Прикладная биохимия и микробиология, 2022, T. 58, № 5, стр. 484-499

МЕТОДИКА

Реактивы. В работе были использованы следующие реактивы: диэтилфталат, дибутилфталат, диэтилгексилфталат фирмы “Sigma-Aldrich” (США). Другие материалы и растворители квалификации “х. ч.” и “ч. д. а.” были приобретены у российских производителей.

Культуры и условия культивирования. Штаммы базидиомицетов Trametes hirsuta LE-BIN 072, Steccherinum ochraceum LE-BIN 3174, Crucibulum laeve LE-BIN 1700 и Agrocybe praecox LE-BIN 2506 получены из Коллекции культур Ботанического института им. В.Л. Комарова (Санкт-Петербург, Россия).

Для оценки роста в присутствии ЭФК и определения общей оксидазной активности (ОА) грибы культивировали на твердой среде Мальтекс-агар, следующего состава (г/л): неохмеленный солодовый экстракт Maltax 10 (“OY Maltax AB”, Финляндия) – 50; агар-агар – 20, рН 6.0. В стерильную охлажденную до 40–50°С среду вносили ЭФК в концентрациях: 0.5, 1.0 и 1.5 г/л. Среды с внесенными ЭФК обрабатывали в ультразвуковой бане при 50°С в течение 5 мин. На подготовленные чашки Петри засевали мицелиальные блоки (d = 8 мм) грибов белой гнили и инкубировали в термостате при 25°С, измеряя в процессе роста диаметр мицелиального мата.

Инокулят грибов выращивали стационарно в 750 мл конических колбах с фарфоровыми бусами на глюкозо-пептонной (ГП) среде следующего состава (г/л): пептон – 3.0, глюкоза – 10, KH₂PO₄ – 0.6, K₂HPO₄ · 3H₂O – 0.4, MgSO₄ · 7H₂O – 0.5, CaCl₂–0.5, MnSO₄ · 5H₂O – 0.05, ZnSO₄ – 0.001, FeSO₄ – 0.0005, при 25°С 10–14 сут в зависимости от скорости роста гриба. Перед засевом инокулят измельчали бусами 20 мин при 180 об./мин до получения однородной суспензии, которую затем стерильно вносили в колбы для культивирования в объеме 10%.

Для изучения накопления биомассы и способности к биодеструкции ЭФК грибы выращивали глубинным способом на ГП среде на роторной качалке при 180 об./мин и 27°C. Выросшие грибные пеллеты отделяли фильтрованием и промывали 0.02%-ным стерильным водным раствором Твин 80, после чего 10 г грибной биомассы стерильно переносили в конические колбы на 250 мл со 100 мл жидкой минеральной среды следующего состава (г/л): KH₂PO₄ – 0.6, K₂HPO₄ – 0.4, MgSO₄ ⋅ 7H₂O – 0.5, CaCl₂ – 0.05, MnSO₄ – 0.05, ZnSO₄ – 0.001, FeSO₄ – 0.0005, NaNO₃ – 3.0, глюкоза – 10.0, Твин 80 – 0.2. Перед внесением грибной биомассы в опытные колбы добавляли растворы ЭФК в концентрации 1.0 г/л, инкубировали на роторной качалке при 100 об./мин и 25°C. Образцы культуральной жидкости (КЖ) отбирали на 3, 6, 10 сут инкубации и хранили при –73°C до проведения анализа. Грибную биомассу отделяли фильтрованием и высушивали при температуре 100 ± ± 5°С до постоянной массы.

Скорость радиального роста (u_r). Скорость радиального роста рассчитывали по графику зависимости диаметра колонии от времени роста с анализом линейной регрессии. Диаметр измеряли линейкой с первых суток инкубации до момента, когда гриб полностью покроет поверхность чашки Петри [20].

