Прикладная биохимия и микробиология, 2022, T. 58, № 6, стр. 551-567

КОНВЕРСИЯ 4-ХЛОРФЕНОЛА КАК ЧАСТНЫЙ СЛУЧАЙ ПУТИ ДЕГРАДАЦИИ пара-ЗАМЕЩЕННЫХ ФЕНОЛОВ

Монохлорфенолы представляют собой простейшую форму хлорированных фенолов и содержат только один атом хлор заместителя в бензойном кольце. 4-Хлорфенол (4-ХФ) широко используется в качестве антисептика для домашнего, больничного и сельскохозяйственного применения. Кроме того он может поступать в окружающую среду и естественным путем в результате деятельности бактерий, грибов и насекомых [2, 3].

В аэробных условиях успешная минерализация монозамещенных в мета и орто положениях хлорфенолов бактериями обычно осуществляется путем их первоначального окисления до 3- или 4-хлоркатехолов с последующим раскрытием ароматического кольца в орто-положении. Хлор в результате спонтанно удаляется, а углеродный скелет превращается в продукты, которые ассимилируются в центральном метаболизме клетки. Иначе обстоит дело, с конверсией монохлорфенола, замещенного в пара-положении [3, 22, 23].

Монооксигенирование фенолов, имеющих электроноакцепторный п-заместитель, такой как хлор, приводит к одновременному гидроксилированию и дегалогенированию. При этом в результате проявления монооксигеназной активности сначала образуется промежуточный хинон, который затем восстанавливается. В зависимости от того, что служит субстратом для диоксигеназ, расщепляющих ароматическое кольцо ГХ или ГГХ, различают два альтернативных пути. Преимущественно у грамположительных бактерий, таких как Bacillus spp., Rhodococcus spp. и Arthrobacter spp., деградация первоначального субстрата происходит через образование ГГХ [17–21]. Монооксигеназы, ответственные за эту трансформацию, принадлежат к семейству двухкомпонентных флавинзависимых монооксигеназ [12, 18, 19, 24], так называемое TC-FDM-семейство [25]. Бензойное кольцо ГГХ затем расщепляется с образованием МА и далее β-кетоадипата. Второй путь встречается в основном у грамотрицательных бактерий, например у штаммов рода Pseudomonas, и инициируется однокомпонентной монооксигеназой [13–16], которая, преобразует пара-замещенный фенол в ГХ. Бензойное кольцо последнего расщепляется с образованием γ-гидроксимуконового полуальдегида, который трансформируется до малеацетата, а затем до β-кетоадипата [16, 26].

Поскольку многие бактериальные деструкторы способны к расщеплению нескольких фенольных субстратов, имеющих электроноакцепторный заместитель, рассмотрим деградацию пара-замещенных фенолов сначала на примере пара-нитрофенола (4-НФ), биохимический и генетический аспекты которого достаточно хорошо известны. Аэробная конверсия 4-НФ может осуществляться бактериями как через ГХ, так и ГГХ, причем последний путь имеет два варианта (рис. 3).

Рис. 3.

Альтернативные пути деградации 4-НФ с ферментами, ответственными за стадию инициации у штаммов Pseudomonas sp. WBC-3 (а); Arthrobacter sp. JS443 (б); R. opacus SAO101 (в). I ‒ 4-нитрофенол, II – пара-бензохинон, III – гидрохинон, VI – 2-гидрокси-1,4-бензохинон; V ‒ 4-нитрокатехол, VI – гидроксигидрохинон, VII ‒ β-кетоадипат, TCA ‒ цикл трикарбоновых кислот [12].

Как видно из рис. 3, в результате проявления активности однокомпонентной 4-нитрофенол-4-монооксигеназы (КФ 1.14.13.167) PnpA штамма Pseudomonas sp. WBC-3 происходит трансформация 4-НФ до ПБХ [13]. Затем редуктаза PnpB (КФ 1.6.5.6) восстанавливает ПБХ до ГХ, бензойное кольцо которого расщепляется в следующей реакции. Классический ГХ-путь, катализируемый однокомпонентными гидроксилазами, описан также для штаммов Moraxella sp. [27], Pseudomonas sp. NyZ402 [28] и Pseudomonas sp. 1-7 [14].

Две грамположительные культуры Arthrobacter sp. JS443 [12] и Rhodococcus opacus SAO101 [18] метаболизируют 4-НФ до ГГХ под действием двухкомпонентных монооксигеназ NpdA1A2 (КФ 1.14.13.167) и NpcAB (КФ 1.14.13.29). После расщепления кольца и образования β-кетоадипата метаболиты обоих альтернативных путей поступают в ЦТК.

Интересно, что для штамма Pseudomonas sp. 1-7 был выявлен побочный ГГХ-путь через 4-нитрокатехол (4-НК), причем в кластере генов деградации 4-НФ pdcABDEFG не было обнаружено гена специфичной двухкомпонентной монооксигеназы, катализирующей образование ГГХ. Вероятно, однокомпонентная монооксигеназа PdcA способна катализировать трансформации 4-НФ как до ПБХ, так и до 4-НК [14]. При исследовании другого штамма Pseudomonas sp. WBC-3 обнаружили, что очищенная однокомпонентная 4-нитрофенол-4-монооксигеназа (PnpA) трансформировала 4-НК в ГГХ, что является первым случаем такого катализа для однокомпонентных монооксигеназ. Штамм WBC-3 фактически не мог расти на 4-НК, однако был способен полностью разлагать как 4-НФ, так и 4-НК, когда 4-НФ использовался в качестве индуктора [15]. Гены деградации 4-НФ pnpABCDEFG штамма WBC-3 показали высокое сходство с кластером pdcABCDEFG штамма 1-7, что предполагает одинаковый механизм проявления активности однокомпонентных монооксигеназ этих двух культур.

Генетические детерминанты деградации 4-НФ были идентифицированы для ГХ- и ГГХ-путей в нескольких географически отдаленных изолятах, включая R. opacus SAO101 [18], Arthrobacter sp. JS443 [12] и Pseudomonas sp. штаммы WBC-3, 1-7 и NyZ402 [13, 15, 28]. С одной стороны, последовательности генов являются консервативными для каждого пути, поскольку были обнаружены высокие уровни их сходства между кластерами деградации из штаммов SAO101 и JS443, а также между штаммами WBC-3, 1-7 и NyZ402. С другой стороны, как последовательности генов, так и их организация значительно различались у ГГХ- и ГХ-путей, что подразумевало их различное происхождение [15, 28].

