Прикладная биохимия и микробиология, 2022, T. 58, № 6, стр. 568-577

Бактерии многих родов, в том числе наиболее изученные Chromobacterium [1–3], Janthobacterium [4–6], Iodobacter, Collimonas [7, 8], а также некоторые представители таких родов, как Alteromonas и Pseudomonas [9–11], способны синтезировать пигмент фиолетового цвета – виолацеин или [3-(1,2-дигидро-(5-гидрокси-1Н-индол-3-ил)-2-оксо-3Н-пиррол-3-илидена)-1,3-дигидро-2Н-индол-2-он] (рис. 1), обладающий чрезвычайно широким спектром биологической активности [12–15].

Рис. 1.

Пути биосинтеза бактериального виолацеина.

Интерес исследователей к виолацеину и синтезирующим это соединение микроорганизмам неуклонно растет. Так, на запрос о виолацеине в базах даются ссылки на более чем 5.5 тыс. публикаций, на запрос “С. violaceum” – на более, чем 15 тыс. публикаций в период с 2012 по 2022 гг. [NCBI PubMed https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/. Accessed 20 Jan 2021].

Вместе с этим, работ в русскоязычных журналах остается относительно немного, в этой связи настоящий обзор посвящен общей характеристике данного соединения, путям его биосинтеза, некоторым свойствам и перспективам использования.

Биосинтез виолацеина. Биосинтез виолацеина осуществляется экспрессией vio оперона при участии считываемых в одном направлении пяти генов vioA, vioB, vioC, vioD, и vioE, обеспечивающих конденсацию двух молекул L-триптофана, являющегося универсальным метаболитом ряда вторичных метаболических путей у микроорганизмов [17], что приводит к образованию молекулы пигмента (рис. 1, табл. 1). Приоритет в открытии пути биосинтеза виолацеина принадлежит Пембертону c coавт. [16].

Биосинтез виолацеина начинается с образования аутоиндуктора N-гексаноил-L-гомосерин лактона (С₆-AГЛ), являющегося основным сигналом кворум сенсинга. C увеличением плотности клеточной популяции за счет каталитического превращения жирных кислот или S-аденозилметионина с участием синтазы, находящейся под контролем гена CviI, образуется С₆-АГЛ и, формируя белок-лигандный комплекс с рецепторным белком CviR, изменяет его конфигурацию, что обуславливает возможность связываться с ДНК. Образовавшийся комплекс запускает кворум-зависимую транскрипцию целевых генов vio ABEDC-оперона, связываясь с его промоторным сайтом [19–21] (рис. 2).

Рис. 2.

Кворум-зависимый синтез виолацеина у С. violaceum [21].

Продукт гена, VioA, флавинзависимая триптофан 2-монооксигеназа, катализирует окислительную трансформацию L-триптофана в индол-3-пируватимин (IPA) в процессе, сопряженном с восстановлением флавинадениндинуклеотида (FAD) [22, 23].

На следующем этапе две молекулы IPA с участием гемсодержащей синтазы, кодируемой vioB, превращаются в короткоживущий димер [24–26], который с участием фермента VioE превращается далее в протодеоксивиолацеиновую кислоту. Индольное кольцо протодеоксивиолацеиновой кислоты в пятой позиции гидроксилируется с участием монооксигеназы VioD с образованием провиолацеина. Окончательный этап биосинтеза заключается в образовании виолацеина из провиолацеина под контролем флавинзависимой монооксигеназы VioС. Детальные характеристики пути биосинтеза представлены в базе данных MetaCyc: https://biocyc.org/META/NEW-IMAGE?object=PWY-7040.

Виолацеин продуцируется широким кругом бактерий, населяющих практически все типы природных экосистем – от морских вод до сельскохозяйственных почв и ледников. В этой связи представляется достаточно затруднительно дать однозначное определение биологической роли виолацеина. Например, как и для ряда других пигментов бактерий, его роль может заключаться в защите клетки от ультрафиолетового излучения [27]. В то же время было показано, что C. violaceum синтезирует виолацеин в качестве агента конкурентной борьбы в межмикробных взаимодействиях. На такую же мысль наводит и тот факт, что продуценты виолацеина – в основном виды, ведущие прикрепленный образ жизни и являющиеся в силу этого легкой добычей для хищников [28].