Общая эстеразная активность (ЭА). Оценку эстеразной активности в КЖ проводили при культивировании на жидкой минеральной среде с содержанием фталатов 1.0 г/л. Активность определяли спектрофотометрически на спектрофотометре PerkinElmer Lambda 35 (“PerkinElmer”, США), используя п-нитрофенил бутират в качестве субстрата. Реакцию проводили в натрий ацетатном буфере, рН 4.5 при 40°С в течение 10 мин. Реакцию останавливали натрий фосфатным буфером, рН 7.3, оптическую плотность определяли при длине волны λ = 400 нм. Расчет эстеразной активности проводили по формуле:

где R_Е – предварительное разбавление КЖ перед внесением в раствор субстрата;

А_400(S) – контроль, в котором вместо КЖ использовали воду; А_400(Е) – контроль без внесения в реакционную смесь субстрата.

Определение общей оксидазной активности (ОА). ОА определяли в КЖ при выращивании грибов на жидкой минеральной среде с содержанием фталатов 1.0 г/л. Активность определяли спектрофотометрически на спектрофотометре PerkinElmer Lambda 35 при длине волны λ = 436 нм в 0.1 М натрий-ацетатном буфере, рН 4.5, как описано в работе [21] с использованием раствора 2,2'-азино-бис-(3-этилбензтиозолин-6-сульфокислоты) диаммониевой соли (АБТС) в качестве хромогенного субстрата. За 1 условную единицу активности принимали увеличение оптической плотности в 1 мл реакционной смеси за 1 мин.

Тонкослойная хроматография (ТСХ). Качественную оценку содержания ЭФК в КЖ грибов в процессе культивирования проводили методом ТСХ. Для этого 3 мл КЖ экстрагировали равным объемом дихлорметана (ДХМ), процедуру повторяли трижды. Полученный экстракт упаривали досуха и перерастворяли в 200 мкл ДХМ. По 10 мкл полученного экстракта наносили на пластину для аналитической хроматографии TLC Silica gel 60 F254 (“Merck”, Германия). В качестве контроля использовали растворы коммерческих ЭФК в ДХМ (по 10 мкг на точку). Элюцию проводили восходящим методом, используя в качестве подвижной фазы: 1) смесь ДХМ и гексана (2 : 1 об./об.) для предварительной оценки наличия ЭФК и продуктов деградации; 2) ДХМ для визуализации продуктов деградации, более полярных, чем исходные ЭФК. Визуализацию проводили в УФ-свете при длине волны 254 нм. Пластину обрабатывали 1%-ным раствором ванилина в 10%-ном водном растворе HClO₄ и проявляли при температуре 100–110°С. Чувствительности метода ТСХ было достаточно для наблюдения за убыванием исходных ЭФК в процессе культивирования, а также визуализации в основном полярных продуктов биодеструкции.

Для разделения смеси полярных продуктов с целью их идентификации использовали препаративную ТСХ. Для этого сухой остаток, полученный после упаривания экстракта КЖ, растворяли в минимальном объеме ДХМ, наносили раствор на пластинки для ТСХ полосой на линии старта и хроматографировали восходящим методом в ДХМ. В УФ-свете пластинку делили на зоны по различным значениям Rf. Соединения элюировали отдельно из каждой зоны с использованием ДХМ. Элюаты упаривали досуха. Для контроля полученных элюатов проводили ТСХ. Идентификацию продуктов в образцах проводили с помощью ГХ-МС анализа.

Газовая хроматография с масс-спектрометрической детекцией (ГХ-МС). Оценку степени и скорости биодеструкции ЭФК в процессе культивирования грибов белой гнили проводили после анализа КЖ с использованием метода ГХ-МС. Для этого получали гексановые экстракты образцов КЖ (1 : 1 об./об.) и анализировали методом газо-жидкостной хроматографии в двух режимах: регистрация ионных масс в полном спектре (TIC, диапазон масс m/z 45–400) и регистрация по характерному для ЭФК основному иону (MIC, m/z = 149 – протонированный фталевый ангидрид).