4-ХФ по пути гидрохинона способны метаболизировать несколько штаммов-деструкторов, принадлежащих к группе актинобактерий, в том числе: Arthrobacter sp. JS443 [12], Arthrobacter ureafaciens CPR706 [29], Arthrobacter chlorophenolicus A6 [8], Nocardioides sp. NSP41 [30]. Еще одна актинобактерия Arthrobacter sp. IF1 осуществляет конверсию другого фенола, галогенированного в пара-положении ‒ 4-фторфенола (4-ФФ) (рис. 4) [31].

Рис. 4.

Пути конверсии фенолов, галогенированных в пара-положении у бактерий [8, 13, 27, 29, 31]: I – пара-замещенный галогенфенол, II – пара-бензохинон, III – гидрохинон, IV – пара-замещенный катехол, V ‒замещенный в 5-м положении гидроксигидрохинон, VI – 2-гидрокси-1,4-бензохинон; VII – гидроксигидрохинон, VIII – малеилацетат, IX – β-кетоадипат, X – гидроксимуконовый полуальдегид. R ‒ электроноакцепторный заместитель.

Установлено, что конверсия соответствующих п-галогенфенолов актинобактериями Nocardioides sp. NSP41, A. ureafaciens CPR706, A. chlorophenolicus A6 и Arthrobacter sp. IF1 идет через ГХ. У первого штамма дальнейший метаболизм не описан, а по культуре CPR706 имеются данные, основанные на анализе ферментативной активности. Эксперименты с неочищенными 4-ХФ-индуцированными клеточными экстрактами показали отсутствие 4-хлоркатехол- или катехолдиоксигеназной активностей. В то же время, гидрохинон трансформировался в промежуточное соединение с УФ-спектром, аналогичным 4-гидроксимуконовому полуальдегиду [29]. В данном случае, несмотря на то, что для грамположительных бактерий такой путь нехарактерен, деградация 4-ХФ у штамма CPR706 идет через гидрохинон с последующим расщеплением его ароматического кольца (рис. 4).

У штаммов A. chlorophenolicus A6 и Arthrobacter sp. IF1 ГХ гидроксилируется до ГГХ [31]. Хлоркатехольный путь был исключен для этих культур экспериментами с бесклеточными экстрактами, выращенных на 4-ХФ и 4-ФФ бактерий соответственно, которые не выявили активности катехол-1,2-диоксигеназы. Присутствия 4-хлоркатехолдиоксигеназы (для штамма A6), катехол-2,3-диоксигеназы и 4-фторкатехолдиоксигеназы (для штамма IF1) также не было обнаружено. Следовательно, у штаммов A6 и IF1 не реализуется классический метаболизм замещенного катехола путем его орто-расщепления. Для штамма IF1 также была исключена возможность мета-расщепления 4-фторкатехола [8, 31].

При спектрофотометрическом контроле реакций из клеточных экстрактов культур A6 и IF1, индуцированных соответствующими п-галогенфенолами, типичный для ГГХ пик при 287 нм замещался пиком при 245 нм, который характерен для МА, что указывает на участие ГГХ-диоксигеназы, которая превращает ГГХ через МА в β-кетоадипат (рис. 4) [8, 31].

В эксперименте с 2,2'-дипиридилом, ингибитором диоксигеназ, расщепляющих ароматическое кольцо [32], подтвердилось, что именно ГГХ является субстратом для раскрытия кольца при разложении 4-ХФ у штамма A6. Растущая на 4-ХФ культура через несколько минут после добавления 2,2'-дипиридила меняла цвет и, в конце концов, становилась темно-красной, что указывало на накопление ГГХ в условиях хелатирования железа, при которых ингибируется фермент, расщепляющий ароматическое кольцо [8]. В то же время клетки культуры IF1, выращенные на ГГХ, показали полную конверсию этого соединения, как в присутствии, так и в отсутствие 2,2'-дипиридила, следовательно, предполагаемая ГГХ-оксигеназа не нуждалась в активных ионах железа, поэтому дальнейшее окисление этого соединения не ингибировалось хелатообразователем [31].

По-видимому, конверсия п-галогенфенолов у штаммов A6 и IF1 идет по пути ГГХ, поскольку именно последний является субстратом для диоксигеназ, расщепляющих ароматическое кольцо (рис. 4) [8, 31].

Необходимо отметить, что из бесклеточных экстрактов штамма A6, выращенных на сукцинате, удаление ГГХ не происходило. Тогда как в бесклеточных экстрактах штамма IF1, выращенного на глюкозе, наблюдалось лишь падение активности ГГХ-диоксигеназы (0.156 ед./мг) по сравнению с 4-ФФ-индуцированными бесклеточными экстрактами (0.195 ед./мг). Таким образом, только у штамма A6 наблюдалась явная индукция конверсии ГГХ, когда 4-ХФ являлся субстратом для роста вместо альтернативного субстрата [8, 31].

Для культуры A6 были идентифицированы еще два потенциальных метаболита конверсии 4-ХФ, а именно: 4-хлоркатехол (4-ХК) и 5-хлоргидроксигидрохинон (5-ХГГХ). Вероятно, по аналогии с 4‑НК, они являются метаболитами альтернативной ветви пути (рис. 3, 4). Хотя A. chlorophenolicus A6 разлагает 4-ХК приблизительно в два раза медленнее, чем гидрохинон, все же альтернативный путь значительно способствует деградации 4-ХФ [8]. Интересно, что продуктами действия монооксигеназы NpdA2 штамма JS443 на 4-хлоркатехол, когда он использовался в качестве субстрата, также оказались ГГХ и 5-ХГГХ. Посколько штаммы A. chlorophenolicus A6 и Arthrobacter sp. JS443 способны конвертировать как 4-НФ, так и 4-ХФ, вероятно у обоих штаммов для деструкции этих соединений используется одна и та же ферментная система, что было подтверждено сравнением генов конверсии пара-замещенных фенолов этих двух культур.

Гены деградации 4-ХФ (cph-гены) у штамма A. chlorophenolicus A6 распределены по двум кластерам ‒ cph I и cph II, которые разделены псевдогеном резольвазы. Оказалось, что кластер I ответственен за катаболизм 4-ХФ, так как инсерционный мутант по гену cphA-I накапливает ГГХ и не способен расти на 4-ХФ [8]. Данный кластер имеет почти одинаковую организацию и на 80.5% идентичен кластеру генов npd, кодирующего ферменты катаболического пути 4-НФ штамма Arthrobacter sp. JS443 [12].

