Российской коллекции клеточных культур позвоночных (Институт цитологии РАН, Россия). Пересевы клеток проводились в питательной среде RPMI-1640, содержащей L-глутамин с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (“Биолот”, Россия) в CO2-инкубаторе (5% СО2) при температуре 37°С.

Выделение и очистка антигенов. F1-антиген выделяли из супернатанта культуры Y. pseudotuberculosis11M/pFSK3-9 (Государственная коллекция патогенных микроорганизмов и клеточных культур “ГКПМ-Оболенск”) методом осаждения в изоэлектрической точке 4.1 раствором (NH4)2SO4 (30%) и последовательной гель-фильтрацией [23]. рH6-антиген получали из супернатанта культуры E. coli DH5α/pIG824 (ГПКМ-Оболенск) методом осаждения 30%-ным раствором (NH4)2SO4 [24]. Белок Ymt выделяли из экстракта клеток штамма Y. pestis subsp. pestis EV (ГПКМ-Оболенск) фракционированием (NH4)2SO4 с последующей очисткой колоночной хроматографией на сефадексе G-100.

Кодирующую последовательность генов yapF, yapL, yapM и ail из штамма Y. pestis subsp. pestis EV НИИЭГ клонировали в составе векторной плазмиды pET32b(+) по сайтам рестриктаз NdeI и XhoI в клетках протеазодефицитного штамма E. coli BL21(DE3) (“Novagen”, США). Эти рекомбинантные белки (YapF, YapL, YapM и Ail) выделяли методом металло-хелатной хроматографии. Все этапы очистки белков YapF, YapM, YapL и Ail, содержащих His6, выполняли на хроматографической колонке XK-26 (GE Healthcare Biosciences), упакованной 25 мл Ni++-TSK gel AF-Chelate TOYOPEARL 650M (“Tosoh Bioscience”, США) в соответствии с рекомендуемым протоколом производителя в условиях денатурации 6 М мочевиной. Фракции, содержащие белки в максимальной концентрации, анализировали методом электрофореза в ПААГ с ДДС-Na и диализировали против буфера, содержащего 20 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, 0.2 мМ ЭДТА, рН 7.4, для хранения.

Получение антисывороток. Антисыворотки к использованным в работе белкам получали путем иммунизации беспородных белых мышей обоего пола массой 18–20 г. Сорбированные на геле гидроокиси алюминия антигены в дозе 10 мкг вводили животным подкожно в область бедра двукратно с интервалом в 30 дней. Через 30 дней после бустерной иммунизации получали кровь путем пункции ретроорбитального синуса.

Сенсибилизация микросфер антигенами. В работе использовали полистироловые микросферы диаметром 1 мкм (“Polysciences”, США). К 280 мкл антигенов YapM, YapF, YapL, Psa, F1, Ymt (0.3 мг/мл) в фосфатном буферном растворе (ФБР) добавляли 40 мкл 2.5%-ной (вес/об.) суспензии микросфер. После инкубирования на термошейкере при температуре 37°С (250 об./мин) в течение 1 ч суспензию выдерживали в течение 18–20 ч при 4–6°С, центрифугировали (13000 g, 15 мин), осадок ресуспендировали в блокирующем буфере 1%-ного бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 0.05%-ного твин-20. Суспензию инкубировали на термошейкере 1 ч при температуре 37°С (250 об./мин), трижды отмывали ФБР. После заключительного центрифугирования осадок ресуспендировали в ФБР до конечной концентрации микросфер 0.5% (вес/об.). В идентичных условиях параллельно готовили суспензию контрольных микросфер, сенсибилизированных 1%-ным БСА.

Препарат белка Ail солюбилизировали в течение 10 мин в буфере TES (100 мМ Трис-НСl, рH 7.5, 1% ДДС-Na, 5 мM ЭДТА) в объемном соотношении антиген – буфер 4 : 1 и затем диализовали против карбонат-бикарбонатного буфера, рН 9.5, непосредственно перед добавлением суспензии микросфер. Далее раствор белка Ail в концентрации 0.3 мг/мл использовался для приготовления сенсибилизированных микросфер по вышеописанной схеме.