Анализ проводили на газовом хроматографе GC-MS QP 2010 Ultra EI (“Shimadzu”, Япония), снабженном автоматическим устройством ввода пробы и квадрупольным масс-спектрометрическим детектором. Сбор данных и обработку хроматограмм проводили с помощью программного обеспечения LabSolutions GCMSsolution (“Shimadzu”, Япония). Использовали колонку MDN-5 30 м × 250 мкм × 0.25 мкм (“Supelco”, США), в качестве подвижной фаза – гелий, скорость потока элюента – 1 см³/мин, деление потока 1 : 5. Объем вводимой пробы 1 мкл, температура термостата 120°С, температура инжектора 200°С. Температурный градиент: 120°С выдержка 1 мин; с 120 до 280°С со скоростью 10°С/мин, изотерма 3 мин.

Все измерения проводили в 3 биологических повторностях. Результаты представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение. Статистическая обработка данных проводилась с использованием метода дисперсионного анализа. При обнаружении достоверного значения (р < 0.05) F-статистики, различия между индивидуальными средними были оценены с использованием теста множественного сравнения Тьюки (р ≤ 0.05).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Показано, что базидиальные грибы белой гнили могут использоваться для биоремедиации сточных вод и почв, загрязненных различными органическими соединениями. Благодаря своему уникальному комплексу секретируемых ферментов, они способны модифицировать даже такие труднодеградируемые полимеры, как лигнин, входящий в состав древесины. Известно, что такая высокая эффективность обусловлена существенными различиями в составе и композиции секретируемых мультиферментных комплексов (содержащих та-кие ферменты, как лакказа, лигнинпероксидаза, Mn-зависимая пероксидаза) у грибов из разных экофизиологических групп, участвующих на разных стадиях разложения древесины [22]. Этот факт позволил предположить, что такие различия могут обуславливать особенности деградации ЭФК разными представителями базидиомицетов. В настоящей работе был проведен сравнительный анализ способности грибов белой гнили – представителей различных экофизиологических групп, а именно: Trametes hirsuta (первичные дереворазрушающие сапротрофы), Steccherinum ochraceum (вторичные дереворазрушающие сапротрофы), Crucibulum laeve (подстилочные сапротрофы), Agrocybe praecox (гумусовые сапротрофы), к деструкции трех распространенных ЭФК.

Влияние ЭФК на рост грибов белой гнили. Хорошо известно, что начальная концентрация ЭФК может влиять на способность к их биодеградации различными организмами [18, 20]. Экстремальные концентрации загрязняющих веществ трудно поддаются деструкции большинством организмов. Для того, чтобы определить рабочий диапазон концентраций ЭФК, в данном исследовании была проведена предварительная оценка способности выбранных для исследования грибов к росту на агаризованных средах, содержащих разные концентрации фталатов. На рис. 2–4 приведены кривые роста грибных культур на среде с ДЭФ, ДБФ и ДЭГФ, в табл. 1 представлены скорости радиального роста грибов.

Эксперимент показал, что при увеличении концентрации ДЭФ в среде скорость роста всех штаммов замедлялась, причем на среде с концентрацией ДЭФ 1.5 г/л существенная задержка роста по сравнению с контролем наблюдалась у T. hirsuta, S. ochraceum и A. praecox (в 22, 66 и 5 раз соответственно), а гриб C. laeve не рос на среде с такой концентрацией ДЭФ. Следует отметить, что наиболее устойчивыми к присутствию ДЭФ в среде оказались T. hirsuta и A. praecox – их рост на контрольной среде и среде с 0.5 г/л ДЭФ не отличался, а на среде с ДЭФ в концентрации 1 г/л и выше рост гриба T. hirsuta замедлялся в большей степени, по сравнению с A. praecox. Все штаммы хорошо росли на среде с ДБФ. Наличие этого фталата в среде не оказывало влияния на рост T. hirsuta, на рост S. ochraceum и A. praecox влияние было незначительное, при этом рост C. laeve замедлялся при возрастании концентрации ДБФ в среде.