В кластеры cph I и npd входят гены монооксигеназ (cphC-I и npdA2), аминокислотные последовательности которых идентичны на 96%, что предполагает одинаковый механизм их действия. Монооксигеназы CphC-I и NpdA2 являются компонентами TC-FDM-семейства, отвечающими за окисление субстрата. Скорее всего, эти ферменты обладают слабой позиционной специфичностью в отношении 4-хлоркатехола, и гидроксилируют его в пара-позиции по отношению к любой из двух его гидроксильных групп, вследствие чего и образуются ГГХ и 5-ХГГХ [12].

Гены второго компонента ферментов TC-FDM-семейства ‒ НАДН-зависимых флавинредуктаз (cphB и npdA1), а также ГГХ 1,2-диоксигеназ (cphA-I и npdB) (КФ 1.13.11.37) и МА-редуктаз (КФ 1.3.1.32) (npdC и cphF-I) также были локализованы в кластерах cph I, и npd [8, 12]. Идентичность продуктов трех ключевых генов npdB, npdA1 и npdA2 штамма A6 была подтверждена путем их независимой экспрессии в клетках Escherichia coli.

Таким образом, аэробная конверсия п-хлорфенола для рассмотренных выше актинобактерий идет по ГГХ-пути и инициируется двухкомпонентными флавинзависимыми монооксигеназами с широкой субстратной специфичностью.

ВАРИАНТЫ МОНООКСИГЕНАЗНОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ ТРИХЛОРФЕНОЛОВ

2,4,5- и 2,4,6-трихлорфенолы (2,4,5-ТХФ и 2,4,6-ТХФ) относятся к экологически стойкому классу загрязнителей, известных как полихлорированные фенолы [1]. В то время как монохлорфенолы и дихлорфенолы естественным образом могут производиться некоторыми бактериями, грибами и насекомыми, природные источники полихлорфенолов не известны [2].

2,4,5-ТХФ и 2,4,6-ТХФ широко используются в качестве клея и консервантов, особенно для пиломатериалов и кожи, а их производные ‒ в качестве гербицидов и фунгицидов [33]. Соответственно, при биодеградации таких соединений бактериями трихлорфенолы часто являются метаболическими интермедиатами. Так, 2,4,5-ТХФ – это первый промежуточный продукт деградации 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4,5-Т) в результате проявления активности 2,4,5-Т-оксигеназы (TftAB) (рис. 5а) у штамма Burkholderia phenoliruptrix (ранее Pseudomonas cepacia, Burkholderia cepacia) AC1100. На последующих стадиях 2,4,5-ТХФ-4-монооксигеназа (TftD) (КФ 1.14.13.-) катализирует две реакции окислительного дехлорирования, где 2,4,5-ТХФ сначала трансформируется в 2,5-дихлорбензохинон (2,5-ДХБХ), который химически восстанавливался с помощью либо НАДН либо ФАДН₂ в 2,5-дихлоргидрохинон (2,5-ДХГХ), а затем последний превращается в 2-гидрокси-5-хлор-п-бензохинон, который аналогичным образом восстанавливался до 5-ХГГХ (рис. 3а) [34, 35].

Рис. 5.

Пути аэробной деградации 2,4,5-ТХФ (а) и 2,4,6-ТХФ (б) штамма B. phenoliruptrix AC1100 [4, 34, 35]. I ‒ 2,4,5-трихлорфеноксиуксусная кислота; II – 2,4,5-трихлорфенол; III – 2,5-дихлор-п-бензохинон, IV – 2,5-дихлоргидрохинон; V – 2-гидрокси-5-хлор-п-бензохинон; VI – 5-хлоргидроксигидрохинон, VII – 2-гидрокси-п-бензохинон; VIII – гидроксигидрохинон, IX – малеилацетат; X – β-кетоадипат; XI – 2,4,6-трихлорфенол, XII – 2,5-дихлор-п-бензохинон, XIII – 2,5-дихлоргидрохинон, TCA – цикл трикарбоновых кислот.

Как видно из рис. 5а, монооксигеназа TftD осуществляет две последовательные стадии гидроксилирования, как и описанная выше монооксигеназа NpdA2 штамма Arthrobacter sp. JS443, и принадлежит к тому же TC-FDM-семейству. Генерируемый вторым компонентом НАДН, а именно: ФАД-оксидоредуктазой (TftC), флавин (ФАДН₂) свободно диффундирует к TftD и используется последней скорее в качестве субстрата, а не кофактора, что характерно для всех двухкомпонентных флавинмонооксигеназ. TftD также может окислять 2,4,6-ТХФ до 2,6-дихлорбензохинона (2,6-ДХБХ), но не может далее преобразовывать ни его, ни его восстановленную форму ‒ 2,6-дихлоргидрохинон (2,6-ДХГХ) (рис. 5б) [33].

TftD и TftC показывают сходство последовательностей (идентичность 28 и 40% соответственно) с 4-гидроксифенилацетат-3-монооксигеназой (HpaB) штамма Thermus thermophilus HB8 (2YYL) и корринредуктазой (CobR) штамма Brucella melitensis (3CB0), другими флавинзависимыми монооксигеназами и флавинредуктазами TC-FDM-семейства, участвующими в конверсии фенольных соединений [33, 36].

Дальнейший метаболизм промежуточного соединения 5-ХГГХ у штамма AC1100 контролирует кластер генов tftEFGH. TftG (КФ 4.5.1.-) дехлорирует 5-ХГГХ с образованием 2-гидрокси-п-бензохинона, который затем восстанавливается редуктазой (КФ 1.6.5.7) до ГГХ. TftH расщепляет ароматическое кольцо последнего с образованием МА, а TftE восстанавливает МА до β-кетоадипата [4].

2,4,5-Т-индуцибельная 2-гидрокси-п-бензохинонредуктаза, по-видимому, отличается специфичностью субстрата от других хиноновых редуктаз. Продукт гена tftG, также представляет собой новый фермент дегидрохлориназу и принадлежит к YCII-суперсемейству, группе мало исследованных белков. Поиск по базам данных выявил несколько белков с неизвестной функцией со сходной структурой, но с относительно низкой идентичностью последовательностей с TftG [37].

Конверсия второго хлорфенола – 2,4,6-ТХФ – подробно изучена для двух штаммов: Ralstonia pickettii DTP0602 [7, 38] и Cupriavidus necator JMP134 (ранее Alcaligenes eutrophus, Ralstonia eutropha и Wauteria eutropha) [5, 6].