В 2003 г. вышла публикация об осуществлении полногеномного сиквенса C. violaceum [29]. Анализ генома привел авторов работы к выводу о том, что очень высокая степень адаптивности и универсальность, которые демонстрирует C. violaceum, обусловлены большим и сложным геномом бактерии, включающим значительную долю открытых рамок считывания (ORF), специфически связанных со способностью организма взаимодействовать и реагировать на окружающую среду. Сложность генома может иметь большое практическое значение в силу того, что бактерия является важным потенциальным источником биотехнологически пригодных генов, в частности биосинтеза виолацеина.

Биологические эффекты виолацеина. Антибактериальные свойства виолацеина, по-видимому, одна из первых особенностей, на которую обратили внимание исследователи [30–34]. Так, в работе Барич с соавт. [35] был показан антимикробный эффект экстракта культуральной жидкости выделенной в Антарктике бактерии Janthinobacterium lividum – ROICE173 по отношению к 200 бактериальным штаммам природного и клинического происхождения, обладающим множественной лекарственной устойчивостью. Экстракт показал бактерицидный эффект в отношении 40% штаммов, бактериостатический эффект в отношении 12%, на 48% изучаемых штаммов виолацеин не оказывал эффекта. Примечательно, что был отмечен значительный эффект ингибирования по отношению к таким микроорганизмам, как стафилококки, энтерококки, энтеробактерии.

Антимикробные свойства виолацеина исчерпывающе освещены в обзоре [36]. В частности, одним из клинически значимых штаммов, который в последнее время привлекает наибольшее внимание, является Staphylococcus aureus, отчасти из-за его статуса патогена с множественной лекарственной устойчивостью. Несколькими исследовательскими коллективами [37–39] было установлено, что виолацеин способен подавлять рост S. aureus в концентрациях от 5.7 до 15 мг/л, или приблизительно от 17 до 43 мкмоль/л.

Виолацеин является гидрофобным соединением, коэффициент липофильности которого составляет 3.34 [40], в связи с чем возникает вопрос о том, каким образом он может поступать в окружающую среду и оказывать воздействие на другие организмы. В определенной степени это может быть объяснено работами, описывающими транспортные системы для виолацеина. Достаточно детально описан механизм доставки виолацеина для подавления жизнедеятельности бактерий – потенциальных конкурентов с использованием везикул наружной мембраны (ВНМ) в работе Батиста с соавт. [41]. Было установлено, что ВНМ бактерии C. violaceum являются транспортным средством доставки виолацеина на большие расстояния для уничтожения конкурентов. Высвобождение ВНМ C. violaceum является кворум-сенсинг(QS)-регулируемым процессом, необходимым для межбактериальной конкуренции с использованием доставки антимикробного соединения. При этом виолацеин индуцирует биогенез ВНМ для собственной доставки и способствует формированию биопленки. ВНМ без виолацеина безвредны для бактерий. Образование везикул обусловлено накоплением фосфолипидов во внешней мембране и регулируется фосфолипидным транспортером VacJ/Yrb. При низкой плотности клеток скорость высвобождения ВНМ снижается из-за увеличенной экспрессии системы VacJ/Yrb. Напротив, отмечено, что экспрессия VacJ/Yrb снижается на ранних стадиях инфицирования хозяина, что стимулирует везикуляцию и, соответсвенно, адаптацию к условиям среды. Таким образом, двухкомпонентная система “кворум сенсинга” CviI/CviR активирует выработку виолацеина.