При выращивании грибов на среде с ДЭГФ наблюдали увеличение скорости роста T. hirsuta, по сравнению с контрольной средой, увеличение концентрации ДЭГФ в среде также ускоряло рост грибов A. praecox и C. leave, но замедляло рост S. ochraceum по сравнению с контролем. Увеличение скорости радиального роста на средах с добавлением ДЭГФ было ранее отмечено также для таких грибов белой гнили как Pleurotus pulmonarius, Pleurotus ostreatus и Lentinula edodes [18, 20], причем увеличение содержания ДЭГФ приводило к увеличению скорости роста. Авторы предположили, что грибы могут использовать фталаты в качестве источника углерода и энергии, так как наблюдалась четкая корреляция между диаметром гиф и концентрацией фталатов в среде.

Таким образом, для последующих экспериментов была выбрана концентрация ЭФК 1 г/л, которая, как было показано выше, не приводила к значительному ингибированию роста грибов.

На следующем этапе исследовали способность грибов к биодеструкции ДЭФ, ДБФ и ДЭГФ в жидких средах. При культивировании на минеральной среде с глюкозой и ЭФК в концентрации 1 г/л, наблюдали увеличение биомассы T. hirsuta как на контрольной среде, так на среде с ДЭГФ (рис. 5а), причем прирост биомассы продолжался вплоть до 10 сут культивирования. На среде с ДБФ биомасса увеличивалась к 6 сут, но далее не менялась. Биомасса S. ochraceum на среде с ДБФ и ДЭГФ увеличивалась к 3 сут на 8.1 и 22.6% соответственно, по сравнению с контрольной средой, но к 10 сут мицелий разрушался, причем более интенсивно в присутствии ДБФ (рис. 5б). Однако при культивировании как первичных, так и вторичных сапротрофов в присутствии ДЭФ количество биомассы оставалось на уровне исходного значения (рис. 5а, б), что согласуется с результатами по ингибированию роста этих грибов на агаризованных средах с ДЭФ (рис. 2а, б).

Наиболее чувствительным к присутствию ЭФК оказался подстилочный сапротроф C. laeve. Так, в присутствии ДБФ прирост биомассы не наблюдался, а в присутствии ДЭФ – мицелий гриба вовсе разрушался в ходе культивирования. На среде с ДЭГФ прирост биомассы наблюдался к 3 сут, далее биомасса резко уменьшалась (рис. 5в). Для гумусового сапротрофа A. praecox максимум биомассы на минеральных средах с ЭФК наблюдали на 3 сут культивирования, в отличие от контрольной среды (6 сут), но при этом он не превышал максимума биомассы в контроле (рис. 5г). На минеральной среде с ДЭФ был отмечен все же незначительный прирост биомассы A. praecox в ходе культивирования, которого не наблюдали у T. hirsuta и S. ochraceum.

Таким образом, в присутствии ЭФК, максимальный прирост биомассы грибов был отмечен на среде с ДЭГФ, однако только у S. ochraceum он был больше, чем на контрольной среде. В работе [23] показано, что биомасса Fusarium culmorum увеличивалась в присутствии ДБФ, по сравнению с контролем. Авторы предположили, что это связано с использованием фталата в качестве источника углерода, что, однако зависело от используемого организма и сложности структуры фталата.

Необходимо отметить существование различий в характере роста грибов на богатой среде Мальтекс-агар и жидкой минеральной среде. Так, в присутствии 1 г/л ДЭГФ скорость роста S. ochraceum на агаризованной среде замедлялась по сравнению с контролем, а в жидкой среде, наоборот, прирост биомассы был больше, по сравнению с контролем. У C. laeve на Мальтекс-агаре скорость роста увеличивалась, а на жидкой среде биомассы было значительно меньше, чем в контроле. Таким образом, характер роста S. ochraceum и C. laeve менялся в зависимости от состава среды культивирования. Для T. hirsuta и A. praecox такой зависимости не было выявлено. Скорость роста и накопление биомассы у T. hirsuta на обоих средах не отличалось от контроля, а у A. praecox скорость роста и прирост биомассы увеличивались в присутствии ДЭГФ.