За использование 2,4,6-ТХФ в качестве единственного источника углерода и энергии у R. pickettii DTP0602 ответственны два генетических кластера hadRXABC и hadSYD, разделённые участком размером 146 т.п.н. и раздельно регулируемые белками HadR и HadS, соответственно. Сначала 2,4,6-ТХФ преобразуется в 2-хлормалеилацетат (2-ХМА) под действием генов hadRXABC, а затем в β-кетоадипат с помощью hadSYD (рис. 6).

Рис. 6.

Пути аэробной деградации 2,4,6-ТХФ штаммов R. pickettii DTP0602 (а) [7, 38] и Cupriavidus necator JMP134 (б) [5, 6]: I ‒ 2,4,6-трихлорфенол; II – 2,6-дихлор-п-бензохинон; III – 2,6-дихлоргидрохинон; IV ‒ 6-хлоргидроксигидрохинон; V – 2-хлормалеилацетат; VI – малеилацетат, VII – 2-гидрокси-6-хлор-п-бензохинон; VIII – β-кетоадипат; TCA – цикл трикарбоновых кислот.

2,6-ДХБХ был определен в качестве первого метаболического интермедиата конверсии 2,4,6-ТХФ. Эта реакция катализируется флавинмонооксигеназой TC-FDM-семейства HadA – фермент, который обладает двойной активностью, в катализе гидроксилирования и групповой элиминации, как хлорзаместителей, так и нитрогрупп с образованием хинонового продукта. HadX представляет собой второй компонент TC-FDM-семейства ‒ флавинредуктазу, генерирующую ФАДН₂, который передается к HadA посредством свободной диффузии. ФМН-зависимая хинонредуктаза HadB восстанавливает 2,6-ДХБХ в 2,6-ДХГХ. Затем монооксигеназа HadA катализирует второе последовательное гидроксилирование 2,6-ДХГХ с образованием 6-ХГГХ, ароматическое кольцо которого расщепляется 6-ХГГХ-1,2-диоксигеназой HadC. В результате еще двух реакций фермент МА-редуктаза генерирует β-кетоадипат [7, 38].

Бактериальный штамм C. necator JMP134 может расти на нескольких хлорированных ароматических загрязнителях, включая 2,4-Д и 2,4,6-ТХФ. В то время как катаболизм 2,4-Д является классическим хлоркатехольным путем деградация 2,4,6-ТХФ и осуществляется через производные гидрохинона (рис. 6 б), кодируется кластером генов tcpRXABCYD [5, 39].

В начале пути 2,4,6-ТХФ-монооксигеназа (TcpA) (КФ 1.14.14.173) заменяет два хлор заместителя на две гидроксильные группы с образованием 6-ХГГХ и с незначительным образованием 2,6-ДХГХ. Для этих реакций второй компонент флавинредуктаза TcpX, чей ген располагается рядом с tcpA, используя НАДН в качестве восстановителя, поставляет TcpA восстановленный флавин (ФАДН₂) [6].

2,6-Дихлоргидроксигидрохинон (2,6-ДХГГХ) для TcpA, также как и для HadA, является логическим промежуточным метаболическим продуктом, однако некоторые факты свидетельствуют против данного предположения.

Так, TcpA окисляет 2,6-ДХФ до 2,6-ДХГХ, но не далее до 6-ХГГХ. Разница между окислениями TcpA 2,6-ДХФ и 2,4,6-ТХФ состоит в непосредственном продукте. Поскольку монооксигеназы после удаления электроноакцепторной группы (такой как хлор) из фенольных соединений образуют бензохиноны [6], то прямым продуктом окисления 2,4,6-ТХФ TcpA должен быть 2,6-ДХБХ. В то время как гидроксилирование четвертого положения 2,6-дихлорфенола происходит посредством простой монооксигеназной реакции с продукцией сразу 2,6-ДХГХ без образования бензохинона в качестве промежуточного соединения.

Кроме того, стехиометрический анализ и эксперименты с ¹⁸O-меткой показали потребление только одной молекулы O₂ на 2,4,6-ТХФ, превращенного в 6-ХГГХ, свидетельствуя в пользу того, что для общей конверсии используется только одна окислительная реакция, а удаление второго хлора происходит с помощью неокислительного процесса. Следовательно, первая реакция является окислительной с образованием 2,6-ДХБХ. Затем фермент использует первый продукт в качестве своего второго субстрата и удаляет второй хлор путем гидролиза с образованием 2-гидрокси-6-хлор-п-бензохинона. Последний восстанавливается аскорбатом и НАДН в реакционной смеси до 6-ХГГХ. Образование небольшого количества 2,6-ДХГХ в результате активности TcpA также можно объяснить действием на 2,6-ДХБХ этих восстановителей.

Как и TcpA, рассмотренные выше монооксигеназы HadA и TftD катализируют две последовательные стадии гидроксилирования 2,4,6-ТХФ и 2,4,5-ТХФ, соответственно. Подразумевается, что все последовательные гидроксилирования, о которых было известно, осуществляются посредством двух аналогичных окислительных реакций. Однако, 2,4,6-ТХФ-монооксигеназа (TcpA) штамма JMP134 катализирует гидроксилирование как окислительным, так и гидролитическим способами [6]. Ранее такой каталитический механизм предположили у другой двухкомпонентной флавинмонооксигеназы NpdA2 штамма Arthrobacter sp. JS443, фермент также не мог использовать в качестве субстрата восстановленный бензохинон [12].

Способность монооксигеназы TcpA осуществлять реакции двух типов, скорее всего, не связана с наличием второго функционального домена, а обусловлена каталитической разнородностью фермента [6]. Подтверждением данной гипотезы являются эксперименты молекулярного докинга с ФАДН₂ и субстратами (2,4,5-ТХФ, 2,4,6-ТХФ, 2,5-ДХГХ и 2,6-ДХГХ) двух гомологичных монооксигеназ TftD и TcpA. Монооксигеназы показали 65% идентичность их аминокислотных последовательностей и высокое сходство во вторичных структурных элементах, а всего от нескольких ключевых аминокислотных остатков зависят очевидные различия в их каталитической активности и субстратной специфичности. Из-за более гидрофобной природы связывающего кармана TcpA, продукт первой реакции в виде хинона может дольше оставаться в его активном сайте, чем у TftD, что дает достаточно времени, позволяя атаковать молекуле воды. Кроме того, водородная связь между остатком Arg₁₀₁ и пара-гидроксильной группой приводит к стабилизации заряда во время атаки молекулы воды на хлор во 2 положении. В конечном итоге это приводит к гидролитическому дехлорированию сразу после оксигеназного дехлорирования без переориентации субстрата или необходимости для него покидать активный сайт. Положение 2,4,6-ТХФ в активном центре TftD также позволяло хлор заместителю в пара-положении находиться в пределах расстояния водородной связи от His₂₈₉, что делало возможным продуктивное дехлорирование в 4 положении, в то время как для второго дехлорирования 2,6-ДХГХ было необходимо изменение ориентации субстрата [40].