Являясь структурным компонентом биопленки, виолоцеин-содержащие везикулы играют роль защиты популяции виолацеин-синтезирующих бактерий от простейших, которую обнаружили и описали Матз с соавт. [42]. Авторы показали, что виолацеин подавляет жизнедеятельность жгутиковых, инфузорий и амеб. В экспериментах с нематодой Caenorhabditis elegans было обнаружено, что виолацеин нарушает функционирование сигнального пути IIS, включающего инсулиноподобный фактор роста, что опосредует апоптоз клеток [43]. В этой же работе было показано, что апоптоз у нематоды вызывался и присутствием в кишечнике хозяина E. coli, в которой были экспрессированы гены синтеза виолацеина. В заключение авторы, сопоставляя полученные ими результаты с данными других исследований по токсическому воздействию виолацеина на клетки млекопитающих и простейших, делают предположение о наличии общего молекулярного апоптозоподобного механизма клеточной смерти у отдаленно-родственных эукариотических систем как мишени для токсического воздействия виолацеина.

Некоторые молекулярные механизмы воздействия виолацеина на простейших представлены в работе [44], результаты которой показали, что виолацеин нарушает функции шаперонов у малярийного плазмодия Plasmodium falciparum, что приводит к нарушению структуры белков, протеосомальной деградации и нарушению развития паразита.

Негативный эффект виолацеин оказывает и на грибные культуры [45]. Являясь по своей химичеcкой структуре алкалоидом, виолацеин, как и многие другие алкалоиды, обладает очень широким спектром физиологической активности. Уже упоминалось об антибактериальной активности виолацеина, позволяющей виолацеин-синтезирующим бактериям выигрывать конкурентную борьбу. При этом было показано, что у многоклеточных организмов виолацеин может оказывать стимулирующее и регулирующее влияние на микробное сообщество ЖКТ. Пауэр с соавт. [46] при оценке влияния разных доз виолацеина, 50 и 500 μг/мл, перорально вводимого крысам в течение месяца, выяснили, что маленькие дозы виолацеина были связаны с обнаружением большего таксономического разнообразия кишечной микробиоты по сравнению с контрольной группой и высокими дозами виолацеина. В группе, обрабатываемой низкой дозой виолацеина, доминировали представители классов Bacilli и Clostridia, как полагают авторы, в результате снижения конкурентноспособности других групп бактерий, в том числе, протеобактерий.

В экспериментах с лабораторными мышами и крысами был продемонстрирован значительный иммуномодулирующий, противовоспалительный и обезболивающий эффекты виолацеина, полученного из штамма Chromobacterium violaceum [47]. Авторы предположили, что эффект обусловлен тем, что виолацеин в дозах 10, 20 и 40 мг/кг веса способен ингибировать синтез/высвобождение медиаторов воспаления.

Веринауд с соавт. [48] показали в экспериментах с мышами, у которых вызывали острый или хронический воспалительный процесс, что интраперитонеальное введение мышам 3.5 мг/кг веса виолацеина приводило к подавлению выработки цитокинов (при остром воспалении) и оказывало стимулирующий эффект в отношении регуляторных Т-клеток (при хроническом воспалении), что в значительной степени сглаживало картину воспалительного эффекта.

Располагая противоречивыми данными о влиянии виолацеина на экспрессию фактора некроза опухоли (TNF-α) (до этого было сообщение Альшатви с соавт. об индукции экспрессии фактора некроза опухоли в клеточной культуре рака молочной железы MCF-7 [49], в то время, как Ферейра с соавт. [50] не обнаружили индукции при исследовании клеток пораженной эндомитоцином слизистой оболочки желудка крыс), Венегас с соавт. [51] выяснили, что виолацеин способен оказывать непосредственное влияние на клетки-макрофаги. Прежде всего, авторы на примере клеточной линии макрофагов мыши Raw 264.7 показали, что виолаценин не влияет на динамику выделения оксида азота макрофагами. Далее они установили, что виолацеин непосредственно повышает уровень иммунного ответа, индуцируя экспрессию провоспалительных цитокинов в клетках Raw 264.7 и ANA-1 за счет активации сигнального пути TLR. Используя в работе линию клеток почек эмбриона человека HEK-293, авторы установили, что в концентрации 15 мкмоль/л виолацеин активирует тол-подобные рецепторы hTLR8, функция которых состоит в активации клеточного иммунного ответа за счет распознавания молекулярных структур патогенов и запуска сигнального каскада, ведущего к синтезу цитокинов и других ассоциированыых с воспалением молекул. Была отмечена экспрессия генов, вовлеченных в воспалительный ответ и сигнальную систему, хемотаксис, а также изменение уровня экспрессии генов, связанных с регуляцией клеточной пролиферации. В работе получены доказательства того, что виолацеин может связываться с hTLR8 аналогично имидазохинолиновым соединениям. Имидазохинолиновые соединения с низкой молекулярной массой являются агонистами TLR8-рецепторов и демонстрируют противовирусные и противораковые свойства. В свете полученных доказательств становится очевидно, что виолацеин обладает потенциалом для использования в будущих стратегиях иммунной терапии. Рецептор TLR8 участвует в распознавании одноцепочечной РНК (ssRNA) и инициирует иммунный ответ, который может передаваться через два различных механизма с участием различных адаптерных белков, а именно MyD88 или TRIF.