Различия в характере роста грибных культур на разных средах в присутствии ЭФК могут быть связаны, в первую очередь, с синтезом ими специфического комплекса ферментов, который может сильно отличаться в зависимости от вида гриба и состава среды культивирования, а также, с различными путями деградации фталатов [20, 24–27].

Кроме того, в ходе жидкофазного культивирования грибов на средах с ЭФК наблюдали различия в изменении рН по сравнению с контрольной средой (рис. 6). Так, например, при культивировании S. ochraceum с ДЭФ к 10 сут рН резко снижался до 3.7 (по сравнению с исходным значением рН среды 4.9), в то время как на средах с другими ЭФК, а также контрольной, рН возрастал в процессе культивирования (рис. 6б). У грибов C. laeve и A. praecox также различалась динамика изменения рН на среде с ДЭФ, однако при этом показатель практически не менялся по сравнению с остальными вариантами эксперимента (рис. 6в, 6г). Для гриба T. hirsuta на всех средах сохранялась общая тенденция к снижению значения рН в процессе культивирования (рис. 6а), причем наиболее резкое падение происходило на 3 сут в присутствии ДЭФ.

Закисление среды в процессе ферментативной деструкции ЭФК можно объяснить образованием продуктов гидролиза. Их присутствие тормозит деградацию ЭФК (эфиры гидролизуются в щелочной среде более интенсивно, чем в более кислой). Предыдущие исследования показали, что разложение ДЭФ и ДБФ зависит от значения pH. Так, скорость деградации ДЭГФ штаммом Pseudomonas sp. быстро увеличивалась, когда pH среды увеличивался до 8.5 [13], то же показано для ДБФ штаммом Agrobacterium sp. при увеличении рН с 5 до 8 [28].

Было показано, что T. hirsuta и A. praecox в динамике закисляли среду до 4.3–4.5 и 3.4–4.4 соответственно, что коррелировало с существенным падением у этих грибов ЭА к 10 сут культивирования. У S. ochraceum и C. laeve, напротив, наблюдалось защелачивание среды в ходе культивирования и соответствующее этому постепенное нарастание эстеразной активности. Однако, не смотря на различную динамику рН и ЭА, для всех 4 грибов на 10 сут степень деградации ДБФ и ДЭГФ составляла 86–99%. Вероятно, в процессах биодеструкции у разных грибов участвуют разные ферменты и механизмы. Так, например, при действии марганец пероксидаз, которые могут принимать участие в деградации ЭФК, отмечается образование свободных радикалов при низких рН, в то время как гидролитическое расщепление сложноэфирной связи между алкильными цепями и ароматическим кольцом ЭФК с образованием сложных моноэфиров, а затем и фталевой кислоты под действием эстераз эффективнее происходит в щелочных условиях.

Определение активности ферментов в КЖ грибов. Известно, что от метаболических особенностей штамма, субстрата и условий культивирования зависит уровень экспрессии ферментов. При выращивании гриба L. edodes авторы [20] показали увеличение активности внутри- и внеклеточных лакказ и эстераз на среде с ДЭГФ, причем активность лакказы была выше по сравнению с активностью эстеразы при всех концентрациях ДЭГФ. При этом, для других грибов, в частности P. ostreatus, выращенных в присутствии бутилбензилфталата, а также ДЭГФ, напротив, активность лакказы была ниже ЭА [24, 25]. Аналогичные результаты были получены для аскомицетов Fusarium culmorum и Trichoderma harzianum в присутствии ДЭГФ [16]. Таким образом, соотношение секретируемых ферментов может непосредственно влиять на эффективность деградации того или иного ЭФК. Поскольку ЭА и ОА играют важную роль в способности грибов к деструкции сложнодеградируемых соединений, была проведена их оценка при культивировании грибов на жидкой минеральной среде (рис. 7, 8 ).

Показано, что у T. hirsuta максимальная ЭА достигалась в 1 сут в присутствии всех ЭФК, далее на 3 сут культивирования происходило увеличение ОА, особенно в присутствии ДЭФ. После 3 сут ОА T. hirsuta в присутствии ДБФ и ДЭГФ продолжала постепенно расти, а в среде с ДЭФ, наоборот, уменьшаться, что могло быть связано с токсичностью ДЭФ для гриба.