В процессе дальнейшего метаболизма 2,4,6-ТХФ-хинонредуктаза TcpB (КФ 1.14.14.172) штамма JMP134 восстанавливала 6-хлоргидроксибензохинонхинон до 6-ХГГХ, а ароматическое кольцо последнего расщеплялось под действием 6-ХГГХ-1,2-диоксигеназы TcpC (КФ 1.13.11.-). Два других гена tcpD и tcpR катаболического кластера tcpRXABCYD кодировали МА-редуктазу и транскрипционный регулятор LysR-типа, который контролировал экспрессию tcp-генов, используя 2,4,6-ТХФ в качестве индуктора [39].

Таким образом, стадии расщепления ароматического кольца в путях деградации 2,4,6-Т у штаммов R. pickettii DTP0602 [7] и C. necator JMP134 происходят одинаково: 6-ХГГХ трансформируется в 2-хлормалеилацетат. В то время как у штамма B. phenoliruptrix AC1100 5-ХГГХ не подвергается расщеплению кольца напрямую. Два дополнительных фермента – дехлориназа и ГГХ-редуктаза, сначала трансформировали 5-ХГГХ в ГГХ. При этом TftH – диоксигеназа штамма B. phenoliruptrix AC1100, может использовать только ГГХ, а не 5-ХГГХ или 6-ХГГХ, в качестве субстрата для орто-расщепления его ароматического кольца [35]. Некоторая «избыточность» пути деградации 2,4,5-Т у B. phenoliruptrix АС1100 может быть связана с тем, что штамм был получен искусственно, методом так называемого плазмид-ассоциированного молекулярного бридинга [41].

Сравнение выведенных аминокислотных последовательностей катаболических генов had, tcp и tft трех деструкторов трихлорфенолов R. pickettii DTP0602, C. necator JMP134 и B. phenoliruptrix AC1100 показало их значительную гомологию. Причем более высокая гомология наблюдалась для монооксигеназ и гидроксигидрохинон-1,2-диоксигеназ. Так, идентичность аминокислотных последовательностей монооксигеназ HadA с TcpA и TftD составила 87 и 64%, а ГГХ-1,2-диоксигеназ HadC с TcpC и TftH ‒ 73 и 57% соответственно. 6-ХГГХ-редуктазы HadB и TcpB также показали высокую гомологию (идентичность 75%) аминокислотных последовательностей. И наоборот, меньшее сходство продемонстрировали повсеместно распространенные бактериальные ферменты: флавинредуктазы HadX с TcpX и TfdC ‒ 60 и 55% идентичности и MA редуктазы HadD с TcpD и TftE ‒ 66 и 58% соответственно [7].

Таким образом, несмотря на некоторые отличия в путях деградации трихлорфенолов штаммов R. pickettii DTP0602, C. necator JMP134 и B. phenoliruptrix AC1100 наблюдается общая тенденция, заключающаяся в том, что на начальных стадиях двухкомпонентные монооксигеназы катализируют две последовательные реакции замены хлора на гидроксильную группу сначала в пара-, а затем в орто- положениях по отношению к фенольной ОН-группе. Впоследствии субстратами для диоксигеназ, расщепляющих ароматическое кольцо, служат или гидроксигидрохинон или его хлорированные в 5 или 6 положении производные, то есть метаболизм трихлорфенолов идет по ГГХ-пути.

БАКТЕРИАЛЬНАЯ ДЕГРАДАЦИЯ ПЕНТАХЛОРФЕНОЛА КАК МОДЕЛЬ ВНОВЬ ВОЗНИКШЕГО И ЕЩЕ НЕ ОПТИМИЗИРОВАННОГО ПУТИ КОНВЕРСИИ КСЕНОБИОТИКОВ

Пентахлорфенол (ПХФ) ‒ это синтетическое соединение, которое с 20-х гг. прошлого столетия широко используется в качестве действующего агента пестицидов и антисептиков-консервантов древесины от ее поражения грибком. Так как природных источников ПХФ не существует, следовательно, пути, используемые бактериями для его разложения, возникли примерно за 60 лет с момента начала его применения человеком. За это время, вследствие своей токсичности и стойкости, ПХФ стал одним из приоритетных загрязнителей окружающей среды [42].

Известно, что введение антропогенных химикатов в окружающую среду создает селективное давление, которое может способствовать развитию новых путей, позволяющим бактериям получать доступ к новым источникам углерода, азота или фосфора и/или детоксифицировать опасные соединения. Однако разложение антропогенных химических веществ часто оказывается медленным и неполным, поскольку бактерии еще не выработали ферменты, которые эффективно катализируют шаги, необходимые для преобразования таких соединений в метаболиты центрального углеродного обмена [2, 43].

ПХФ из-за присутствия пяти атомов хлора на фенольном кольце более стоек к бактериальной деградации, чем менее хлорированные аналоги [3]. Штамм Sphingobium (ранее Sphingomonas) chlorophenolica ATCC 39723 относится к немногим бактериям, способным полностью минерализовать ПХФ, хотя разложение происходит медленно и деструктор не может расти при высоких концентрациях этого субстрата [2, 43–47].

Деградация ПХФ у S. chlorophenolicum ATCC 39723 начинается с гидроксилирования субстрата однокомпонентной ПХФ-монооксигеназой (PcpB) (КФ 1.14.13.50) с образованием тетрахлор-п-бензохинона (ТХБХ) (рис. 5). Интересно, что фермент способен к удалению из 4 положения широкого ряда заместителей у полигалогенированных фенолов, но при этом необходимо, чтобы во 2 положении присутствовал галоген.

