Прикладная биохимия и микробиология, 2023, T. 59, № 1, стр. 65-73

МЕТОДИКА

Объекты исследования. В работе использовали этиолированные проростки гороха (Pisum sativum L.) сорта Аксайский усатый 3, выращенные в темноте при температуре 21°С в кюветах на фильтровальной бумаге, смоченной кипяченной водопроводной водой. Исходным материалом служили 2-суточные проростки, выращенные в тех же условиях. Средние размеры корней у исходных и исследуемых в период 0–60 мин от начала эксперимента составляли 30–35 мм, по окончании эксперимента (24 ч) – 45–50 мм. При проведении экспериментов 2-суточные проростки помещали на фильтровальную бумагу, которую смачивали растворами 10^–11 М ИУК или 10^–9 М БАП, а на корни проростков наносили по 1 мл инокулята (титр 10⁶ кл./мл) бактерий Rhizobium leguminosarum bv. viceae штамм 1026. Штамм был получен из Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии (Санкт-Петербург, Россия). В предварительных экспериментах были подобраны концентрации фитогормонов ИУК и БАП [23, 24]. Критерием выбора концентрации было положительное влияние на рост корня, а в случае с БАП, также и стимуляция образования клубеньков. Подбор титра бактерий, не вызывающего существенных изменений роста корней, и способ нанесения инокулята был отработан ранее [24]. Инокулированные ризобиями контрольные растения росли на воде. Инокулят готовили смывом бактерий с твердой агаризованной питательной среды. Титр в полученной суспензии определяли, измеряя плотность суспензии при 675 нм на планшетном спектрофотометре “Immunochem-2100” (“High Technology Inc.”, США).

Из участка корня, расположенного на расстоянии 5–15 мм от кончика корня с помощи бритвы вырезали отрезки корней для исследований в начале экспозиции (0–60 мин) и через 24 ч.

Определение активности полифенолоксидазы. Две фракции ПФО “растворимую” (цитоплазматическая) и связанную с клеточными стенками, выделяли как описано в работе [25]. Фиксированные жидким азотом отрезки корня гомогенизировали в 0.01 М фосфатном буфере (pH 6.0), гомогенат центрифугировали при 1800 g 20 мин, отделяли супернатант, содержащий ПФО “растворимой” фракции. Из осадка 1 М NaCl экстрагировали ионно-связанную ПФО, а затем обработкой 0.25%-ным раствором целлюлазы и пектиназы (“Onozuka”, Япония) ковалентно связанную ПФО. Экстракты, содержащие ионно- и ковалентно связанные с клеточными стенками ПФО, из-за низких показателей во фракции 2 (на 2 порядка), объединяли в общую фракцию “связанных с клеточными стенками”.

Активность ПФО определяли спектрофотометрически по изменению оптической плотности (ОП) при 420 нм за 1 мин в реакционной смеси с субстратом для окисления – пирокатехином [26]. В состав реакционной смеси входили: 2 мл 0.05 М фосфатного буфера, рН 7.0, 0.5 мл белковой вытяжки и 0.5 мл 0.05 М раствора пирокатехина. Активность ферментов выражали в условных единицах в расчете на 1 г сырой ткани.

Определение активности пероксидазы. Выделение разных форм ПО – растворимой, ионно˗ и ковалентно связанной с клеточными стенками и определение их активности осуществляли по методикам, описанной в работе [23]. В соответствии с описанным методом после гомогенизации растительного материала в фосфатном буфере (рН 6.2), центрифугированием отделяли супернатант, содержащий растворимые формы пероксидаз. Затем из промытого раствором 2%-ного Тритона Х_-100 нерастворимого осадка экстрагировали 1 М NaCl ионно связанные, а после обработки смесью 0.25%-ных растворов пектиназы и целлюлазы (соотношение 1 : 1) – ковалентно связанные формы пероксидаз. На каждом этапе экстракции центрифугировали по 15 мин при 5000 g и 4°С.