Для подтверждения факта сенсибилизации микросфер тем или иным антигеном использовали метод истощения комплементарной поликлональной сыворотки путем инкубирования в ней сенсибилизированных микросфер. Для этого к той или иной антисыворотке, предварительно разведенной до нужной концентрации, добавляли суспензию соответствующих микросфер в объемном соотношении 10 : 1. После инкубации в течение 2 ч при температуре 37°С суспензию центрифугировали. Убыль иммунохимической активности полученной надосадочной жидкости по сравнению с сывороткой, инкубированной с микросферами, нагруженными БСА, и этой сывороткой до инкубации свидетельствовала о том, что целевой антиген связан с поверхностью микросфер. Активность истощенных и интактных мышиных сывороток к целевым антигенам, за исключением F1, оценивали стандартным методом иммуноферментного анализа (ТИФА), покрывая дно лунок планшета антигенами в концентрации 10 мкг/мл, с последующим добавлением жидкостей, содержащих антитела к тому или иному антигену, козьего антимышиного конъюгата, o-фенилендиамина в качестве субстрата. Интенсивность иммуноферментной реакции выражали в значениях ОП492. Для верификации сенсибилизации микросфер антигеном F1 использовали реакцию непрямой гемагглютинации (РНГА) с комплектом диагностикума чумного антигенного эритроцитарного производства Научно-исследовательского института микробиологии МО РФ (Россия), включающего антисыворотку к F1. Результаты выражали в титре антител.

Определение силы взаимодействия между микросферой и макрофагом методом оптической ловушки. Подробное описание процедуры определения силы отрыва сенсибилизированной микросферы от иммобилизованной клетки было приведено ранее [25]. Измерения проводили с использованием лазерного нанопинцета Nano-TrackerTM (“JPK Instruments AG”, Германия) со встроенным инвертированным микроскопом Nikon Eclipse (“Nikon”, Нидерланды) с объективом 60×, NA = 1.2 и лазером с длиной волны 1064 нм для формирования оптической ловушки и регистрации смещений захваченной микросферы.

На чашку “Fluorodish” диаметром 35 мм (“WPI”, USA) с 2 мл среды RPMI-1640, содержащей гентамицин (100 мкг/мл), высевали клетки до конечной концентрации (10–30) × 103 кл./мл, инкубировали в CO2-инкубаторе (5% СО2) при 37°C в течение 18 ч. Чашку помещали на термостатируемый пьезостолик нанопинцета и после отмывки ФБР иммобилизованных клеток в нее добавляли суспензию микросфер. После калибровки прибора лазерным лучом захватывали микросферу и к ней пошагово (шаг по 50 нм) по оси “OX” подводили чашку с выбранной клеткой до момента их контакта. Через 0.8–1.0 с после остановки чашку отводили с постоянной скоростью 100 нм/ с. О факте разрыва связи между микросферой и клеткой судили по появлению на начальном линейном участке отведения скачкообразной инверсии хронограммы сигнала фотодетектора до базисной линии. Сила разрываемой связи соответствовала амплитуде такого скачка сигнала [25].

Схема проведения экспериментов по измерению силы взаимодействия сенсибилизированной антигеном микросферы и клеткой J774 представлена на рис. 1.

Рис. 1.

Схематическое изображение стадий определения силы связи методом оптической ловушки в модельной системе “сенсибилизированная микросфера – макрофаг J774”.