Затем ТХБХ-редуктаза (PcpD) (КФ 1.1.1.404) восстанавливает ТХБХ до тетрахлоргидрохинона (ТХГХ) [45]. Мутантный штамм, лишенный функциональной PcpD, обладал нарушенной способностью разлагать ПХФ, но в тоже время удалял из среды 2,3,5,6-тетрахлорфенол с той же скоростью, что и штамм дикого типа, следовательно, PcpD катализирует стадию, необходимую для разложения ПХФ, но не для разложения 2,3,5,6-тетрахлорфенола. Основываясь на известных механизмах действия флавинмонооксигеназ, к которым относится и PcpB, гидроксилирование ПХФ приводит к образованию ТХБХ, который PcpD и восстанавливает до ТХГХ. Последний затем превращается в 2,6-ДХГХ посредством двух реакций дегалогенирования, катализируемых дегалогеназой (глутатион-S-трансферазой) PcpC (КФ 1.21.4.5) [48]. Каждая стадия восстановительного дегалогенирования приводит к окислению двух молекул глутатиона до дисульфида глутатиона.

Необходимо отметить, что PcpC подвержен окислительному стрессу, а поврежденный фермент продуцирует глутатионильные конъюгаты (S-глутатионил-трихлоргидрохинон и S-глутатионил-дихлоргидрохинон), которые он не может далее дегалогенировать. Эти конъюгаты могут быть восстановлены и возвращены на путь деградации действием другой глутатионтрансферазы, PcpF (КФ 1.8.5.7), которая превращает конъюгаты в 2,5,6-трихлор- и 2,6-дихлоргидрохинон, возвращая их на путь деградации [49].

Fe(II)-зависимая экстрадиольная диоксигеназа (PcpA) (КФ 1.13.11.66) расщепляет 2,6-ДХГХ [50–52] с образованием 2-хлормалеилацетат (2-ХMA). Фермент МА-редуктаза (PcpE) ответственен за восстановление 2-ХMA до MA, а затем до β-кетоадипата.

У штамма ATCC 39723 первоначально были известны пять катаболических генов: pcpB, pcpD, pcpC, pcpA и pcpE, а также один регуляторный ген pcpR, участвующих в деградации ПХФ. Еще один ген глутатионтрансферазы pcpF был описан позже [49]. Гены разбросаны по двум фрагментам: pcpB, pcpD и pcpR организованы как кластер с одинаковой ориентацией, при этом с генов pcpB и pcpD экспрессируется единый транскрипт. Остальные гены pcpC, pcpA, pcpE и pcpF (обозначенный изначально как orf19) находятся на другом фрагменте рядом друг с другом, но не внутри оперона. Наличие консервативных сайтов связывания для регуляторного белка PcpR в промоторных областях pcpB, pcpA и pcpE показывает, что гены действуют как единый регулон с PcpR в качестве активатора, однако неизвестно, выступает в качестве коиндуктора сам ПХФ или его последующие продукты. Гены глутатионтрансфераз pcpC и pcpF экспрессируются конститутивно, вероятно механизм их регуляции с помощью ПХФ бактерия еще не выработала [43–45, 49].

Теоретически гены, кодирующие ферменты деградации ПХФ, могли возникнуть в результате: 1) привлечения предкового фермента без дупликации генов, что требует разделения новых и исходных функций; 2) рекрутированнием уже существующего фермента с последующим дублированием и дивергенцией исходного гена с получением для деградации ПХФ одной специализированной, хотя возможно, и не оптимизированной копии; и 3) горизонтальным переносом генов, кодирующих либо ферменты, которые уже специализированы для расщепления ПХФ, либо ферменты с широкой субстратной специфичностью и часто слабой эффективностью, которые стали полезными, когда бактерия столкнулась с этим субстратом. [43].

Для понимания происхождения ферментов разложения ПХФ сравнили всю последовательность геномов S. chlorophenolicum ATCC 39723 и S. japonicum, близкородственной сфингомонады, которая разлагает другой хлорорганический пестицид ‒ линдан (γ-гексахлорциклогексан) [53].

Первый фермент пути штамма ATCC 39723 PcpB принадлежит к семейству однокомпонентных флавинзависимых монооксигеназ, к которому также относятся хорошо изученные ферменты фенолгидроксилаза (КФ 1.14.13.7) штамма Trichosporon cutaneum [54] и п-гидроксибензоатгидроксилаза (КФ 1.14.13.2) представителей рода Pseudomonas [55]. Такие ферменты распространены у почвенных бактерий, поскольку фенольные соединения, полученные в результате разложения лигнина, являются важным источником углерода. Отсутствие близкого гомолога у S. japonicum позволяет предположить, что гена pcpB не было у последнего общего предка S. chlorophenolicum и S. japonicum. Близкие гомологи pcpB также не обнаружены у другой сфингомонады Sphingomonas wittichii, поэтому маловероятно, что этот ген произошел от предкового, утерянного у S. japonicum. Низкая парная идентичность последовательностей между ПХФ гидроксилазой и другими флавинмонооксигеназами штамма S. chlorophenolicum показывает, что pcpB не возник в результате недавней дупликации и дивергенции ранее существовавшего гена. Эти данные, наряду с наблюдением, что pcpB и pcpD находятся в области с относительно низким GC-составом, свидетельствуют о том, что ген pcpB был приобретен путем горизонтального переноса из неизвестного источника. Эта гипотеза подтверждается наблюдением, что ферменты, показывающие высокую гомологию с PcpB (72–98% идентичность последовательностей), обнаружены у Novosphingobium lentum [56], нескольких разлагающих полихлорфенол сфингомонад из Финляндии [57], Sphingomonas sp. UG30 [58], а также у некоторых некультивируемых бактерий из проб окружающей среды, собранных с почв, загрязненных ПХФ [59]. Высокая гомология последовательностей этих генов позволяет предположить, что pcpB был передан путем горизонтального переноса генов. В то же время, PcpB имеет низкую гомологию (<35% идентичности) с большинством флавинмонооксигеназ бактерий, не разрушающих ПХФ. Высокий уровень дивергенции последовательностей затрудняет идентификацию исходного субстрата PcpB до его вовлечения в путь деградации ПХФ [43].

Второй фермент ТХБХ-редуктаза PcpD не имеет близкого родства с каким-либо другим ферментом в геномах S. chlorophenolicum или S. japonicum, что позволяет предположить, что она, как и pcpB, была приобретена путем горизонтального переноса генов. Хотя существует несколько семейств известных хинонредуктаз, фермент PcpD не входит ни в одну из них. Скорее, ТХБХ-редуктаза наиболее близка белкам, которые служат редуктазными компонентами двухкомпонентных оксигеназ, инициирующих аэробную деградацию ароматических соединений, не имеющих гидроксильных или аминных заместителей [43, 45].