Для определения оксидазной (прооксидантной) активности фермента в качестве субстрата использовали ИУК, пероксидазной (антиоксидантной) – о˗дианизидин. Активность ПО (усл. ед./г сырой массы) определяли по начальной скорости окисления о˗дианизидина пероксидом водорода в 0.1 М натрий˗фосфатном буфере, рН 7.0. ИУКО (мкг/мин г сырой массы) – по убыли ИУК в реакционной смеси.

Определение содержания перекиси водорода. Содержание Н₂О₂ в гомогенате отрезков корней определяли спектрофотометрически (СФ-Hitachi U-1100, “Hitachi”, Япония) при 560 нм с использованием индикатора ксиленового оранжевого [15]. Количество Н₂О₂ рассчитывали по калибровочному графику, построенному для разных концентраций Н₂О₂, и выражали в мкМ/г сырой массы отрезка корня.

Определение содержания NO. Для изучения динамики генерации оксида азота в корнях проростков гороха определяли интенсивность флуоресценции NO в течение 1 ч с интервалом в 10 мин на соответствующих варианту опыта средах. Для этого отрезки корней (3 шт.), взятые у проростков на расстоянии 5–15 мм от кончика корня, окрашивали в среде, содержащей 10 мкМ DAF-2DA (5,6-диаминофлуоресцеиндиацетат, “Sigma-Aldrich”, США) в 10 мМ Tрис-HCl буфере, pH 7.4. Окрашивание проводили в течение 20 мин на качалке и при температуре 26°С. Из окрашенных отрезков получали поперечные срезы (не менее 10) толщиной 100–150 мкм и анализировали на флуоресцентном микроскопе AxioObserver Z1 (“Zeiss”, Германия) с цифровой монохромной камерой Axio CamMRm3 и пакетом программного обеспечения для захвата и анализа изображений “AxioVision Rel.4.6”, с использованием блока фильтров № 10 с длиной волны возбуждения 450-490 нм, эмиссией 515–565 нм. Интенсивность флуоресцентного свечения выражали в относительных единицах (отн. ед.). Кривая изменения уровня NO строилась относительно показателей флуоресценции в начале эксперимента (% от 0 мин).

Получение экстрактов фенольных соединений (ФС). Экстракты ФС получали из растительного материала, зафиксированного 96%-ным этанолом и затем гомогенизированного. Выделение ФС проводили по ранее разработанной схеме [27, 28]. ФС экстрагировали 80%-ным этанолом (50 мл на 1 г растительного материала, 3–4-кратно), а после его удаления на роторном испарителе, водный остаток подкисляли 2 н HCl до рН 3–4 и экстрагировали этилацетатом растворимые липофильные ФС (фракция I), а затем н-бутанолом в соотношении 1 : 1 (об.) 3–4-кратно водорастворимые ФС (фракция II). Из нерастворимого остатка (клеточные стенки) после 1-часового гидролиза 2 н HCl на кипящей водяной бане экстрагировали “нерастворимые” ФС (фракция III) этилацетатом в соотношении 1 : 1 (об.) 3–4-кратно. Полученные экстракты упаривали в условиях затемнения в вакууме досуха, сухие остатки растворяли в небольшом объеме 95%-ного этанола для определения в них общего содержания ФС и флавоноидов.

Определение содержания фенольных соединений. Содержание ФС определяли с реактивом Фолина-Дениса по стандартной методике [29]. Количества ФС рассчитывали по калибровочному графику, построенному для кемпферола, и выражали в мкг/г сырой массы отрезка корня.

Определение содержания флавоноидных соединений. Содержание флавоноидов в экстрактах, содержащих растворимые ФС, определяли по методу, описанному в работе [30]. Оптическую плотность определяли на спектрофотометре Specord S-100 (“Karl Zeiss”, Германия) при 510 нм против контроля: 4.5 мл воды + 0.5 этанола. Содержание флавоноидов рассчитывали по калибровоному графику для катехина и выражали как эквиваленты катехина, в мкг/г сырой массы отрезка корня.