Для S. ochraceum пик ЭА достигался на 2–3 сут, при этом ОА возрастала плавно к 10 сут. Напротив, для C. leave и A. praecox пики ЭА и ОА совпадали и приходились на 10 и 2 сут соответственно. Наибольшая ЭА достигалась в присутствии ДБФ для грибов T. hirsuta, S. ochraceum и A. praecox, в то время как для C. leave – в присутствии ДЭГФ. При этом максимальные значения ЭА были получены для C. leave (0.16 усл. ед./мл) и A. praecox (0.09 усл. ед./мл) в присутствии ДЭГФ и ДБФ соответственно. Биосинтез ферментов может индуцироваться увеличением концентраций ЭФК в среде [18]. Показано, что присутствие ДБФ индуцирует ЭА у гриба Fusarium culmorum [27], что согласуется с результатами настоящей работы для всех грибов, кроме C. laeve. Однако для P. ostreatus также была показана индукция ЭА в присутствии ДЭГФ [25], что аналогично результату, полученному в настоящей работе для C. laeve.

В присутствии ДЭФ ОА уменьшалась у всех грибов, по сравнению с контролем, кроме T. hirsuta, в КЖ которого активность в присутствии ДЭФ наоборот, существенно увеличивалась. Это согласуется с данными по скорости роста T. hirsuta на среде с ДЭФ и с вышеописанными результатами по накоплению биомассы. Таким образом, гриб T. hirsuta – наиболее устойчив к присутствию ДЭФ по сравнению с остальными, вероятно, за счет более эффективного комплекса секретируемых оксидаз или других вспомогательных ферментов.

Известно, что на начальной стадии деградации ЭФК ключевыми ферментами являются эстеразы [29], осуществляющие гидролитическое расщепление сложноэфирной связи между алкильными цепями и ароматическим кольцом ЭФК с образованием сложных моноэфиров, а затем фталевой кислоты (ФК) и спиртов. Далее может происходить расщепление бензольного кольца ФК с образованием метаболитов, образующихся при разложении ФК и спиртов. Во вторую стадию могут быть вовлечены такие ферменты, как декарбоксилазы, оксигеназы и оксидазы/дегидрогеназы [26, 27, 30, 31].

Анализ продуктов деструкции ЭФК. Качественный анализ экстрактов КЖ штаммов грибов методом ТСХ показал, что скорость биоразложения ДЭФ у всех грибов была значительно ниже, по сравнению с другими ЭФК, что коррелирует со скоростью их роста на твердой агаризованной среде и накоплением биомассы на жидкой среде с ДЭФ. Существенного убывания ДЭФ во времени не было зафиксировано, продукты реакции не были визуализированы (результаты не представлены), вероятно по причине их крайне низкого содержания. Очевидно, что самым трудно деградируемым и токсичным для грибов белой гнили оказался ДЭФ, что подтверждается известными значениями токсичности использованных ЭФК: токсичность убывает в ряду ДЭФ > ДБФ > ДЭГФ [6]. Похожие результаты были получены в работе [15], в которой грибы белой гнили P. ostreatus и T. versicolor менее эффективно деградировали ДЭФ, по сравнению с диметилфталатом и бутилбензилфталатом. Результаты анализа экстрактов КЖ грибов с ДБФ и ДЭГФ методом ТСХ приведены на рис. 9 .

Показано, что у всех грибов в процессе культивирования с ДБФ и ДЭГФ менялось количественное соотношение продуктов реакции, а также их спектр. Поскольку, согласно результатам ТСХ, скорость деградации ЭФК убывала в порядке ДЭГФ > ДБФ > ДЭФ, и для ДЭФ скорость была очень низкая, а продукты не визуализировались, количественную оценку биодеструкции ЭФК с использованием метода ГХ-МС в дальнейшем проводили только для ДБФ и ДЭГФ. Результаты представлены в табл. 2.