Значительный объем информации накоплен относительно противораковой активности виолацеина. Ряд исследований показал, что виолацеин способен вызывать апоптоз в различных типах раковых клеток, включая линии клеток лейкемии. Авторы работы [52] использовали неопухолевые (CHO-K1 and MRC-5) и опухолевые (HeLa) клеточные линии для оценки влияния виолацеина как окислителя. Не установив взаимосвязи между появлением биомаркеров окислительного стресса в ответ на обработку клеток виолацеином (3 и 5 мкм) и индукцией апоптоза, авторы тем не менее пришли к заключению о том, что виолацеин вызывает гиперполяризацию митохондриальных мембран, вызывая тем самым гибель клеток. Наибольший эффект наблюдался для линий MRC-5 и HeLa.

В работе [53] описаны молекулярные механизмы воздействия виолацеина на клетки меланомы: виолацеин вызывает значительное снижение экспрессии гистоновой деацетилазы 6, активатора пролиферации клеток меланомы. Кроме того, было обнаружено ингибирование виолацеином сигнальных путей (рецептор тирозинкиназы AXL и киназы AKT), отвечающих за уход от апоптоза. Сверхэкспрессия AXL характерна для многих типов раковых опухолей. Эти молекулярные события обуславливают ингибирование аутофагии и, как следствие, гибели клеток меланомы в результате апоптоза.

Несмотря на значительные успехи в изучении механизмов антираковой активности виолацеина, многие аспекты остаются неизученными. Так, лишь в недавней работе [54] были установлены механизмы воздействия виолацеина на клетки гепатоцеллюлярной карциномы. В данном исследовании впервые показано, что виолацеин ингибирует пролиферацию линии клеток гепатокарциномы Huh7 и Hep3B. Антипролиферативный эффект виолацеина был связан с остановкой клеточного цикла на стадии интерфазы sub-G1 и индукцией апоптотической гибели клеток. Виолацеин менял потенциал митохондриальной мембраны (MMP), увеличивал генерацию реактивных видов кислорода (ROS), активировал каспазный каскад и повышал уровень p53 и p21. Белок p21 является внутриклеточным ингибитором циклин-зависимой киназы. Динамика р21, в зависимости от внутриклеточной локализации белка, коррелирует с агрессивностью опухоли и ее способностью к метастазированию. Белок р53 индуцирует апоптоз – программируемую смерть клетки. Белок р53 находится в цитоплазме в латентном состоянии, активация его происходит не только в ответ на поражение ДНК, но также может явиться следствием многих других процессов, происходящих в клетке, в том числе активации онкогенов, гипоксии, дефицита питания, старения и др. При активации белок р53 способен инициировать независимо друг от друга 2 программы: 1 – временную остановку клеточного цикла в G1-фазе с помощью белка p21W AFI, ингибирующего циклин-зависимые киназы; 2 – стимуляцию апоптоза путем активации генов Вах или Bid – проапоптотических генов семейства Bcl-2 и/или активации образования свободных форм кислорода, способствующих выходу цитохрома из митохондрий. Виолацеин подавлял пролиферацию и образование опухолевых клеток гепатокарциномы Huh7, раковых стволовых клеток гепатомы Hep3B, снижал экспрессию ключевых маркеров стволовых клеток рака, включая CD133, Sox2, Oct4 и Nanog, путем ингибирования путей сигнала трансдуктора и активатора транскрипции-3 (STAT3)/AKT/ERK.