Статистическая обработка результатов. Для статистической обработки полученных результатов использовали Microsoft Excell. На рисунках и в таблицах приведены средние значения и стандартные отклонения для них, которые получены из трех независимых экспериментов. Значимость различий между средними значениями определяли, используя t˗критерий Стьюдента при уровне Р < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В течение 1 ч от момента помещения проростков в растворы фитогормонов и одновременной инокуляции ризобиями в зоне адгезии наблюдали ранние ответы на действие ИУК и ЦК по изменению уровня NO. Через 24 ч экспозиции в указанных условиях роста проростков в отрезках их корней определяли содержание ФС в трех фракциях экстрагируемых этилацетатом, н-бутанолом, и связанных с клеточными стенками, содержание флавоноидов, активность растворимых и связанных с клеточными стенками ПФО.

На рис. 1 представлено сравнение динамики содержания NO в клетках зоны адгезии у корней проростков гороха в течение 1 ч от начала действия на них ризобий (контроль) и при совместном действии бактерий и экзогенных ИУК и БАП. Отмечена разница в характере ответной реакции клеток исследуемого участка корней при одновременном действии на них ризобий и экзогенных ИУК и БАП (рис. 1). ИУК дважды вызывала повышение уровня NO, при этом, 1 повышение происходило ранее, чем при действии ризобий без участия этого фитогормона – в период 10–30 мин, второе – на 60-й мин (рис. 1). В присутствии БАП уровень NO на протяжении того же времени экспозиции был заметно ниже, не только по сравнению с ИУК, но и с контролем. При этом слабое повышение уровня NO при действии БАП имело место, причем в тот же период, как и у контрольных растений – начиная с 30 мин (рис. 1). Обнаруженные существенные различия в динамике NO при действии на корни БАП и ИУК (рис. 1) свидетельствовали о различном влиянии этих фитогормонов на активность NO-синтазной системы в начальный период взаимодействия симбионтов.

Рис. 1.

Влияние экзогенных 10^–9 М БАП и 10^–11 М ИУК на динамику интенсивности флуоресценции (% от значения в 0 точке) оксида азота в течение 1 ч после инокуляции ризобиями: 1 – рост инокулированных проростков без фитогормонов (контроль); 2, 3 – рост инокулированных проростков на растворах БАП и ИУК соответственно.

Показателями ранней реакции растения на воздействия бактерий также служат данные по изменению содержания АФК, и, в частности, содержания пероксида водорода [14, 15]. Важную роль в регуляции уровня пероксида в растительных клетках отводят пероксидазам, поскольку вследствие полифункциональности эти ферменты могут участвовать в реакциях оксигеназного, пероксидазного и оксидазного окисления в клетках [7]. На рис. 2 приведены отношения показателей содержаний H₂O₂ и активности цитоплазматичекой ПО в исследуемой зоне в течение 1 ч экспозиции при действии экзогенных фитогормонов по отношению к тем же показателям у растений в контроле. Указанные соотношения показателей позволяют зафиксировать реакцию проростков на одновременное действие на них ризобий и экзогенных БАП и ИУК по сравнению с проростками, на которые воздействовали только эти бактерии. При действии ИУК и БАП выявлено 2 периода повышения содержания Н₂О₂, совпадающих по времени (рис. 2а). Эти повышения уровня пероксида можно оценивать как свидетельство проявления защитных реакций клеток зоны адгезии. При действии обоих фитогормонов активность ПО оказалась максимальной в те периоды, когда в ответ на действие фитогормонов максимально возрастало содержание пероксида (рис. 2б). При этом более высокий уровень Н₂О₂, который оказался при действии БАП, а не при действии ИУК (рис. 2а), скорее всего, обусловлен менее активной в клетках этого варианта “растворимой” ПО (рис. 2б).