Определение пассивной адгезии микросфер к макрофагам. В работе использовали полистироловые микросферы диаметром 2 мкм (“Polysciences”, США), которые сенсибилизировали целевыми антигенами по вышеописанной методике. Макрофаги J774 высевали на чашки “Fluorodish” диаметром 35 мм (“WPI”, USA) с 2 мл среды RPMI-1640, содержащей гентамицин (100 мкг/мл), до концентрации 50 × 103 кл./мл (≈100 × 103 кл. на чашку), термостатировали в CO2-инкубаторе (5% СО2) при 37°C в течение 18 ч. После этого содержимое чашек удаляли, дважды промывали их чистой бессывороточной средой и вносили суспензию тех или иных микросфер, предварительно разведённую в 2 мл среды RPMI-1640 до получения расчетной концентрации 2.84 × 106 мл–1 (соотношение микросфер и клеток – 57 : 1). После 20 и 60 мин инкубации при температуре 37°С чашки трехкратно отмывали ФБР, вносили глутаровый альдегид до конечной концентрации 2.5% на 30 мин, после отмывки вносили 2 мл ФБР и с помощью микроскопа Nikon Eclipse (“Nikon”, Нидерланды) с объективом 60×, NA = 1.2, встроенного в лазерный нанопинцет NanoTrackerTM (“JPK Instruments AG”, Германия), подсчитывали количество микросфер, расположенных в проекции случайно выбранной клетки макрофага. Учитывая определенную субъективность учета таких результатов, микроскопию всех препаратов проводил один оператор в слепых опытах с зашифрованными чашками, используя в каждом из них снимки не менее 15 полей зрения. Результаты выражали в средних значениях числа микросфер, приходящихся на одну клетку.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты, представленные в табл. 1, свидетельствовали о том, что использованные в работе антигены Y. pestis связаны с поверхностью полистирола микросфер.

Таблица 1.  

Результаты иммунохимической верификации факта сенсибилизации микросфер целевыми антигенами*

Сенситин микросфер Активность сыворотки до инкубаци с микросферами Активность сыворотки после инкубации с сенсибилизированными микросферами Активность сыворотки после инкубации с микросферами “BSA”
Ail >3.000 0.892 ± 0.188 2.845 ± 0.104
YapM 0.650 ± 0.124 0.252 ± 0.043 0.700 ± 0.136
YapF 1.509 ± 0.280 0.676 ± 0.285 1.748 ± 0.350
YapL 1.021 ± 0.069 0.478 ± 0.027 1.351 ± 0.007
F1 1 : 200 000 1 : 25 000 1 : 200 000
Psa 0.602 ± 0.012 0.361 ± 0.071 0.722 ± 0.051

* Активность сывороточных препаратов для микросфер, покрытых антигеном F1, выражена титром антител в РНГА, для остальных микросфер – в виде ОП492, по данным ТИФА.

Как видно из табл. 2, из числа использованных антигенов Y. pestis лишь белок Ail проявлял выраженные адгезивные свойства: среднее значение силы отрыва сенсибилизированной этим белком микросферы от иммобилизованного макрофага оказалось существенно более высоким по сравнению с контрольными микросферами, покрытыми БСА (р < 0.01).

Таблица 2.  

Сила связи в модельной системе “сенсибилизированная антигеном Y. pestis микросфера – макрофаг J774”, измеренная методом оптической ловушки

Сенситин микросфер Число измеренных отрывов Средняя сила отрыва*, пН
Ail 315 10.83 ± 8.49
YapM 159 8.51 ± 6.63
YapF 135 7.67 ± 6.66
YapL 141 8.29 ± 6.58
Ymt 156 7.22± 4.48
F1 170 7.63± 4.93
Psa 131 7.11± 4.95
BSA 324 8.00 ± 6.23

* Различия достоверны (р < 0.01) только между микросферами, покрытыми Ail, и микросферами остальных 7 типов.

