Вестник Военного инновационного технополиса «ЭРА», 2023, T. 4, № 2, стр. 133-135

ВВЕДЕНИЕ

Сахарный диабет (СД) сопровождается хронической гипергликемией, вызванной дефектами секреции и/или действия инсулина. Гипергликемия генерирует свободные радикалы, вызывающие окислительный стресс, ослабляющий эндогенную систему антиоксидантной защиты. Окислительный стресс является ключевым фактором, способствующим развитию осложнений диабета, в том числе дистальной нейропатии (ДН) и синдрома диабетической стопы (СДС) [1].

В рамках системы антиоксидантной защиты рассмотрим систему биотрансформации ксенобиотиков, а именно реакции второй фазы биотрансформации ксенобиотиков. Группа генов детоксикации второй фазы представлена суперсемейством глутатион S-трансфераз (GST). Полиморфизм GST определяет индивидуальную чувствительность организма к воздействию факторов внешней среды [2].

Глутатион относится к водорастворимым антиоксидантам, присутствует в высоких концентрациях в каждой клетке, а также в сыворотке крови. Известно, что глутатионопосредованная детоксикация играет ключевую роль в обеспечении устойчивости клеток к перекисному окислению липидов (ПОЛ), к свободным радикалам, алкилированию белков [1].

GST представляют собой многородное надсемейство ферментов, которые катализируют конъюгацию глутатиона с электрофильными соединениями, в том числе вырабатываемыми во время окислительного стресса. GST класса P (GSTP), один из изоферментов GST, имеет особенно высокое сродство к малым ненасыщенным альдегидам. Экспрессия и активность GST во время диабета были широко изучены, но мало что известно о механизмах регуляции GSTP [2].

GST катализирует детоксикацию окисленных метаболитов катехоламинов и может служить антиоксидантной системой, препятствующей дегенеративным клеточным процессам. GST является неферментативным антиоксидантом против активных форм кислорода в системе клеточной защиты. Перепроизводство свободных радикалов в мозге крыс с СД приводит к окислительному повреждению мембранных липидов, белка и в конечном итоге вызывает снижение содержания GST [4].

В связи с этим цель настоящей работы – изучение активности фермента второй фазы биотрансформации ксенобиотиков GST у больных СД 1 и 2 типа, имеющих ДН и СДС.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Обследовано 149 пациентов с СД 1 и 2 типа, имеющих ДН и СДС, которые были разделены на четыре группы. Возраст пациентов в каждой группе – от 18 до 70 лет. Первую группу составили 23 пациента с СД 1 типа мужчин и женщин, имеющих ДН. Во вторую группу вошли 58 больных СД 2 типа мужчин и женщин в возрасте, имеющих ДН. В третью группу вошли 12 пациентов с СД 1 типа мужчин и женщин, имеющих ДН и СДС. В четвертую группу вошли 56 пациентов с СД 2 типа мужчин и женщин, имеющих ДН и СДС. Контрольную группу составили 19 практически здоровых людей соответствующего возраста и пола. Диагноз СД у всех пациентов подтвержден клинико-лабораторными исследованиями. В работе использованы рекомендации федеральной целевой программы “Сахарный диабет”.

У всех обследованных пациентов было взято информированное добровольное согласие, после чего был проведен забор периферической венозной крови, из которой осуществляли получение гемолизата эритроцитов по следующей методике: кровь собирали в стеклянные пробирки с гепарином (200 ед./мл) и центрифугировали при 3000 об./мин в течение 10 мин, затем отбирали плазму, а эритроциты трижды отмывали холодным физиологическим раствором, каждый раз центрифугируя при тех же оборотах в течение 5 мин. Отмытые эритроциты гемолизировали, для чего к 0.1 мл упакованных эритроцитов с помощью пипетки сильной струей приливали 0.9 мл охлажденной бидистиллированной воды. Гемолизат периодически встряхивали в течение 5 мин, а затем центрифугировали при 14 000 об./мин в течение 20 мин для осаждения стромы и неразрушенных клеток [5]. Прозрачный гемолизат сливали в стоящую на льду пробирку и использовали для определения активности GST.

Для расчета GST осуществляли приготовление раствора гемоглобина. Для этого собранную кровь (3–4 мл) центрифугировали при 3000 об./мин в течение 10 мин. Плазму и верхний слой эритроцитов удаляли. Эритроциты трижды отмывали 0.9%-ным раствором хлорида натрия с последующим центрифугированием. К полученной эритроцитарной массе в равном объеме добавляли дистиллированную воду и 0.4 объема четыреххлористого углерода (хлороформ). Пробирку закрывали пробкой и энергично встряхивали в течение 10 мин. После этого пробирку оставляли на 1 ч в холодильнике. Затем образец центрифугировали при 10 000 об./мин в течение 30 мин либо при 4000–5000 об./мин в течение 1 ч, после чего осторожно отбирали гемолизат [6].