Исследованиями также было показано, что виолацеин повышает уровень отрицательных регуляторов прогрессии клеточного цикла p53, p27 и p21 [55] и вызывает опосредованный реактивными видами кислорода апоптоз на примере клеток рака толстой кишки [56]. Отталкиваясь от полученных Мело [57] результатов, показавших, что клетки линии HL60 промиелоцитарной лейкемии реагируют на виолацеин как повышенной гибелью клеток, так и снижением клеточной пролиферации, Феррейра с соавт. [50] раскрыли механизм этого действия, показав, что виолацеин активирует сигнал фактора некроза опухоли (TNF). Поскольку данный эффект оказался специфичен для этих клеток (авторы не обнаружили аналогичного эффекта в клетках линий U937 или K562), был сделан вывод о том, что виолацеин является представителем нового класса цитотоксических препаратов, которые опосредуют апоптоз путем специфической активации сигнальной трансдукции рецептора TNF 1. В клетках HL60 воздействие виолацеина привело к фосфорилированию p38 MAP-киназы, повышению регуляции пути NF-κB и активации каспазы.

MAP-киназа p38 играет основную роль во множестве сигнальных путей, которые вовлечены в инициацию и подержание хронического длительного воспаления при заболеваниях человека. MAP-киназу p38 активирует ряд провоспалительных цитокинов. Эта активация приводит к накоплению и высвобождению дополнительных провоспалительных цитокинов. Окислительный стресс является наиболее сильным специфическим стрессом, активирующим p38 MAPK. Аномальная активность (выше или ниже физиологической) p38 вызывает патологические стрессы в некоторых тканях, включая нейроны, кости, легкие, сердечные и скелетные мышцы, эритроциты и ткани плода. Белковый продукт протоонкогена RAS может увеличивать активность p38 и тем самым вызывать чрезмерно высокую активность фактора транскрипции NF-κB. Этот фактор транскрипции обычно регулируется внутриклеточными путями, которые интегрируют сигналы от окружающей ткани и иммунной системы. В свою очередь, эти сигналы координируют выживаемость и гибель клеток. Нарушение регуляции активности NF-κB может активировать гены, которые вызывают выживание раковых клеток, а также могут активировать гены, которые способствуют метастазированию раковых клеток в другие ткани. Таким образом, считается, что ингибиторы, направленные против MAPK p38a/p, являются эффективными в отношении снижения различных параметров воспаления в клетках и тканях.

Высокий потенциал виолацеина как антиракового агента показали исследования Мехта с соавт. [58], с использованием раковых клеточных линий U87 (глиобластома), A549 (легочная ткань) and MCF7 (молочная железа). Обработка клеток U87, A549 и MCF7 виолацеином в концентрации 1 мкМ привела к снижению клеточной пролиферации всех трех клеточных линий в течение 5 дней. В этих же клеточных линиях был проанализирован уровень экспрессии нескольких внутриклеточных сигнальных белков при воздействии виолацеином в различных концентрациях. В клеточных линиях U87, A549 и MCF7, подвергшихся воздействию виолацеина, были исследованы белки выживания и про-апоптотические белки Akt и PARP. В результате обнаружилось существенное повышение уровня расщепленного PARP в клетках опухоли мозга U87, обработанных виолацеином в концентрации 500 нМ, а также в клетках рака легких A549, обработанных 1 мкМ виолацеином. Эта же доза виолацеина достоверно повышала уровень p-44/42 MAPK в клетках линии U87, но при этом не было отмечено изменений в экспрессии про-апоптотического белка Akt. Также виолацеин не менял уровень экспрессии рибосомального белка pS6. Указанные наблюдения позволили авторам заключить, что виолацеин не оказывает влияния на сигнальную сеть трансляционного контроля, но ингибирует миграцию клеток опухоли мозга, вероятно, в результате разрушения субклеточных доменных структур актиновой филаментной сети, включая ламеллиподии и филоподии, что приводит к изменению фенотипа клеток, нарушающему их подвижность. То, что виолацеин реализует различные механизмы воздействия на клетки, подтверждается и данными Квайроса с соавт. [59], обнаружившими, что виолацеин показал селективную цитотоксичность для клеточных линий HL60 и TF1, но пути, приводящие к клеточной гибели, оказались разными для этих двух линий.