Эти результаты подтверждают ранее опубликованные данные, полученные с использованием иных методических подходов, о значимости белка Ail в адгезивности чумного микроба к эукариотическим клеткам нескольких линий [26]. Экспрессия Ail определяет также устойчивость к действию сыворотки, опосредует доставку Yops в клетки хозяина, способствующей дальнейшему развитию инфекционного процесса. Инфицирование мышей мутантным штаммом Y. pestis KIM5Δail приводит к резкому повышению значения ЛД50 и снижению обсемененности органов, по сравнению с изогенным диким вариантом возбудителя [27, 28]. Адгезивность Ail, по-видимому, определяется наличием в структуре этого поверхностного белка гидрофобной области, а также двух положительно заряженных участков, которые могут индуцировать гидрофобные или электростатические взаимодействия [5]. Учитывая также то, что адгезивность Ail показана в экспериментах с несколькими типами эукариотических клеток и белков внеклеточного матрикса [18], вполне вероятно, для этого белка нет “своего” рецептора, а опосредованная Ail адгезия носит неспецифический характер и определяется физико-химическими особенностями структуры белка.

С помощью метода оптической ловушки не было выявлено способности Psa адгезировать к клеткам J774. Представленные авторами работы [10] результаты экспериментов с использованием рекомбинантного штамма E. coli, несущего ген psa Y. pestis, и полистироловых микросфер, сенсибилизированных антигеном Psa, показали значимость этого антигена как адгезина в отношении эпителиальных клеток респираторного тракта. При этом степень выраженности адгезивных свойств Psa существенно различалась для трех использованных линий клеток. По данным литературы, этот антиген не является универсальным, конститутивным адгезином бактерий Y. pestis, поскольку способен экспрессироваться лишь в структурах макроорганизма, характеризующихся относительно низкими рН, например, макрофагах, участках абсцессов [29]. Этот антиген участвует в связывании микроба преимущественно с клетками респираторного тракта [30]. Вполне вероятно, что несоответствие полученных нами результатов и результатов вышеупомянутой работы [10] объясняется в том числе и использованием эукариотических клеток различных типов.

Представленные экспериментальные результаты свидетельствуют о том, что F1-антиген не является адгезином чумного микроба, во всяком случае, для макрофагов J774. Как показано ранее с помощью иных методических подходов, этот антиген не способствует адгезии микроба к клеткам не только этой линии [13], но и к клеткам других линий [10]. В обзорных работах, посвященных адгезивности чумного микроба, F1-антиген, как таковой, не рассматривается в качестве адгезина [18, 31].

В условиях настоящего эксперимента не проявлял адгезивности также и антиген Ymt Y. pestis. Являясь токсичным для мышей, этот белок не влиял на вирулентность возбудителя в отношении животных этого вида [32], которая, как правило, коррелирует с адгезивностью микроба к клеткам хозяина. Вместе с тем, участие этого антигена в проявлении патогенных свойств Y. pestis для теплокровных животных [33], а также механизмы хронического инфицирования блохи, в частности образование биопленки в пищеварительном тракте переносчика, которое определяется в том числе и адгезивностью микробных клеток, высвобождение возбудителя из биопленки нуждаются в дальнейшем исследовании [16]. Подлежит углубленному изучению значимость в этих процессах и белка Ymt.

Из числа аутотранспортеров Va-типа мы оценили способность трех белков, YapF, YapL и YapM, адгезировать к клеткам J774. Ни один из них не проявил указанной активности при исследовании методом оптической ловушки и выбранных условиях эксперимента.

Адгезивность к клеткам J774 ряда антигенов Y. pestis, представлявших больший интерес, дополнительно оценивали с помощью другого методического подхода. В табл. 3 представлены результаты определения уровня пассивной адсорбции сенсибилизированных микросфер на макрофагах, иммобилизованных на стекле.

Таблица 3.  