Полученные результаты показали высокую эффективность разложения ДЭФГ (более 98%) грибами T. hirsuta, S. ochraceum и A. praecox, а ДБФ (более 96%) – C. leave за 10 сут.

Несмотря на то, что в литературе описано снижение скорости биодеградации фталатов с увеличением длины алкильной цепи, а также зависимость от ее разветвленности [15, 19, 23, 32], в настоящей работе показано, что у гриба S. ochraceum скорость деградации ДЭГФ была существенно выше, чем ДБФ (табл. 2). Для остальных грибов скорость деградации ДБФ на 3 сут была выше, чем ДЭГФ, но все же к 10 сут для грибов T. hirsuta и A. praecox более высокая степень деградации была получена для ДЭГФ. Только результаты с C. leave согласовались c данными литературы. При этом увеличение концентрации ДБФ в среде в небольшой степени ингибировало рост C. leave (рис. 3в), в отличие от гриба P. ostreatus, рост которого не ингибировался повышением концентрации ДБФ в среде (до 1000 мг/л) [23].

Поскольку скорость биодеградации ДЭГФ была выше у дереворазрушающих сапротрофов, а ДБФ – у подстилочных сапротрофов (более 90% на 6 сут, табл. 2), по 1 представителю этих групп (T. hirsuta и C. leave) было выбрано с целью определения продуктов биодеградации ЭФК. Для накопления продуктов деградации ЭФК в количествах, необходимых для их идентификации, предварительно проводили разделение экстрактов методом препаративной ТСХ, после чего элюаты анализировали методом ГХ-МС. Для анализа в этом случае использовали экстракты КЖ C. leave на 3 сут для обоих субстратов, а T. hirsuta – на 3 сут с ДБФ и 6 сут с ДЭГФ (образцы, где продукты деградации ЭФК визуализировались методом ТСХ).

В результате ГХ-МС-анализа в контрольных образцах C. laeve (при отсутствии фталатов) был обнаружен более широкий спектр метаболитов (всего 24), по сравнению с контрольными образцами T. hirsuta (всего 13 и 19 на 3 и 6 сут соответственно), представленный в основном эфирами карбоновых кислот, а также спиртами и альдегидами (рис. 10 ).

Следует отметить, что на 6 сут культивирования в КЖ T. hirsuta расширялся спектр синтезируемых грибом спиртов и эфиров бензойной кислоты. В присутствии фталатов образование большинства характерных для грибов метаболитов прекращалось: на 3 сут в образце КЖ C. laeve с ДБФ и ДЭГФ было обнаружено 7 и 11 соединений соответственно, а на 3 и 6 сут в образцах T. hirsuta с ДБФ и ДЭГФ – 5 и 3 соединения соответственно (табл. 3). Причем всего 3 соединения из контрольных образцов были идентифицированы в опытных образцах с фталатами, а именно: пентадециловый эфир акриловой кислоты, обнаруженный в контрольных образцах КЖ обоих грибов, идентифицирован в КЖ и C. laeve с ДЭГФ, и T. hirsuta с ДБФ и ДЭГФ; пентадециловый эфир пропионовой кислоты, найденный в контрольном образце T. hirsuta, также идентифицирован в КЖ T. hirsuta с ДБФ; 4-пропилбензальдегид, найденный в контрольном образце КЖ C. laeve – идентифицирован в КЖ C. laeve с обоими ЭФК. В присутствии ЭФК для C. laeve было характерно появление кетонов и отсутствующих в контрольных КЖ спиртов (табл. 3).