Как было упомянуто ранее [50], в клетках HL60 воздействие виолацеина привело к фосфорилированию p38 MAP-киназы, повышению регуляции пути NF-κB и активации каспазы. В клетках же TF1, по-видимому, канонический апоптотический путь не реализуется [59]. В данном случае гибель лейкозных клеток не была опосредована апоптозом и/или аутофагией, поскольку динамика биомаркеров обоих типов клеточной смерти не менялась под воздействием виолацеина. Методом профилирования кинома с использованием пептидных массивов авторы получили картину клеточной киназной активности, согласно которой про-апоптозная активность виолацеина фактически осуществляется путем ингибирования кальпаина и DAPK1 и активации PKA, AKT и PDK, за которыми следуют структурные изменения, вызванные стрессом эндоплазматического ретикулума и разрушением аппарата Гольджи, что приводит к гибели клетки. Результаты этого исследования убедительно свидетельствуют о том, что виолацеин вызывает перепрограммирование кинома, преодолевая дисфункции сигналов смерти в устойчивых к внутреннему воздействию клетках лейкемии человека. Виолацеин оказался способен обойти естественную резистентность клеток TF1, за счет активации киназ, способствующих стрессу ретикулума [59]. Противораковая активность виолацеина и близкого к нему по свойствам продигиозина достаточно полно описана в обзоре [36].

Несмотря на огромное внимание исследователей всего мира к виолацеину, однозначные выводы о механизмах его действия на данный момент отсутствуют. Однако тот факт, что виолацеин оказывает цитотоксическое действие на широкое разнообразие организмов и клеток, указывает на вероятное существование общей мишени или пути. Изучение влияния виолацеина и подобных ему соединений (бисиндолов) на генетическом уровне на модельных эукариотических организмах, таких как C. elegans, поможет в выяснении механизма его действия и позволит оценить его перспективность и потенциал в качестве клинического терапевтического средства.

Получение виолацеина. В связи с возможностью и перспективностью применения виолацеина как антиканцирогенного агента, значительный интерес представляет вопрос микробного синтеза виолацеина в масштабах, достаточных для его коммерческого использования. Это касается как подбора штаммов-продуцентов, так и, что не менее важно, условий культивирования.

Уже в достаточно ранних сообщениях подчеркивалась необходимость оптимизации состава культуральной среды и условий культивирования для оптимального выхода виолацеина. Мендес с соавт. [60] использовали так называемую методологию поверхности отклика с целью установления оптимальных параметров культивирования штамма C. violaceum. Оказалось, что триптон и дрожжевой экстракт в культуральной среде положительно коррелируют с выходом биомассы и содержанием виолацеина, в то же время использование глюкозы приводит к отрицательной корреляции.

Также изучалось влияние на продуктивность культур таких параметров, как температура, освещение, величина pH, наличие витаминов. В частности, показано, что для C. violaceum штамма BB-78 критичным для биосинтеза фактором явилось наличие в среде культивирования метионина [61].

Используя методы многофакторного эксперимента, авторы [62] определили оптимальное содержание в культуральной среде основных компонентов – мясного бульона, триптофана, нитрата калия, величины pH, объёма среды и инокулята. В результате им удалось получить выход 1.62 г/л сырого виолацеина, что значительно превысило известные до этого показатели.