PcpC катализирует стадии восстановительного дегалогенирования, которое также происходит во время деградации линдана у S. japonicum [60]. Дегалогеназы PcpC и LinD являются членами семейства глутатион-S-трансфераз (GST) (КФ 2.5.1.18), большинство ферментов которого катализируют нуклеофильную атаку глутатиона на электрофильный субстрат с образованием конъюгата глутатиона. Хотя в геномах штаммов S. chlorophenolicum и S. japonicum есть многочисленные члены GST-семейства, ТХГХ-дегалогеназа не имеет значительной гомологии любому из них (<25% идентичности парных последовательностей), в том числе LinD, катализирующему восстановительное дегалогенирование 2,5-ДХГХ до 2-хлоргидрохинона в пути деградации линдана [60]. Таким образом, pcpC, скорее всего, был приобретен путем горизонтального переноса генов. PcpC и LinD ‒ единственные известные восстановительные дегалогеназы аэробных бактерий, которые действуют на ароматические соединения. Значительное расхождение между этими ферментами предполагает, что они происходят независимо от разных предков ‒ членов GST-семейства. Остатки в активных центрах PcpC и LinD напоминают остатки в активных центрах некоторых малеилпируватизомераз, а ТХГХ-дегалогеназа имеет низкую активность с малеилацетоном, аналогом малеилпирувата [61]. Следовательно, ТХГХ-дегалогеназа могла происходить от малеилпируватаизомеразы.

Первые три рассмотренных фермента этого метаболического пути удивительно неэффективны. ПХФ-гидроксилаза (PcpB) имеет очень низкую каталитическую константу (k_cat 0.02 с^–1) и демонстрирует существенное разобщение ‒ фермент часто не может гидроксилировать субстрат и вместо этого высвобождает H₂O₂ по мере разложения промежуточного продукта C4a-гидропероксифлавина. ТХБХ-редуктаза (PcpD) показывает низкую скорость оборота (0.7 с^–1 при 50 мкМ ТХБХ) [45, 47], а ТХГХ-дегалогеназа (PcpC) подвергается глубокому субстратному ингибированию, ее ароматические субстраты действуют как неконкурентные ингибиторы реакции тиол-дисульфидного обмена, которая необходима для регенерации свободной формы фермента [62]. Эти данные согласуются с гипотезой о том, что ферменты в пути деградации ПХФ еще не эволюционировали до уровня функции, типичной для большинства метаболических энзимов [43]. Поскольку первые детерминанты деградации ПХФ (pcpB, pcpD и pcpC) были обнаружены в двух разных локусах генома штамма ATCC 39723, следовательно, были задействованы как минимум два разных события горизонтального переноса генов.

При исследовании четвертого фермента PcpA оказалось, что его последовательность на 93% идентична другой диоксигеназе LinEb штамма S. japonicum, расщепляющей ароматическое кольцо 2,6-ДХГХ. Несмотря на свое название, фермент LinEb не участвует в деградации линдана [63], в котором 2-хлоргидрохинон расщепляет его гомолог LinE. Последовательности диоксигеназ LinE и LinEb имеют 53, а PcpA и LinE ‒ 52% идентичности.

Изучение пятого фермента пути (PcpE) показало, что его последовательность на 91% идентична МА-редуктазе (LinF) штамма S. japonicum. Следовательно, последние два гена пути деградации ПХФ, PcpA и PcpE были унаследованы от ближайшего предка S. chlorophenolicum и S. japonicum.

Таким образом, конверсию ПХФ можно рассматривать, как модель вновь возникшего и еще не оптимизированного пути конверсии ксенобиотиков. Монооксигенирование первичного субстрата осуществляется однокомпонентной гидроксилазой однократно в п-положении, в результате чего отщепляется хлор-заместитель и образуется тетрахлор-п-бензохинон, который в следующей реакции восстанавливается до тетрахлоргидрохинона. Большинство хлор-заместителей элиминируется из молекулы субстрата до раскрытия ароматического кольца. Субстратом для диоксигеназы, катализирующей это мета-расщепление, является дихлорированный гидрохинон.

***

Флавинзависимые монооксигеназы, гидроксилирующие субстрат, играют основную роль в гидрохиноновом пути бактериальной деградации хлорфенолов. Монооксигенирование фенолов, содержащих хлор в пара-положении, приводит к одновременному гидроксилированию и выделению ионов этого заместителя. При этом атака монооксигеназы на такой субстрат производит сначала хинон, который затем восстанавливается до гидрохинона или гидроксигидрохинона. Соответственно от того какое из этих двух соединений служит субстратом для дальнейшего воздействия диоксигеназ, расщепляющих ароматическое кольцо, различают два альтернативных метаболических пути конверсии этих соединений. Довольно часто наблюдается корреляция пути метаболизма монозамещенных п-фенолов с таксономической принадлежностью штамма-деструктора. Преимущественно у грамотрицательных бактерий в результате активности однокомпонентных флавинзависимых монооксигеназ образуется гидрохинон, ароматическое кольцо которого в последствие расщепляется. В то время как у грамположительных бактерий двухкомпонентные флавинзависимые монооксигеназы трансформируют первоначальный субстрат в результате двух последовательных реакций гидроксилирования до гидроксигидрохинона, который служит субстратом для диоксигеназ, расщепляющих ароматическое кольцо.

Однокомпонентные гидроксилазы принадлежат к классу А флавинзависимых монооксигеназ и проявляют узкую субстратную специфичность по отношению к ароматическим соединениям, содержащим активирующую гидроксильную или аминогруппу. Это важное отличие всех флавинсодержащих оксигеназ от ферментов P₄₅₀, которые могут гидроксилировать также неактивированные ароматические соединения [11]. Поскольку конечным продуктом катализа однокомпонентных гидроксилаз являетси гидроксихинон, логично, что эти ферменты выполняют только одно гидроксилирование фенольного субстрата. Однако, скорее всего, это ограничение не является функциональным и второе гидроксилирование вполне возможно для этого класса ферментов. Так, в альтернативном ГГХ-пути деградации 4-НФ штаммами Pseudomonas sp. 1-7 и Pseudomonas sp. WBC-3, однокомпонентные 4-НФ-монооксигеназы PdcA и PnpA скорее всего выполняют второе гидроксилирование субстрата [14, 15].