В КЖ грибов T. hirsuta и C. leave обнаружен 2,6-дитретбутил-4-метилфенол (ионол), отсутствующий в контрольных образцах. Это соединение применяется в качестве антиоксиданта при производстве пищевых продуктов (пищевая добавка E321), а также является исходным соединением для синтеза различных пространственно затруднённых фенолов, многие из которых обладают биологической активностью [33]. Ионол часто встречается в качестве вторичного метаболита, продуцируемого различными группами организмов, в частности грибами, однако является аутотоксичным [34]. Имеющиеся на сегодняшний день данные не объясняют, почему организмы вырабатывает такой аутотоксичный метаболит. Вероятно, индукция биосинтеза ионола грибами является своеобразной защитной реакцией грибов от свободных радикалов, образующихся при ферментативном окислении в ходе деградации ЭФК. Однако, ввиду своей аутотоксичности, накопление этого соединения в ходе биотрансформации ДБФ может приводить к торможению роста гриба.

Кроме того, при культивировании грибов в присутствии ДБФ и ДЭГФ в КЖ грибов был обнаружен ДЭФ, из чего можно сделать вывод, что он являлся промежуточным продуктом биотрансформации этих ЭФК обоими грибами. В работе [23] при изучении пути деградации ДБФ дереворазрушающим грибом белой гнили P. ostreatus не было обнаружено ДЭФ в качестве промежуточного метаболита, однако при бактериальной трансформации этого фталата показана возможность его образования из ДБФ [32]. Вероятно, замедление роста грибных культур при выращивании на среде с ДБФ, может быть также связано с образованием в качестве промежуточного трудно деградируемого ДЭФ из-за его высокой токсичности, особенно в условиях высоких концентраций ЭФК.

В работе [35] в качестве основного метаболита при биодеструкции ДБФ бактериями Pseudomonas sp. и Comamonas sp. также был идентифицирован ДЭФ, который может быть получен путем реакции переэтерификации с участием липаз. Однако авторам, как и в настоящей работе, не удалось обнаружить такой основной метаболит деструкции ЭФК как фталевая кислота, предположительно, из-за короткого периода полураспада этого соединения.

Ранее показан возможный механизм деструкции ЭФК с помощью эстераз, приводящий к образованию 1,3-изо-бензофурандиона (ИБФ) при гидролизе сложного эфира с последующим спонтанным образованием оксомостика и дальнейшее превращение ИБФ в различные моноэфиры путем переэтерификации при наличии в среде спиртов [36]. Перечень возможных продуктов превращения ИБФ зависит от спектра синтезируемых грибами ферментов. Возможно, именно таким путем происходит образование ДЭФ при трансформации ДБФ и ДЭГФ. В КЖ гриба C. leave на 3 сут ЭА преобладала над ОА. Вероятно, идентифицированные в ней соединения, могут быть продуктами реакций переэтерификации моноэфиров, например 1-гидроксициклогексил фенил кетон. Поскольку одновременно с ЭА все же фиксируется и ОА, то параллельно могут проходить свободнорадикальные реакции с образованием целого спектра разнообразных соединений (подобно 2-гидрокси-изо-бутирофенону у C. leave), некоторые из которых трудно идентифицировать (вероятно, таким соединением может являться не идентифицированное соединение с RT2126, обнаруженное в КЖ T. hirsuta).

Таким образом, исследование показало, что грибы белой гнили являются перспективными биодеструкторами широко распространенных токсичных ЭФК, различающихся структурой и гидрофобностью. Полученные результаты подтвердили, что механизмы разрушения ЭФК различаются у грибов в зависимости от экофизиологической группы. Различия в путях деградации ЭФК грибами белой гнили могут быть связаны с секрецией уникальных ферментных комплексов, участвующих в процессах биодеструкции. Показано, что в процессе культивирования динамика ОА и ЭА T. hirsuta ближе к A. praecox, а S. ochraceum – к C. laeve. Очевидно, что присутствие ЭФК изменяло метаболический профиль гриба. Вероятно, вторичные ксилотрофы могут быть ближе по своему метаболизму к гумусовым и подстилочным грибам, в отличие от первичных ксилотрофов.

Полученные результаты могут быть использованы для дальнейших исследований, направленных на установление механизмов биоразложения ЭФК различными грибами, а также при отборе конкретных штаммов базидиальных грибов для использования с целью биоремедиации загрязненных фталатами сред.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда, грант РНФ 21-14-00306.