Пассивная адгезия сенсибилизированных антигенами Y. pestis микросфер к иммобилизованным макрофагам J774

Время коинкубации микросфер и макрофагов, мин № препарата микросфер Сенситин микросфер Число оцененных клеток Число микросфер, адгезированных на одной клетке, Хmean ± m* № препаратов с существенным
различием
по Хmean ± m (р < 0.01)
60 1 Ail 202 18.99 ± 2.35 4, 5, 6, 2*
2 Psa 201 16.07 ± 2.88 4, 5, 3*,6*
3 YapF 191 19.29 ± 2.45 4, 5, 6, 2*
4 YapM 220 12.37 ± 2.01 1, 2, 3, 5
5 F1-антиген 205 9.84 ± 1.52 1, 2, 3, 4, 6
6 БСА 216 13.11 ± 1.99 1, 3, 5, 2*
20 7 Ail 84 23.54 ± 4.18 8–12
8 Psa 93 13.65 ± 2.78 7, 11,12*
9 YapF 89 10.98 ± 2.49 7
10 YapM 99 11.93 ± 2.85 7
11 F1-антиген 99 9.78 ± 1.78 7, 8
12 БСА 96 10.24 ± 2.38 7,8*

* Различие достоверно при р < 0.05.

Как показывают данные табл. 3, 20 -минутной коинкубации недостаточно для адгезии сенсибилизированных микросфер на макрофагах. Исключение составил белок Ail, который проявил выраженную способность адгезировать к макрофагам линии J774 уже в течение этого периода времени. Эти данные подтверждают результаты экспериментов с использованием оптической ловушки (табл. 2), а также результаты, полученные в других лабораториях с применением иных методических подходов. Увеличение времени экспозиции до 60 мин выявило существенное повышение адгезивности еще и для микросфер, сенсибилизированных антигенами Psa и YapF. Учитывая также показанное методом оптической ловушки отсутствие разницы между силой связи с макрофагами микросфер, покрытых двумя этими антигенами, и контрольными микросферами, покрытыми БСА (табл. 2), для проявления их адгезивности с помощью обоих использованных в работе методов требуется значительно большее (и, вероятно, разное) время по сравнению с микросферами, сенсибилизированными белком Ail.

Следует отметить, что если белок YapM не проявил большей адгезивности сравнительно с контролем (БСА) при обоих методах оценки, то антиген F1, скорее всего, придает полистирольной микросфере противоположное свойство. На это указывает достоверно меньшее (р < 0.01) количество микросфер на поверхности макрофагов по сравнению с контрольными микросферами, покрытыми БСА, при 60-минутной коинкубации (табл. 3).

В целом, полученные в работе результаты подтвердили адгезивность антигенов Ail и Psa к ряду эукариотических клеток, а также отсутствие указанного свойства у “капсульного” антигена F1 чумного микроба. Кроме того, установлена способность аутотранспортера YapF Y. pestis адгерировать к макрофагам J774. По нашему мнению, адгезивность этих белков опосредуется не наличием на поверхности эукариотических клеток строго специфических рецепторов, а носит неспецифический характер, в котором могут быть задействованы гидрофобные и электростатические взаимодействия. Об этом можно судить, в частности, по способности антигенов адгезировать к нескольким компонентам поверхностных структур бактериальной клетки или внеклеточного матрикса. Так, Ail связывается с ламинином, фибронектином, гепарансульфат-протеогликаном [5], Psa – с фосфатидилхолином [35], галактозными остатками гликосфинголипидов [36]. Оценивая экспериментальные данные, как ранее опубликованные, так и полученные в настоящей работе, можно утверждать, что адгезивность бактерий Y. pestis к эукариотическим клеткам – это интегральный феномен, определяемый совокупностью особенностей поверхностных структур двух биообъектов и окружающих условий их взаимодействия.

Результаты проведенных исследований расширяют представления об адгезивных свойствах патогенных иерсиний на начальной стадии инфекции клеток хозяина, во многом определяющей последующее течение заболевания. Предложенные и апробированные методические подходы могут быть востребованы в исследованиях, направленных на дальнейшее изучение механизмов патогенеза бактериальных инфекций в целях создания или совершенствования антиадгезивных терапевтических средств.

