Вестник Военного инновационного технополиса «ЭРА», 2023, T. 4, № 2, стр. 128-132

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время микроводоросли считаются одним из основных возобновляемых источников получения биодизеля благодаря преимущестам перед остальным сырьем: они обладают высокой утилизирующей способностью диоксида углерода и его накоплением в своей бимомассе, высокой скоростью роста и продуктивностью, неприхотливостью и др. [1].

При оптимальных условиях культивирования достигается относительно небольшое количество образующихся липидов в биомассе микроводорослей. Недавние исследования, направленные на решение таких серьезных проблем, как осмотический стресс, регулирование pH, питательный стресс, применение химических реагентов, влияние температуры и тяжелых металлов, были проведены, чтобы разработать и определить эффективные стратегии для увеличения содержания липидов в биомассе микроводорослей. Кроме того, активно разрабатываются генетические манипуляции для индукции выработки липидов микроводорослями. Однако широко используемым методом для индукции выработки липидов микроводорослями является ограничение основных питательных веществ, таких как азота, в среде культивирования [2]. Дефицит азота и фосфора ингибирует рост Chlamydomonas приблизительно на 30% и в то же время значительно увеличивает содержание липидов [3]. В [4] показано, что ограничение по источнику азота в течение культивирования Scenedesmus quadricauda приводит к увеличению более чем в 2 раза выхода липидов (226 мг/л) по сравнению с условиями с достаточным количеством азота (99.3 мг/л). В условиях недостатка азота Chlorella vulgaris, Chlorella zofingiensis, Neochloris oleoabundans и Scenedesmus obliquus накапливали более 35% триацилглицеридов от общего количества высушенной биомассы [5].

В [6] были применены два подхода по ограничению источника азота: двустадийный, при котором выращивание C. vulgaris осуществлялось на богатой азотом среде для стимуляции роста, а затем выросшую культуру помещали в бедную по азоту среду, и одностадийный, при котором засев культуры осуществлялся в питательную среду с необходимым содержанием источника азота, который расходовался по мере роста культуры и истощался к концу культивирования. Для обоих подходов характерно то, что накопление биомассы и липидов зависело от культивируемого вида микроводоросли.

В данной работе рассматривается влияние различной концентрации азота в питательной среде на рост и накопление жирных кислот (ЖК) микроводорослью Chlorella vulgaris, выращенной при естественном освещении.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Использовали культуру микроводоросли Chlorella vulgaris GKV 1 из коллекции НИЦ “Курчатовский институт”, широко используемую для различных исследовательских задач.

Микроводоросль C. vulgaris выращивали в конических колбах Эрленмейера объемом 250 мл со 150 мл питательной среды BG-11 [7]. В питательную среду добавляли в количестве 1 мл на 1 мл среды стоковый раствор микроэлементов [8]. Состав питательной среды и стокового раствора микроэлементов представлен в табл. 1 и 2 соответственно. рН питательной среды доводили до 7.0. Температура при культивировании составляла 16–18 ± 1°С, а освещенность – 500–600 Лк в течение светового дня. Колбы располагали перед оконным проемом на расстоянии 5 см.

В эксперименте по культивированию микроводоросли использовали ту же среду, что и для получения посевного материала, но с изменением концентрации нитрата натрия (NaNO₃): 1, 2, 6 и 10 мМ. pH питательной среды также доводили до 7.0.

Образцы культивировали в течение 21 сут при естественном освещении (интенсивность освещения 390–520 Лк) и комнатной температуре (18 ± 1°C), перемешивание осуществляли путем барботирования атмосферным воздухом со скоростью 200 мл/мин. Контроль роста культуры осуществляли путем измерения оптической плотности на спектрофотометре Thermo Scientific Genesys 10s UV-Vis при длине волны 750 нм.

Для анализа содержания метиловых эфиров жирных кислот (МЭЖК) необходима лиофильно высушенная биомасса. Сбор биомассы проводили центрифугированием при 7500 об./мин (центрифуга Awel MF 20, ротор AMF 20-8 RFID, Франция) в течение 10 мин при 20°C и дважды промывали дистиллированной водой для удаления адсорбированных солей. Собранную влажную биомассу лиофильно высушивали на лиофильной сушилке FreeZone 2.5 (Labconco, США) в течение 12 ч.

Получение МЭЖК проводили прямым метанолизом согласно [9].

Анализ МЭЖК проводили методом газовой хроматографии на газовом хроматографе Bruker 430 GC (Varian Inc. США), снабженном пламенно-ионизационным детектором и кварцевой капиллярной колонкой Select TM Biodiesel (30 м × 0.32 мм × 0.25 мкм). Количество вводимой пробы – 1 мкл [10].

МЭЖК идентифицировали по относительному времени удерживания на колонке компонентов смеси в сравнении со стандартом, количественное содержание индивидуальных ЖК определяли методом нормализации площадей.

Определение абсолютно сухого вещества биомассы проводили высушиванием образца до постоянного веса.

В предварительно взвешенный стеклянный бюкс помещали точную навеску влажной биомассы и выдерживали в сушильном шкафу при температуре 95°С в течение 2 ч. Далее образец биомассы охлаждали до комнатной температуры в эксикаторе над слоем хлорида кальция, взвешивали и повторно выдерживали в сушильном шкафу в течение 45 мин, после чего образец охлаждали и взвешивали.

Количество выросшей биомассы (X) определяли по формуле

где X₀ и X – количество биомассы в начале и конце культивирования соответственно.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Культивирование проходило в весенний период (март), средняя продолжительность светового дня составляла 11.5 ч (рис. 1, 2). Изначально все образцы с различной концентрацией нитрата натрия засевали культурой C. vulgaris до достижения одинаковой оптической плотности 0.1 при 750 нм. Для различных концентраций нитрата натрия в среде характерна одинаковая закономерность постепенного роста. Максимальный рост по биомассе отмечался при концентрации 6 мМ нитрата натрия в питательной среде, минимальный – при 1 мМ (рис. 3).

Исходные значения рН для всех вариантов сред были одинаковыми и составляли 7.0. Для всех исследуемых образцов отмечено защелачивание культуральной среды в процессе роста. Наибольшее изменение рН наблюдалось при концентрации азота в среде 10 мМ, наименьшее – при 1 мМ (рис. 4).

Всего в биомассе было идентифицировано семь индивидуальных ЖК. Сильных различий в концентрациях ЖК при различном содержании азота в среде не наблюдалось. Отметим, что наибольшее содержание пальмитиновой кислоты, олеиновой и линоленовой и наименьшее гептадеценовой и линолевой наблюдалось при концентрации азота 1 мМ (рис. 5). Среди всех ЖК больше всего во всех образцах содержалось линоленовой кислоты (18:3), затем стеариновой (18:0) и пальмитиновой кислот (16:0).

При рассмотрении отдельных групп ЖК отмечено, что наибольшее количество насыщенных и наименьшее ненасыщенных ЖК содержалось в образце с концентрацией азота 10 мМ (рис. 6).

В стандартах и требованиях к биодизелю существует ряд ограничений по профилю образующих его ЖК. Основой подобных ограничений, содержащихся, например, в стандарте EN 14214, является увеличение степени ненасыщенности липидов, приводящее к снижению цетанового числа [10]. С этой позиции наиболее предпочтительно получение биомассы при содержании азота в питательной среде 10 мМ.

В [11] при культивировании C. vulgaris при различной концентрации азота в питательной среде, но при искусственном освещении также было выявлено семь ЖК, аналогичных идентифицированным. Конечные плотности культуры были выше и достигались за меньшее время культивирования за счет использования постоянного искусственного освещения, более высокой температуры и подачи газо-воздушной смеси с 2% CO₂. В исследовании олеиновая (18:1), пальмитиновая (16:0) и линоленовая кислоты (18:3) также преобладали в биомассе. Отметим, что полученные данные (содержание насыщенных ЖК меньше ненасыщенных во всех образцах) согласуются с данными, представленными в [11].

В исследовании [12] представлено подтверждение, что уровень ненасыщенных ЖК увеличивается при низких температурах, а насыщенных ЖК – при высоких температурах. Это объясняется тем, что при более низких температурах содержание растворенного кислорода больше, и кислородзависимые ферменты, десатуразы, могут эффективно работать [6, 13].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Показана возможность эффективного культивирования C. vulgaris при естественном освещении. Максимальное содержание бимассы в количестве 0.4 г/л соответствует содержанию азота 6 мМ в питательной среде. В полученной биомассе было идентифицировано семь индивидуальных ЖК, преобладали линоленовая (18:3), стеариновая (18:0) и пальмитиновая (16:0) кислоты. Показано, что для получения биодизеля более подходящей является биомасса, выращенная при естественном освещении на питательной среде с содержанием азота 10 мМ.

Работа выполнена в рамках тематического плана “Разработка платформенных технологий на основе фототрофных микроорганизмов для интенсивной утилизации СО₂ и производства биотоплив и других полезных продуктов”.