Методика исследования активности GST основывается на определении скорости конъюгации восстановленного глутатиона и 1-хлор-2,4-динитробензола. Исследование активности GST в печени при действии физических и химических факторов осуществляли следующим образом:

– готовили контрольную пробу, для чего в пробирку внести 0.8 мл буфера (0.1 моль Na-фосфатного буфера, pH 6.5), 0.1 мл GST (100 ммоль) и 0.1 мл субстрата (100 ммоль 1-хлор-2,4-динитробензола);

– готовили опытную пробу, для этого в центрифужную пробирку внесли 2.4 мл буфера (0.1 моль Na-фосфатного буфера, pH 6.5), 0.1 мл гомогената, 0.1 мл GST (100 ммоль) и 0.1 мл субстрата (100 ммоль 1-хлор-2,4-динитробензола). Опытную пробу инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин, затем добавили 20 мкл 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты для остановки реакции и денатурации белка.

Далее провели центрифугирование при 3000 об./мин в течение 5 мин для осаждения выпавшей в осадок белковой фракции. Измерили оптическую плотность опытной пробы против контрольной при 340 нм и рассчитали ферментативную активность по формуле, учитывая коэффициент молярной экстинкции, равный 9600 м^–1 см^–1 [7]:

где А – активность фермента, ммоль/мин/мг; ∆E = E_оп– E_кон – оптическая плотность опытной пробы против контрольной; t – время измерения, мин; V₁ – общий объем реакционной смеси, мл; n = 21 – коэффициент разведения эритроцитов в пробе; k = 1000 – коэффициент перерасчета ммоль в мкмоль; m = 9600 – коэффициент молярной экстинкции GST; V₂ – объем вносимой пробы плазмы, мл; Hb – гемоглобин.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выявлены отличия в показателях GST по сравнению с контрольной группой (39.47 ± ± 1.69 мМоль/мин/мг):

– у больных с СД 1 типа, имеющих ДН, уровень GST составил 36.63 ± 1.39 мМоль/мин/мг;

– у пациентов с СД 2 типа, имеющих ДН, уровень GST составил 38.14 ± 1.19 мМоль/мин/мг;

– у больных с СД 1 типа, имеющих ДН и СДС, уровень GST составил 42.12 ± 2.62 мМоль/мин/мг;

– у пациентов с СД 2 типа, имеющих ДН и СДС, уровень GST составил 50.26 ± 1.15 мМоль/мин/мг.

Полученные данные статистически обработали с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA), множественные попарные сравнения выполнили с помощью критерия Тьюки. Статистически значимыми признаны показатели при уровне значимости менее 0.05 (p < 0.05).

В результате выявили статистически значимое отличие группы больных СД 1 типа от группы больных СД 2 типа при p < 0.01 и статистически значимое отличие показателя группы больных СД 2 типа относительно группы контроля при p < 0.001.

Определили корреляцию индекса инсулинорезистентностис активностью GST у пациентов с СД 2 типа и нейропатией в качестве предиктора окислительного стресса, который возникает при нарушении окислительно-антиоксидантного равновесия. Активные формы кислорода вызывают повреждение сосудов и ряд воспалений. Результаты настоящего исследования показывают, что нет существенной разницы между пациентами с СД и ДН и здоровыми людьми в резистентности к инсулину (р > 0.05). Активность GST значительно различается между пациентами и здоровыми группами (р ≤ 0.05).

Сообщалось об улучшении резистентности к инсулину и высокой активности GST в группе пациента в качестве предупреждающего признака чрезмерного окислительного стресса. Не было никаких доказательств, раскрывающих связь между резистентностью к инсулину и GST. Настоящее исследование показало, что HOMA-IR имеет положительную связь с уровнем сахара в крови натощак и инсулином в группе невропатии и диабетической группе и отрицательную связь с липопротеинами высокой плотности [3].

Полученные результаты показателей GST позволяют сделать вывод о том, что у больных СД 1 типа с ДН и СДС отмечается более низкий уровень антиоксидантной защиты по сравнению с пациентами, имеющими СД 2 типа, осложненный ДН и СДС, что вызывает более активные дегенеративные клеточные процессы у больных СД 1 типа с ДН и СДС.

Выявленные изменения в состоянии антиоксидантной системы у больных СД 1 и 2 типа с ДН и СДС направлены против отрицательного воздействия ПОЛ и уменьшают последствия оксидативного стресса.

Таким образом, при сравнении свободнорадикальных процессов между группами больных СД 1 и 2 типа с ДН и СДС и соответствующими контрольными группами установлена разница в процессах ПОЛ по накоплению продуктов пероксидации.

ВЫВОДЫ

У пациентов СД 1 и 2 типа установлена активация процессов ПОЛ. Выявлен повышенный показатель GST у пациентов с СД 2 типа, имеющих ДН и СДС, относительно контрольной группы, что свидетельствует о напряжении антиоксидантных защитных механизмов.

Выявленные изменения активности фермента второй фазы биотрансформации ксенобиотиков GST влияют на развитие и течение ДН и СДС у пациентов с СД 1 и 2 типа.