Работа выполнена в рамках отраслевой научно-исследовательской программы Роспотребнадзора на 2021–2025 гг.: “Научное обеспечение эпидемиологического надзора и санитарной охраны территории Российской Федерации. Создание новых технологий, средств и методов контроля и профилактики инфекционных и паразитарных болезней”, а также гранта Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых-кандидатов наук (№ МК-3383.2021.1.4).

Список литературы

  1. Ke Y., Chen Z., Yang R. // Front. Cell Infect. Microbiol. 2013. V. 3. 106. https://doi.org/10.3389/fcimb.2013.00106

  2. Joutsen S., Johansson P., Laukkanen-Ninios R., Björkroth J., Fredriksson-Ahomaa M. // Vet Microbiol. 2020. V. 247. 108798. https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2020.108798

  3. Thomson J.J., Plecha S.C., Krukonis E.S. // Mol. Microbiol. 2019. V. 111. P. 82–95. https://doi.org/10.1111/mmi.14140

  4. Tsang T.M., Wiese J.S., Felek S., Kronshage M., Krukonis E.S. // PLoS One. 2013. V. 8. № 12. e83621. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0083621

  5. Yamashita S., Lukacik P., Barnard T.J., Noinaj N., Felek S., Tsang T.M., Krukonis E.S., Hinnebusch B.J., Buchanan S.K. // Structure. 2011. V. 19. № 11. P. 1672–1682. https://doi.org/10.1016/j.str.2011.08.010

  6. Lobo, L. A. // FEMS Microbiol. Lett. 2006. V. 262. № 2. P. 158–162. https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.2006.00382.x

  7. Sebbane F., Uversky V.N., Anisimov A.P. // Biomolecules. 2020. V. 10. 1554. https://doi.org/10.3390/biom10111554

  8. Lahteenmaki, K., Kukkonen M., Korhonen T.K. // FEBS Lett. 2001. V. 504. P. 69–72. https://doi.org/10.1016/S0014-5793(01)02775-2

  9. Felek S., Tsang T.M., Krukonis E.S. // Infect. Immun. 2010. V. 78. P. 4134–4150. https://doi.org/10.1128/IAI.00167-10

  10. Liu F., Chen H., Galván E.M., Lasaro M.A., Schifferli D.M. // Infect. Immun. 2006. V. 74. P. 5636–5644. https://doi.org/10.1128/IAI.00612-06

  11. Huang X.-Z., Lindler L.E. // Infect. Immun. 2004. V. 72. P. 7212–7219.

  12. Abramov V.M., Vasiliev A.M., Vasilenko R.N., Kulikova N.L., Kosarev I.V., Khlebnikov V.S. et al. // Biochemistry. 2001. V. 40. P. 6076–6084.

  13. Du Y., Rosqvist R., Forsberg Å // Infect. Immun. 2002. V. 70. P. 1453–1460. https://doi.org/10.1128/IAI.70.3.1453-1460.2002

  14. Roque A.I., Soliakov A., Birch M.A., Philips S.R., Shah D.S., Lakey J.H. // Advanced materials (Deerfield Beach, Fla.). 2014. V. 26. P. 2704–2616. https://doi.org/10.1002/adma.201304645

  15. Fedorova V.A., Golova A.B. // Vestn. Ross Akad Med. Nauk. 2005. V. 10. P. 19–25.

  16. Hinnebusch B.J., Jarrett C.O., Bland D.M. // Biomolecules. 2021. V. 11. 210. https://doi.org/10.3390/biom11020210

  17. Lenz J.D., Lawrenz M.B., Cotter D.G., Lane M.C., Gonzalez R.J., Palacios M., Miller V.L. // J. Bacteriol. 2011. V. 193. P. 5936–5949. https://doi.org/10.1128/JB.05877-11

  18. Chauhan N., Wrobel A., Skurnik M., Leo J.C. // Proteomics Clin. Appl. 2016. V. 10. № 9–10. P. 949–963. https://doi.org/10.1002/prca.201600012