Рис. 2.

Влияние экзогенных 10^–11 М ИУК (1) и 10^–9 М БАП (2) на динамику изменения содержания H₂O₂ (а, % к контролю) и активность “растворимой” ПО (б, % к контролю) в течение 1 ч после инокуляции ризобиями.

Сравнение влияния БАП и ИУК на динамику содержания NO и Н₂О₂ (рис. 1, 2а) позволяет констатировать различия в характере, интенсивности и времени проявления защитных ответов с участием этих метаболитов в зоне адгезии в течение 1 ч после инокуляции корней ризобиями. При этом обращает на себя внимание, что БАП, по сравнению с ИУК, очевидно, имел выраженный ингибирующий эффект на NO-синтазную систему и в большей степени вызывал повышение уровня пероксида водорода в клетках исследуемой зоны корня.

Через 24 ч от начала инокуляции и помещения корней в растворы с фитогормонами в участке корня на расстоянии 5–15 мм от его апекса было прослежено влияние БАП и ИУК на содержание ФС, активность ПО и ПФО. Данный участок в описанных выше условиях роста корня (см. Методику) сформировался за 24 ч экспозиции с фитогормонами за счет клеток, перешедших из зоны меристемы в зону растяжения. Первоначально исследуемый участок корня (в течение первого экспозиции) за 24 ч удалился от апекса в зону, где наступил следующий этап взаимодействия с ризобиями – начало проникновения последних в корневые волоски [23].

Показано, что активность “растворимых” и связанных с клеточными стенками антиоксидантной ПО через 24 ч выше, чем через 1 ч после начала эксперимента в 1.5–2.0 раза (в зависимости от варианта выращивания). Активность прооксидантной ПО возрастала в меньшей степени, либо не изменялись (ковалентно-связанные с клеточными стенками в контроле и в присутствии БАП). Отношения активности ферментов при действии фитогормонов к тем же показателям в контроле (табл. 1) показли разницу в действии ИУК и БАП, которую оценивали по степени проявлении активности про- и антиоксидантной ПО. Рост на растворе ИУК приводил к заметному возрастанию активности фермента ИУКО, который способен окислять данный фитогормон [6], и, вероятно, в наибольшей степени во фракции связанных с клеточными стенками (табл. 1). Под влиянием же БАП существенно снижалась активность ИУКО в цитоплазме и ПО в клеточной стенке (табл. 1).

Действие фитогормонов в клетках исследуемой зоны вызывало изменение активности другого окислительного фермента – ПФО (табл. 1). Активность ПФО в цитоплазматической фракции у контрольных растений составляла 0.155 ± ± 0.02 отн. ед./г сырой массы отрезка, а в клеточных стенках она оказалась выше в 1.9 раза. Как следует из данных табл. 1, влияние ИУК в большей мере, чем влияние БАП, приводило к повышению активности этого фермента, и особенно во фракции, связанной с клеточными стенками. В клеточных стенках изменения активностей ИУКО и ПФО были близки как при действии ИУК, так и при действии БАП (табл. 1). В цитоплазме этого не наблюдалось.

Как ответную реакцию на действие неблагоприятных факторов на растение рассматривают повышение содержания ФС в растительных клетках [31]. В настоящей работе представлены данные по содержанию ФС (рис. 3), и в том числе флавоноидов (рис. 4) в исследуемой зоне, полученные через 24 ч после инокуляции. Повышение уровня NO и Н₂О₂ в начальный период бобово-ризобиального взаимодействия может положительно влиять на экспрессию гена pal, кодирующего фенилаланинаммиак-лиазу – ключевого фермента фенилпропаноидного пути биосинтеза ФС [17, 18], и генов chs и chi, кодируюших, соответственно, халкон-синтазу и халкон-изомеразу [17], участвующих в синтезе флавоноидов [32]. По данным литературы, экспрессия обсуждаемых генов при инокуляции обнаружена через 3 ч от ее начала, а накопление ФС фиксировали не ранее 10–13 ч [15, 16].