Вместе с этим, при выборе продуцента необходимо учитывать тот факт, что значительная часть известных природных продуцентов виолацеина – патогенны для человека. Так, к II классу патогенности отнесены C. violaceum [63, 64] и Janthinobacterium lividum [65]. В этой связи внимание исследователей было направлено как на отбор природных непатогенных штаммов-продуцентов, так и, что более перспективно, на возможность создания безопасных генноинженерных конструкций для производства виолацеина. Так, в работе [66] детально описана процедура культивирования дрожжей Yarrowia lipolytica, несущей плазмиду pYaliA1-vioDCBAE, оптимизация процесса биосинтеза, выделение и очистка виолацеина. Клонирование генов синтеза виолацеина в дрожжах открыло перспективу эффективного масштабирования лабораторного процесса наработки этого соединения. Тонг с соавт. [67] использовали метод сборки Golden Gate для создания библиотеки штаммов, продуцирующих виолацеин в дрожжах Yarrowia lipolytica, где каждый ген в пути синтеза виолацеина контролировался тремя различными промоторами с различной силой транскрипции. Результаты показали, что сильная экспрессия генов, кодирующих VioB, VioC и VioD, способствовала наработке виолацеина с минимальным побочным продуктом дезоксивиолацеином. Оптимизации состава среды и условий культивирования позволила достичь выхода виолацеина 70.04 мг/л. Разработанные протоколы клонирования позволяют, по мнению авторов, получить доступ в том числе и к промежуточным продуктам пути биосинтеза виолацеина и использованию Y. lipolytica в качестве промышленно значимого продуцента для биосинтеза.

Фанг c соавт. [68] реконструировали метаболический путь биосинтеза виолацеина непосредственно из глюкозы в E. coli. Генный кластер пути синтеза виолацеина они скомбинировали с модифицированным триптофановым путем и получили в результате высокий уровень выхода готового продукта. В 5-литровом биореакторе при периодическом культивирования с глюкозой в качестве источника углерода использование рекомбинантной E. coli B2/pED + pVio позволило получать сырой виолацеин с выходом 1.75 г л^–1 и производительностью 36 мг л^–1 ч^–1.

Создание генноинженерных конструкций с использованием различных подходов для микробного синтеза вторичных метаболитов, биологически активных соединений привлекает все большее внимание исследователей. Произошедшие за последнее десятилетие прорывы в области геномики и развитие системной биологии дали возможность развитию методик модифицирования так называемого микробного шасси – рабочей платформы микроорганизма-продуцента, на основе которой будут создаваться новые микробные метаболические пути как с целью фундаментальных исследований, так и практического использования – для развития биотехнологических, фармацевтических, биомедицинских и др. направлений [69]. Вей Лиу с соавт. [70] экспрессировали гетерологичный путь синтеза β-каротина и виолацеина. Обычно гетерологичный метаболический путь конструируют путем генной инженерии шасси и оптимизации экзогенного пути. Зачастую это метод проб и ошибок. Авторы использовали комбинаторный метод на основе рекомбиназы (названный “SCRaMbLE-in”) для одновременного решения обеих задач. Метод включает набор рекомбиназ in vitro для быстрого создания прототипов и диверсификации экспрессии генов на уровне путей и систему перестановки генома in vivo для интеграции собранных путей в синтетический геном дрожжей, при этом комбинаторно вызывая массивные геномные перестройки в шасси хозяина. В результате были успешно собраны, диверсифицированы и интегрированы пути биосинтеза β-каротина и виолацеина в дрожжевом продуценте. Авторы позиционируют этот метод как быстрый, эффективный и универсальный для ускорения цикла манипуляций в инженерной биологии.

Часто низкий выход продукта, а также относительно ограниченный спектр природных соединений обусловлен, в том числе, их сложной химической структурой и, соответственно, непростой генетической организацией путей биосинеза. Авторы работы [71], апеллируя к успешно используемым генетическим манипуляциям [72–74], полагают, что интеграция синтетической биологии с синтетической химией позволяет получить доступ к гораздо более разнообразному спектру не имеющих прямых аналогов в природе активных соединений, и это должно ускорить открытие новых терапевтических средств. Так, учитывая тот факт, что фермент VioA обладает достаточно широкой субстратной специфичностью по отношению к аналогам триптофана, авторы, используя неочищенный клеточный экстракт и галогенированные производные триптофана, получили в конечном итоге 26 новых аналогов виолацеина или дезоксивиолацеина, обладающих высокой биологической активностью.

Применение последних технологических достижений в области написания и редактирования генома, имитирующих процесс естественной эволюции на геномном уровне, методологии структурных перестроек, перспективность таких подходов отражены в ряде интересных работ [36, 75, 76].