Однокомпонентная ПХФ монооксигеназа (PcpB) штамма S. chlorophenolicum ATCC 39723 катализирует одно гидроксилирование субстрата в 4 положении с образованием ТХБХ. Близкие гомологи гена этого фермента с 72–98% идентичностью обнаружены у некоторых других – разлагающих ПХФ сфингомонад [57, 58]. С большинством флавинмонооксигеназ бактерий, не способных к конверсии ПХФ, PcpB имеет <35% идентичности последовательностей [43]. Кроме того, при исследовании влияния полихлорфенолов на видовое разнообразие бактерий сообщалось, что добавление ПХФ в почвенную суспензию приводило к избирательному ее обогащению бактериями рода Sphingomonas [59]. Таким образом, наблюдается корреляция способности разлагать ПХФ с таксономической принадлежностью бактерии деструктора к сфингомонадам и родственным им видам.

Бактериальная деградация пентахлорфенола может считаться классическим примером нового пути, вновь возникшего и эволюционирующего за 60 лет его активного использования человеком. Бактерии еще не оптимизировали и не отрегулировали ферменты начальных стадий, необходимые для преобразования этого антропогенного соединения в метаболиты центрального углеродного обмена, вследствие чего первые три фермента пути PcpB, PcpD и PcpC штамма S. chlorophenolicum функционируют с различными ошибками. Диоксигеназа PcpA катализирует расщепление кольца 2,6-дихлоргидрохинона, то есть метаболизм ПХФ идет по ГХ-пути, что характерно при использовании бактериями однокомпонентных флавинмонооксигеназ.

Двухкомпонентные гидроксилазы принадлежат к классу D флавинзависимых монооксигеназ, ферментом-прототипом для которого является 4‑гидроксифенилацетат-3-монооксигеназа (КФ 1.14.13.3), которая была идентифицирована у ряда бактерий. Подобно флавомонооксигеназам класса А, члены класса D обычно активны в отношении ароматических субстратов, таких как 4-гидроксифенилацетат, фенол [64–66], 4-НФ [17] и др. Представители этого класса, по-видимому, ограничены только одним типом оксигенации: (регионселективным) гидроксилированием [11].

Как следует из приведенных выше данных, бактериальные аэробные катаболические пути хлорированных фенолов чаще инициируются двухкомпонентными монооксигеназами, что, возможно, связано с характерной для них широкой субстратной специфичностью. Большинство монооксигеназных компонентов TC-FDM-семейства попадают в одну из двух гомологичных групп [18]. Первая группа – фенол-2-монооксигеназная, состоит из ферментов, которые гидроксилируют фенолы в орто-положении к исходной гидроксильной группе и включает 4-гидроксифенилацетатмонооксигеназу HpaB [25], нитрофенолмонооксигеназу NphA1 (КФ 1.14.13.29) [24] и фенолмонооксигеназу PheA [67].

Вторая – основная гомологичная группа содержит фенол-4-монооксигеназы, которые гидроксилируют фенолы в пара-положении по отношению к исходной гидроксильной группе. Эта группа включает 4-ХФ-монооксигеназу CphC-I [8], 4-НФ монооксигеназы NpcA [18] и NpdA2 [12], 2,4,5-ТХФ-монооксигеназу TftD [68] и 2,4,6-трихлорфенолмонооксигеназы TcpA [5] и HadA [69]. Природные субстраты всех ферментов в группе фенол-4-монооксигеназ имеют электроноакцепторный заместитель (нитро или хлор) в пара-положении, который замещается в результате катализируемого монооксигеназой гидроксилирования. Все члены группы фенол-4-монооксигеназы дважды гидроксилируют свои природные субстраты.

При разложении трихлорфенолов сначала всегда происходит гидроксилирование в пара-, а потом в орто-позиции к первоначальной гидроксильной группе. 2,4,6-ТХФ-монооксигеназа TcpA [6] катализирует последовательное дехлорирование посредством окислительных и гидролитических реакций, при этом субстрат не покидает активного сайта фермента [11, 12]. Второе гидроксилирование субстрата 4-НФ-моноксигеназой NpdA2 [12], по аналогии с TcpA также, скорее всего, осуществляется посредством гидролитической реакции без выхода субстрата из активного центра фермента. Подтверждением этого предположения является то, что как TcpA, так и NpdA2 не могут использовать как субстраты восстановленные бензохиноны ‒ 2,6-ДХГХ и гидрохинон соответственно. Причем второго функционального домена у этих монооксигеназ нет, так что скорее имеет место каталитическая разнородность (неразборчивость) фермента.

Иная каталитическая неразборчивость ферментов была выявлена при конверсии 4-ХК культурами A6 и JS443. Идентификация промежуточного метаболита 5-хлоргидроксигидрохинона в результате активности монооксигеназ CphC-I и NpdA2, свидетельствует о слабой позиционной специфичности этих ферментов в отношении субстрата, вследствие чего происходит гидроксилирование его в пара-позиции по отношению к любой из двух гидроксильных групп [8, 12].

Рассмотренные пути бактериальной деградации хлорированных фенолов показывают, что чем больше хлора содержит молекула ароматического субстрата, чем менее она похожа на природный структурный аналог, тем более проблематично для бактерии выстроить и оптимизировать путь его начальной конверсии. Токсичность хлорированных фенолов кроме количества атомов хлора в молекуле субстрата зависит и от их положения. Известно, что трудность в утилизации субстрата бактериями увеличивается при наличии хлор-заместителя в 3-, 4- и 5-ой позициях [1].

Рис. 7.

Путь конверсии ПХФ у штамма S. chlorophenolicum ATCC 39723: I – пентахлорфенол; II – тетрахлор-п-бензохинон; III – тетрахлоргидррохинон; IV – 2,5,6-трихлоргидрохинон; V – 2,6-дихлоргидрохинон; VI – 2-хлормалеилацетат; VII – малеилацетат; VIII – β-кетоадипат [2].

Таким образом, эволюция новых субстратных специфичностей идет через рекрутирование перспективных генов/ферментов посредством дупликаций и мутаций, уже имеющихся в геноме, или путем горизонтального переноса из геномов других бактерий. На первых этапах ферменты, обладающие слабой или даже неспецифичной активностью по отношению к целевым субстратам, показывают низкую эффективность. Затем приходит пора “обкатки” фермента, исправления его ошибок, увеличение специфичности к субстрату, устранение каталитической неразборчивости и оптимизация регуляции.

Работа выполнена в рамках государственного задания Минобрнауки России № 075-00326-19-00 по теме № АААА-А18-118022190098-9.