Рис. 3.

Влияние экзогенных БАП и ИУК на содержание ФС (мкг/г сырой массы), экстрагируемых этилацетатом (I), н-бутанолом (II) и высвобождаемых из клеточных стенок (III), в зоне адгезии через 24 ч после инокуляции Rhizobium: рост инокулированных Rhizobium проростков на воде (1, контроль), на 10^–9 М БАП (2), 10^–11 М ИУК (3).

Рис. 4.

Влияние экзогенных БАП и ИУК на содержание флавоноидов (мкг/г сырой массы) во фракции экстрагируемых этилацетатом (I) и н-бутанолом (II), в зоне адгезии через 24 ч после инокуляции Rhizobium, 1, 2, 3 –как на рис. 3.

Флавоноиды являются компонентами растительных клеток, которые наиболее значимы в регуляции уровня фитогормонов в точках формирования примордиев клубеньков [3]. Синтез флавоноидов индуцируется в области проникновения ризобий в корнях бобовых растений под влиянием ризобиальных Nod-факторов, а в зоне адгезии флавоноиды секретируются во внешнюю среду в составе корневых эксссудатов. В работе [2] показано, что в зоне образования примордиев клубеньков после инокуляции ризобиями все изменения в аккумуляции и локализации ИУК происходят при участии флавоноидов и ПО.

Суммарная концентрация ФС (по данным рис. 3) в трех полученных фракциях через 24 ч экспозиции составляла в расчете на г сырой массы зоны в корнях в контроле – 345.5 мкг, а при росте на растворах ИУК и БАП, соответственно, 392.4 и 321.8 мкг. Максимальное содержание ФС в исследуемой зоне наблюдали при действии ИУК, минимальное – при действии БАП. При этом роль ФС исследуемых фракций в метаболизме клеток, несомненно, различалась. Как было показано ранее [26] ФС, входящие в состав фракции, экстрагируемой этилацетатом, представляют собой липофильные ФС с достаточно высокой биологической активностью.

ФС, экстрагируемые н-бутанолом, это хорошо растворимые в воде компоненты, вероятно, локализующиеся в вакуолях [33], их биологическая активность низка [28]. Концентрацию ФС данной фракции в клетках зоны адгезии повышали БАП и, еще более – ИУК. Вероятно, это связано с усилением растяжения клеток [23], сопряженным с усилением вакуолизации в исследуемой зоне корня. На это указывает аналогичная тенденция прироста за 24 ч экспозиции корней в тех же вариантах выращивания.

ФС третьей фракции играли важную роль в укреплении клеточных стенок [31]. В образовании связей между ФС и компонентами клеточных стенок участвуют ПО [34]. Очевидно, именно более низкая активность этих ферментов в варианте с БАП (табл. 1) может служить объяснением наиболее низкого, по сравнению с контролем и вариантом с ИУК количества ФС, высвобождаемых из клеточных стенок (рис. 3). Обнаруживаемое при этом повышение активности ПФО в цитоплазме и клеточных стенках в варианте с ИУК (табл. 1), вероятно, связано с окислением данного фитогормона [6].

Состав биологически активной группы ФС, входящих во фракцию экстрагируемых этилацетатом, может зависеть от внешних обстоятельств [35]. Так, в тканях зоны проникновения под влияние БАП и ИУК может повышаться содержание салициловой кислоты [23], отнесенной к негативным регуляторам нодуляции [36].