  19. Yang K., He Y., Park C.G., Kang Y.S., Zhang P., Han Y., Cui Y. et al. // Front. Immunol. 2019. V. 10. 96. https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.00096

  20. Osei-Owusu P., Charlton T.M., Kim H.K., Missiakas D., Schneewind O. // Nature. 2019. V. 574. P. 57–62. https://doi.org/10.1038/s41586-019-1570-z

  21. Bohn E., Sonnabend M., Klein K., Autenrieth I.B. // Int. J. Med. Microbiol. 2019. V. 309. P. 344–350. https://doi.org/10.1016/j.ijmm.2019.05.008

  22. Eichelberger K.R., Sepúlveda V.E., Ford J., Selitsky S.R., Mieczkowski P.A., Parker J.S., Goldman W.E. // mSphere. 2020. V. 5. e00715-20. https://doi.org/10.1128/mSphere.00715-20

  23. Dentovskaya S.V., Shaikhutdinova R.Z., Anisimov A.P. // Adv. Exp. Med. Biol. 2003. V. 529. P. 419–421.

  24. Бахтеева И.В., Кравченко Т.Б., Титарева Г.М., Иванов С.А. // Проблемы особо опасных инфекций. 2007. Т. 94. С. 40–44.

  25. Byvalov A.A., Kononenko V.L., Konyshev I.V. // Appl. Biochem. Microbiol. 2017. V. 53. № 2. P. 234–243. https://doi.org/10.15789/2220-7619-2019-3-4-437-448

  26. Kolodziejek A.M., Hovde C.J., Minnich S.A. // Front. Cell Infect. Microbiol. 2012. V. 2. 103. https://doi.org/10.3389/fcimb.2012.00103

  27. Felek S., Krukonis E.S. // Infect. Immun. 2009. V. 77. P. 825–836. https://doi.org/10.1128/IAI.00913-08

  28. Kolodziejek A.M., Sinclair D.J., Seo K.S., Schnider D.R., Deobald C.F., Rohde H.N., Viall A.K., Minnich S.S., Hovde C.J., Minnich S.A., Bohach G.A. // Microbiology (Reading). 2007. V. 153. P. 2941–2951. https://doi.org/10.3389/fcimb.2012.00103

  29. Lindler L.E., Tall B.D. // Mol. Microbiol. 1993. V. 8. P. 311–324.

  30. Bao R., Nair M.K., Tang W.K., Esser L., Sadhukhan A., Holland R.L., Xia D., Schifferli D.M. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2013. V. 110. P. 1065–1070. https://doi.org/10.1073/pnas.1212431110

  31. Leo J.C., Skurnik M. // Adv. Exp. Med. Biol. 2011. V. 715. P. 1–15. https://doi.org/10.1007/978-94-007-0940-9_1

  32. Hinnebusch J., Cherepanov P., Du Y., Rudolph A., Dixon J.D., Schwan T., Forsberg A. // Int. J. Med. Microbiol. 2000. 290. P. 483–487. https://doi.org/10.1016/S1438-4221(00)80070-3

  33. Brown S.D., Montie T.C. // Infect. Immun. 1977. V. 18. P. 85–93.

  34. Fan Y., Zhou Y., Feng N., Wang Q., Tian G., Wu X., Liu Z., Bi Y., Yang R., Wang X. // Microbes and Infection. 2016. V. 18. P. 329–335.

  35. Galván E.M., Chen H., Schifferli D.M. // Infect. Immun. 2007. V. 75. № 3. P. 1272–1279. https://doi.org/10.1128/IAI.01153-06

  36. Payne D., Tatham D., Williamson E.D., Titball R.W. // Infect. Immun. 1998. V. 66. № 9. P. 4545–4548. https://doi.org/10.1128/IAI.66.9.4545-4548.1998

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Прикладная биохимия и микробиология

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал