Прикладная биохимия и микробиология, 2023, T. 59, № 1, стр. 46-55

МЕТОДИКА

Общие экспериментальные условия. Семена R. uniflorum были собраны в Прибайкальском районе (Республика Бурятия, Россия) и высушены в микроволновой вакуумной камере Муссон-1 (“ПК Ингредиент”, Россия) до влажности <5%. Образец сырья хранится в гербарии Института общей и экспериментальной биологии СО РАН (№ BU-COM-0920/29-428).

Для колоночной хроматографии использовали полиамид, нормально- (SiO₂) и обращено-фазовый силикагель (ОФ-SiO₂), сефадекс LH-20, оксид алюминия (Al₂O₃) (“Sigma-Aldrich”, Сент-Луис, США). Спектрофотометрические исследования проводили на спектрофотометре СФ-2000 (“ОКБ Спектр”, Россия).

Масс-спектры регистрировали на TQ-масс-спектрометре LCMS-8050 (“Shimadzu”, Япония) [7], спектры ЯМР – на спектрометре VXR 500S (“Varian”, США). Препаративную ВЭЖХ осуществляли на жидкостном хроматографе LC-20 Prominence (“Shimadzu”), снабженном колонкой Shim-pak PREP-ODS (20 × 250 мм, d – 15 мкм) и фотодиодным детектором SPD-M30A (“Shimadzu”), при скорости – 1.0 мл/мин и температуре колонки 20°С.

Экстракция и выделение соединений из семян R. uniflorum. Измельченное сырье (1 кг) экстрагировали водой (1 : 15, 90°С) трижды, после чего водный экстракт упаривали досуха в вакууме (320 г). Экстракт обрабатывали последовательно гексаном, этилацетатом и бутанолом при температуре кипения в аппарате Соклета до истощения, что приводило к получению гексановой (20 г), этилацетатной (ЭАФ, 55 г) и бутанольной фракций (125 г). Фракцию ЭАФ далее анализировали методом хромато-масс-спектрометрии (ВЭЖХ с диодно-матричным и масс-спектрометрическим детектированием, ВЭЖХ-ДМД-МС) на TQ-масс-спектрометре LCMS-8050 (“Shimadzu”, Япония) в условиях, описанных ранее [7]. Для выделения индивидуальных соединений ЭАФ (50 г) разделяли методом колоночной хроматографии на полиамиде (1.5 кг; элюент вода – фракция А, 60%-ный этанол – фракция В, 0.5%-ный аммиак в 90%-ном этаноле – фракция С). Фракцию А (25 г) хроматографировали на колонке с Al₂O₃ (2 × 50 см, хлороформ–метанол 100 : 0 → 70 : 30), а затем на колонке с ОФ-SiO₂ (1 × 20 см, вода–ацетонитрил 95 : 5 → 70 : 30), что привело к выделению 20-гидроксиэкдизона (10 г) и 2-дезокси-20-гидроксиэкдизона (140 мг).

Для разделения фракций В (15 г) и С (18 г) применяли колоночную хроматографию на Сефадексе LH-20 (2 × 90 см) с элюцией в градиенте метанол–вода 90 : 10 → 0 : 100, в результате чего были получены 10 фракций, которые далее хроматографировали на колонке с SiO₂ (2 × 40 см, этилацетат–этанол 100 : 0 → 70 : 30), а затем на колонках с ОФ-SiO₂ (1 × 20 см, вода–ацетонитрил 95 : 5 → → 50 : 50) и Сефадексе LH-20 (1 × 60 см, метанол–вода–уксусная кислота 90 : 5 : 5 → 20 : 75 : 5). Для дополнительной очистки применяли препаративную ВЭЖХ, используя воду и ацетонитрил в качестве элюентов I и II, соответственно (программа элюирования: 0–40 мин 5–30% I в II, 40–90 мин 30–45% I в II, 90–120 мин 45–58% I в II). В результате из фракции В были выделены 6-гидроксилютеолин 7-О-глюкозид (1.5 г), трахелозид (1.0 г), картамозид (5.5 г), лютеолин (80 мг) и картамогенин (900 мг), а из фракции С – 6"-О-ацетил-картамозид (40 мг), 4-О-кофеилхинная кислота (80 мг), 5-О-кофеилхинная кислота (8.2 г), 3,4-ди-О-кофеилхинная кислота (55 мг), 3,5-ди-О-кофеилхинная кислота (4.5 г), 4,5-ди-О-кофеилхинная кислота (45 мг), раунозид В (1.2 г), лютеолин 7-О-(6"-О-кофеил)-глюкозид (1.5 г) и изоферулоил-серотонин (820 мг). Идентификацию выделенных соединений осуществляли по данным УФ, ЯМР спектроскопии и масс-спектрометрии [4–7, 9].

6"-О-Ацетил-картамозид {картамогенин 4-О-(6"-О-ацетил-)-β-D-глюкопиранозид, 15}. C₂₉H₃₄O₁₂, УФ-спектр (МеОН, λ_max, нм): 324. –5.3 (c 0.7, MeOH). HR-ESI-MS, m/z: 573.421 ([M–H]^–; расчетное значение 573.557 для C₂₉H₃₃O₁₂). ESI-MS, m/z: положительная ионизация – 613 [M + K]⁺, 597 [M + Na]⁺, 575 [M + H]⁺, 571 [(M + K)–C₂H₂O]⁺, 555 [(M + Na)–C₂H₂O]⁺, 551 [{(M + H) + + H₂O)}–C₂H₂O]⁺, 533 [(M + H)–C₂H₂O]⁺, 371 [(M + H)–C₂H₂O–C₆H₁₀O₅]⁺, 353 [(M + H)–C₂H₂O– C₆H₁₀O₅–H₂O]⁺, 247, 219; отрицательная ионизация – 619 [(M–H) + HCOOH]^–, 609 [(M–H) + + 2H₂O]^–, 577 [{(M–H)–C₂H₂O} + HCOOH]^–, 573 [M–H]^–, 567 [{(M–H)–C₂H₂O} + 2H₂O]^–, 531 [(M–H)–C₂H₂O]^–, 369 [(M–H)–C₂H₂O–C₆H₁₀O₅]^–. Спектр ЯМР ¹Н (500 Гц, 300 К, МеОН-d₄, δ, м.д.): картамогенин: 7.20 (1Н, д, J = 2.0, Н-2), 6.83 (1Н, д, J = 7.8, Н-5), 7.18 (1Н, дд, J = 7.8, 2.0, Н-6), 7.53 (1Н, д, J = 2.0, Н-7), 6.70 (1Н, д, J = 2.0, Н-2'), 7.26 (1Н, д, J = 8.0, Н-5'), 6.75 (1Н, дд, J = 8.0, 2.0, Н-6'), 3.01 (1Н, дд, J = 14.0, 5.6, Н-$7_{{\text{A}}}^{'}$), 3.78 (1Н, дд, J = = 14.0, 9.0, Н-$7_{{\text{B}}}^{'}$), 4.11 (1Н, м, Н-8'), 4.41 (1Н, дд, J = 9.0, 7.0, Н-$9_{{\text{A}}}^{'}$), 4.27 (1Н, дд, J = 9.0, 2.0, Н-$9_{{\text{B}}}^{'}$), 3.85 (3H, с, OCH₃), 3.75 (3H, с, OCH₃), 3.70 (3H, с, OCH₃); 4-О-глюкоза: 5.05 (1Н, д, J = 7.5, Н-1"), 3.53 (1Н, м, Н-2"), 3.50 (1Н, м, Н-3"), 3.38 (1Н, м, Н-4"), 3.85 (1Н, м, Н-5"), 4.50 (1Н, дд, J = 12.0, 2.0, Н-), 4.25 (1Н, дд, J = 12.0, 5.4, Н-); 6"-О-ацетил: 1.61 (3H, с, CH₃CO). Спектр ЯМР ¹³С (125 Гц, 300 К, МеОН-d₄, δ, м.д.): картамогенин: 128.5 (C, C-1), 116.9 (CH, C-2), 150.7 (C, C-3), 149.5 (C, C-4), 113.1 (CH, C-5), 125.4 (CH, C-6), 138.7 (CH, C-7), 129.8 (C, C-8), 174.3 (C, C-9), 132.3 (C, C-1'), 114.3 (CH, C-2'), 149.2 (C, C-3'), 151.2 (C, C-4'), 115.3 (CH, C-5'), 121.8 (CH, C-6'), 38.0 (CH₂, C-7'), 41.5 (CH, C-8'), 71.5 (CH₂, C-9'); 4-О-глюкоза: 102.2 (CH, C-1"), 74.5 (CH, C-2"), 77.7 (CH, C-3"), 71.2 (CH, C-4"), 75.0 (CH, C-5"), 64.8 (CH, C-6"); 6"-О-ацетил: 19.7 (CH₃, CH₃CO), 170.5 (C, CH₃CO).

Картамозид (картамогенин 4-О-β-D-глюкопиранозид, 12). Спектр ЯМР ¹Н (500 Гц, 300 К, МеОН-d₄, δ, м.д.): 4-О-глюкоза: 5.01 (1Н, д, J = 7.6, Н-1"), 3.50 (1Н, м, Н-2"), 3.47 (1Н, м, Н-3"), 3.35 (1Н, м, Н-4"), 3.43 (1Н, м, Н-5"), 3.58 (1Н, дд, J = = 12.1, 1.9, Н-), 3.40 (1Н, дд, J = 12.1, 5.6, Н-). Спектр ЯМР ¹³С (125 Гц, 300 К, МеОН-d₄, δ, м.д.): 4-О-глюкоза: 102.4 (CH, C-1"), 74.5 (CH, C-2"), 77.9 (CH, C-3"), 70.8 (CH, C-4"), 76.2 (CH, C-5"), 60.9 (CH, C-6").

Гидролиз. Для осуществления кислотного гидролиза навеску 6"-О-ацетил-картамозида (5 мг) нагревали с 2 М ТФУ (4 мл) при 100°С в течение 2 ч, далее гидролизат упаривали в вакууме досуха. Сухой остаток растворяли в 50%-ном этаноле (2 мл) и пропускали раствор через полиамидный картридж (3000 мг, “Capital Analytical”, Великобритания), элюируя последовательно водой (50 мл; элюат I) и 70%-ным этанолом (100 мл; элюат II). Для выявления присутствия моносахаридов порцию элюата I дериватизировали 3-метил-1-фенил-2-пиразолин-5-оном и анализировали методом ВЭЖХ, как описано ранее [10]. Для определения принадлежности моносахаридов к D- и L-ряду в элюате I использовали метод восстановительного аминирования с L-триптофаном [11] с последующим анализом методом ВЭЖХ [10]. Гидролиз с 0.5%-ной NaOH проводили как описано ранее [12].

Биологическая активность. Влияние экстрактов, фракций и индивидуальных соединений на активность α-амилазы изучали спектрофотометрическим методом [8] с использованием α-амилазы поджелудочной железы человека (400 ед./мл; “Lee Biosolutions”, США), α-амилазы слюнной железы человека (тип IX-A, 3000 ед./мг белка; “Sigma-Aldrich”) и α-амилазы поджелудочной железы свиней (тип I-A, 1000 ед./мг белка; “Sigma-Aldrich”). Акарбоза использовалась в качестве положительного контроля. Ингибиторная активность выражалась величиной IC₅₀ (концентрация, вызывающая 50% ингибирование активности фермента) в мкг/мл, которую определяли графически после построения зависимости ингибиторной активности от концентрации.

Для ВЭЖХ-микрофракционирования использовали условия хроматографического анализа, указанные в работе [7], при которых отдельные фракции собирались каждые 30 с. После этого элюаты концентрировали досуха и растворяли в 50 мкл 50%-ного метанола, добавляли 50 мкл воды, 2.5 мл 2%-ной суспензии крахмала, окрашенного ремазол-бриллиантовым синим R (“Sigma-Aldrich”), 500 мкл α-амилазы поджелудочной железы человека (0.4 ед./мл), инкубировали 50 мин при 37°C. Оптическую плотность пробы определяли при длине волны 620 нм [8]. Элюаты с наиболее выраженным ингибированием фермента предотвращали образование синего комплекса, в противоположность неактивным пробам, которые давали интенсивное окрашивание. Отсутствие активности определялось для фракции со временем удерживания 0.5–1.0 мин.

Тест на летальность. Цисты Artemia salina (50 мг; “Арсал”, Россия) инкубировали при 25°С в 1 л искусственной морской воды (“Sigma-Aldrich”), в которую через 24 ч вносили 15 мл 0.06%-ной суспензии дрожжей и продолжали инкубацию еще 48 ч. Для анализа на одну пробу отбирали 10 живых личинок Artemia salina, которых помещали в 5 мл искусственной морской воды, содержащей исследуемое вещество (20–2000 мкг/мл) или 0.9%-ный раствор NaCl (контроль). Через 24 ч проводили подсчет живых личинок, после чего рассчитывали показатель 50%-ной летальности с применением программы MediCalc (“MedCalc Software Ltd”, Бельгия).

Статистический анализ проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). Значимость различий средних определяли с помощью многорангового теста Дункана. Отличия при р < 0.05 считались статистически значимыми.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование влияния водного отвара (ВО) R. uniflorum на активность трех α-амилаз млекопитающих показало, что он демонстрировал наибольшее ингибирование α-амилазы поджелудочной железы человека – IC₅₀ 397.11 мкг/мл (табл. 1). После экстракции ВО различными растворителями были получены фракции, из которых наиболее активной оказалась этилацетатная фракция (IC₅₀ 96.25 мкг/мл), для исследования которой было проведено ее разделение с применением хромато-масс-спектрометрии (ВЭЖХ-ДМД-МС) и колоночной хроматографии.

Согласно данным ВЭЖХ-ДМД-МС в этилацетатной фракции семян R. uniflorum было выявлено присутствие 16 соединений (1–16), идентификацию которых осуществляли по результатам определения хроматографической подвижности (рис. 1а), УФ-, масс-спектров (табл. 2) в сравнении с известными соединениями и данными литературы, а также после выделения и анализа спектров ЯМР (рис. 2).

Рис. 1.

Хроматограмма (ВЭЖХ-ДМД) этилацетатной фракции семян Rhaponticum uniflorum при 240 и 330 нм (а) и ингибиторная активность ВЭЖХ-элюатов в отношении панкреатической α-амилазы (б). Номера пиков соединений соответствуют обозначениям в табл. 2.

Рис. 2.

Структурные формулы соединений, обнаруженных в семенах R. uniflorum: 1 – 4-О-кофеилхинная кислота, 2 – 5-О-кофеилхинная кислота, 3 – 6-гидроксилютеолин 7-О-глюкозид, 4 – 20-гидроксиэкдизон, 5 – 3,4-ди-О-кофеилхинная кислота, 6 – 3,5-ди-О-кофеилхинная кислота, 7 – 2-дезокси-20-гидроксиэкдизон, 8 – 4,5-ди-О-кофеилхинная кислота, 9 – трахелозид, 10 – раунозид В, 11 – лютеолин 7-О-(6"-О-кофеил)-глюкозид, 12 – картамозид, 13 – изоферулоил-серотонин, 14 – лютеолин, 16 – картамогенин.

Компоненты 1, 2, 5, 6 и 8 обладали близким УФ-профилем, типичным для производных кофейной кислоты [13], а характер масс-спектров указывал на присутствие фрагмента хинной кислоты ацилированного одним (1, 2) или двумя (5, 6, 8) ее остатками [4]. Учитывая хроматографическую подвижность компонентов в сравнении с веществами-референтами, указанные соединения были идентифицированы как 4-О-кофеилхинная (1), 5-О-кофеилхинная (2), 3,4-ди-О-кофеилхинная (5), 3,5-ди-О-кофеилхинная (6) и 4,5-ди-О-кофеилхинная кислоты (8).

Близким к кофеилхинным кислотам УФ-профилем обладали компоненты 12 и 16. В масс-спектре отрицательной ионизации соединения 12 присутствовали сигналы депротонированной частицы (m/z 531) и ее фрагмента, обусловленного удалением гексозильного остатка (m/z 369). В спектре положительной ионизации были отмечены сигналы частиц с m/z 247 и 219, характерных для лигнановых производных типа 7,8-дидегидроарктигенина [9]. После выделения и анализа спектров ЯМР соединение 12 было идентифицировано как картамозид (картамогенин-4-О-глюкозид), ранее выделенный из семян Rhaponticum carthamoides [9] и впервые обнаруженный у R. uniflorum. Соединение 16 было определено как агликон картамозида – картамогенин. Близким к 12 масс-спектральным профилем обладал компонент 9, молекулярная масса которого была на 18 а.е.м. больше, что характерно для производных гидроксиарктигенина [9]. Хроматографические и спектральные параметры 9 и лигнанового гликозида трахелозида (трахелогенин-4-О-глюкозид) были идентичны, что позволило впервые выявить его присутствие в R. uniflorum. Данное соединение часто встречается в семенах различных видов Compositae, в том числе и R. carthamoides [9].

Соединение 13 обладало типичным для производных изоферуловой кислоты спектром поглощением с λ_max у 292 и 314 нм, а также масс-спектральным профилем, отмеченным ранее для эфиров N-цинамоил-серотонинов [9]. После выделения и дополнительной ЯМР спектральной характеристики 13 было идентифицировано как N-транс-изоферулоил-серотонин, впервые обнаруженный в R. carthamoides [9]. Ранее в R. uniflorum данное соединение выявлено не было.

Два соединения 4 и 7 были идентифицированы как экдистероиды по характерному для данной группы соединений УФ- и масс-спектрометрическому профилю. Компоненты содержали в масс-спектрах положительной ионизации набор сигналов, отнесенных к протонированной частице и частицам аддуктов с ионами Na⁺ и K⁺, а также набор сигналов, вызванных постепенным удалением воды боковой группы и др. После сравнения с данными известных веществ 4 и 7 были идентифицированы как 20-гидроксиэкдизон и 2-дезокси-20-гидроксиэкдизон, соответственно. Оба соединения ранее были обнаружены в траве и корнях R. uniflorum [7].

Соединения 3, 10, 11 и 14 были определены как флавоноиды ввиду характерного для производных флавона типа поглощения в УФ-области спектра [13]. После анализа полученных данных с таковыми известных соединений компоненты были определены как 6-гидроксилютеолин 7-О-глюкозид (3), раунозид В (10), лютеолин 7-О-(6"-О-кофеил)-глюкозид (11) и лютеолин (14), которые ранее были выявлены в листьях и цветках R. uniflorum [4], но обнаружены в семенах этого вида впервые.

Соединению 15 соответствовала молекулярная формула C₂₉H₃₄O₁₂ по данным масс-спектрометрии и спектроскопии ЯМР ¹³С. В масс-спектре положительной ионизации присутствовали сигналы протонированного иона (m/z 575) и частиц, образованных последовательным удалением фрагмента ацетильной группы (m/z 575 → 533) и остатка гексозы (m/z 533 → 371), что так же наблюдалось в спектре отрицательной ионизации (рис. 3а, 3б). Спектр поглощения был близок к спектрам лигнановых гликозидов (рис. 3в). После гидролиза с 0.5%-ным NaOH наблюдалось образование картамозида, а гидролиз с 2 М ТФУ приводил к образованию картамогенина и D-глюкозы. Спектры ЯМР ¹Н и ¹³С были близки к таковым картамозида (картамогенин 4-О-β-D-глюкопиранозид) за исключением присутствия дополнительных сигналов ацетильной группы в спектре ¹Н (δ_Н 1.61) и ¹³С (δ_С 19.7, 170.5) м.д. Сдвиг в слабое поле сигналов Н-6" (δ_Н 3.40, 3.58 → 4.25, 4.50) и С-6" (δ_Н 60.9 → 64.8) в сравнении с картамозидом указывал на присутствие заместителя по положению С-6" глюкопиранозы, которым оказалась ацетильная группа, на что указывали корреляции в спектре гетероядерной многосвязной корреляционной спектроскопии HMBC (δ_Н/δ_С 3.40, 3.58/170.5). Таким образом, соединение 15 представляло собой картамогенин 4-О-(6"-О-ацетил)-β-D-глюкопиранозид или 6"-О-ацетил-картамозид (рис. 3г), являющийся новым природным соединением.

Рис. 3.

Масс-спектры (а – положительная ионизация, б – отрицательная ионизация; Ac – ацетил, Glc – глюкоза), спектр поглощения (в) и структура (г) 6"-О-ацетил-картамозида (соединение 15).

Сведения о количественном распределении отдельных соединений в частях семени R. uniflorum указывали на то, что для эндосперма характерно накопление кофеилхинных кислот (8.89 мг/г), лигнанов (34.85 мг/г) и экдистероидов (27.20 мг/г), в то время как в кожуре наблюдалось аккумуляция флавоноидов (9.78 мг/г) и производных серотонина (2.03 мг/г) (табл. 3). Ранее сходный характер распределения был выявлен в семенах R. carthamoides, для которых наибольшее содержание лигнанов трахелозида и картамозида было установлено в эндосперме, а ферулоил-серотонина – в кожуре семян [14].

Проведенные исследования биологической активности индивидуальных соединений из семян R. uniflorum показали, что наиболее эффективными ингибиторами панкреатической α-амилазы человека были раунозид В (IC₅₀ 10.50 мкг/мл) и лютеолин 7-О-(6"-О-кофеил)-глюкозид (IC₅₀ 14.83 мкг/мл), активность которых была выше таковой акарбозы (табл. 3). Оба флавоноида содержали свободную орто-дигидрокси-группировку в кольце В агликона и кофеильном фрагменте, что является структурным фактором, повышающим ингибиторное влияние соединений на α-амилазу [15]. Среди кофеилхинных кислот и лигнанов наибольшая эффективность была выявлена для 4,5-ди-О-кофеилхинной кислоты (IC₅₀ 26.84 мкг/мл) и картамогенина (IC₅₀ 30.32 мкг/мл).

Активность изоферулоил-серотонина была близка к таковой акарбозы, а экдистероиды и трахелозид слабо ингибировали активность α-амилазы поджелудочной железы человека (IC₅₀ > 500 мкг/мл). Применение ВЭЖХ-микрофракционирования с последующим анализом активности полученных элюатов показало, что наибольший вклад в суммарную активность отвара семян R. uniflorum вносило присутствие картамозида, изоферулоил-серотонина, 3,5-ди-О-кофеилхинной кислоты, картамогенина и 5-О-кофеилхинной кислоты (до 86% от суммарной активности пробы), что обусловлено высоким содержанием указанных соединений в препарате (рис. 1б).

С использованием теста на летальность с Artemia salina была определена токсичность выделенных соединений, составившая >1000 мкг/мл для всех веществ, что позволило предположить относительную безопасность при их применении.

Научные сведения, касающиеся эффективности ингибирования α-амилазы фенольными соединениями растений, в большей своей части получены в результате использования ферментов бактериального (Bacillus licheniformis, B. amyloliquefaciens), грибного (Aspergillus oryzae) происхождения, а также α-амилазы поджелудочной железы свиньи и слюнной железы человека [2]. Эксперименты, проведенные с применением α-амилазы поджелудочной железы человека немногочисленны, однако известно, что бисдеметоксикуркумин [16], дегидродиэвгенол B [17] и ругозин D [8] характеризуются наибольшей эффективностью ингибирования фермента со значениями IC₅₀ 7.70, 9.68 и 30.84 мкг/мл соответственно. Однако, следует отметить, что токсичность куркуминоидов, производных эвгенола и эллаготаннинов группы ругозина, определенная методом с Artemia salina, составляла <1000 [18], <1 [19] и <100 мкг/мл [20] соответственно, что характеризовало эти соединения как более токсичные в сравнении с метаболитами семян R. uniflorum.

Проведенные исследования впервые показали, что водный отвар семян R. uniflorum является эффективным ингибитором панкреатической α-амилазы человека, что обусловлено высоким содержанием фенольных соединений различных структурных типов. Наибольшим ингибиторным действием обладали раунозид В, лютеолин 7-О-(6"-О-кофеил)-глюкозид, лютеолин, 4,5-ди-О-кофеилхинная кислота, 6-гидроксилютеолин 7-О-глюкозид и картамогенин, активность которых установлена впервые. Эти соединения могут быть использованы для создания новых потенциальных антидиабетических средств, получаемых из растений.

Исследование выполнено при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации в рамках научного проекта № 121030100227-7.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.