Важными компонентами для процессов нодуляции при бобово-ризобиальном симбиозе являются некоторые флавоноиды. Их роль в зоне проникновения ризобий – инициация образования примордиев клубеньков, а в зоне адгезии – как индуктора экспрессии ризобиальных nod-генов, в основном в связи с их активностью в составе корневых экссудатов [3]. Оба фитогормона в участке корня, относящегося к зоне адгезии, вызывали снижение общего содержания флавоноидов в составе фракции, экстрагируемой этилацетатом (рис. 4). При этом экзогенная ИУК способствовала повышению концентрации флавоноидов в составе бутанольной фракции, а БАП – вызывала небольшое снижение их количества. Однако возникшие при действии фитогормонов изменения в содержании данной фракции флавоноидов на общей тенденции падения концентрации флавоноидов в тканях исследуемого участка корня не отразились. Причины практически одинакового снижения содержания флавоноидов в исследуемой зоне при действии БАП и ИУК не ясны и требуют дальнейших исследований.

Анализ приведенных выше показателей по активности ПО и уровня Н₂О₂ в клетках зоны адгезии, позволяет оценить защитную реакцию клеток исследуемой зоны на действие фитогормонов в течение 1 и 24 ч. Приведенные результаты работы свидетельствуют о влиянии экзогенных ЦК на метаболизм клеток зоны адгезии в разные периоды роста корня после его инокуляции бактериями Rhizobium. Проанализированные показатели содержания NO, H₂O₂ и активности ПО в ранний период (до 1 ч) взаимодействия симбионтов выявили защитные реакции в клетках исследуемой зоны при действии на них ИУК. Между растениями в контроле и под воздействием БАП и ИУК наиболее существенными были различия по характеру изменения уровня NO (рис. 1). Они показали роль ИУК в более раннем активировании NO-синтазной системы, по сравнению с растениями контроля, на которые действовали только ризобии, так и то, что при действии экзогенных ЦК этот процесс может ингибироваться.

Ответные реакции на действие ЦК и ИУК в клетках исследуемой зоны имели различия и через 24 ч от начала эксперимента, когда в соседнем с зоной адгезии участке корня начиналось проникновение ризобий в корневые волоски [20, 37]. В этот период в зоне адгезии фиксируется существенное усиление активности ПО. При этом активности ИУКО и ПФО оказались заметно выше у растений, на которые действовала экзогенная ИУК. От вида фитогормона зависело содержание ФС в трех исследуемых фракциях. ИУК вызывала повышение их общего содержания за счет входящих в состав ФС веществ, экстрагируемых бутанолом. Под влиянием БАП обнаружено снижение общего содержания ФС. Оно происходило в наибольшей степени за счет биологически активной фракции “растворимых” ФС, и в меньшей степени за счет ФС, связанных с клеточными стенками. Содержание “растворимых” ФС, по сравнению с контролем, возрастало, но в меньшей мере, чем при действии ИУК. Важной особенностью обоих экзогенно действующих фитогормонов оказалось существенное снижение общего содержания флавоноидов в исследуемой нами зоне. Данное явление требует дальнейших более детальных исследований изменений в их составе. Известно, что определенные виды флавоноидов могут регулировать уровень ИУК в области формирования клубеньков у бобовых растений разных видов [38].

Приведенные результаты показали, что более выраженные защитные реакции при действии ИУК в зоне адгезии имели негативные последствия для нодуляционных процессов. Данное высказывание подтверждают данные, описанные в работе [23], где приводилось исследование экзогенного действия 10^–9 М БАП и 10^–11 М ИУК на нодуляцию корней растений гороха. Было установлено небольшое стимулирование нодуляции при действии ЦК и полное ингибирование при действии ИУК. Это дает основание предположить, что подобное ингибирование нодуляции у бобовых культур могут происходить при внесении в их ризосферу микробных препаратов, включающих бактерии с повышенной продуктивностью ИУК, что необходимо учитывать на практике.

Работа выполнена в рамках проекта № госрегистрации 122041100050-6 при использовании оборудования Центра коллективного пользования (ЦКП) “Биоаналитика” Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН (Иркутск, Россия).