1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Прикладная биохимия и микробиология
  4. T. 58, № 4, 2022

Прикладная биохимия и микробиология, 2022, T. 58, № 4, стр. 366-373

Новый ферментный препарат, содержащий полисахаридмонооксигеназу и β-глюкозидазу – синергетические добавки к целлюлазам

М. В. Семенова 1, *, А. В. Гусаков 2, В. Д. Телицин 2, В. Ю. Матыс 3, Т. В. Бубнова 3, В. А. Немашкалов 3, А. М. Рожкова 1, А. П. Синицын 1, 2

1 Федеральный исследовательский центр “Фундаментальные основы биотехнологии” РАН
119071 Москва, Россия

2 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, химический факультет
119991 Москва, Россия

3 Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН
142290 Пущино, Россия

* E-mail: margs@mail.ru

Поступила в редакцию 11.02.2022
После доработки 18.02.2022
Принята к публикации 28.02.2022

Полный текст (PDF)

Аннотация

На основе реципиентного штамма Penicillium verruculosum В1-537 (ΔniaD) с использованием промотора гена целлобиогидролазы I создан продуцент гомологичной литической полисахаридмонооксигеназы (ПМО) и гетерологичной β-глюкозидазы Aspergillus niger (БГ) – вспомогательных ферментов для “базового” целлюлазного комплекса, состоящего из эндоглюканаз и целлобиогидролаз. Получен ферментный препарат ПМО-БГ, содержащий 34% ПМО и 43% БГ, который был использован в качестве источника вспомогательных ферментов, увеличивающих на 20–100% эффективность действия базовых целлюлаз P. verruculosum при биоконверсии различных видов целлюлозосодержащего сырья: микрокристаллической целлюлозы, предобработанного щелочью тростника и полубеленой сульфатной лиственной целлюлозы АО “Архангельский ЦБК”.

Ключевые слова: полисахаридмонооксигеназа, β-глюкозидаза, целлюлазы, синергизм, биоконверсия

Основную часть органического материала на Земле составляет возобновляемая растительная биомасса, одним из компонентов которой является целлюлоза. Ферментативный гидролиз целлюлозы осуществляется комплексом “базовых” целлюлаз – целлобиогидролаз (ЦБГ) и эндоглюканаз (ЭГ), осуществляющих гидролиз до глюкозы, целлобиозы и целлоолигосахаридов. К вспомогательным ферментам, усиливающим действие целлюлаз, относятся β-глюкозидазы (БГ), гидролизующие целлобиозу и целлоолигосахариды до глюкозы, а также литические полисахаридмонооксигеназы (ПМО), катализирующие окислительную деструкцию основных цепей целлюлозы, способствующую аморфизации ее кристаллических зон.

Целлюлолитические грибы родов Hypocrea (Trichoderma) и Penicillium наиболее часто используются в качестве источника ферментов для биоконверсии лигноцеллюлозных материалов (ЛЦМ) [1–5]. Для ферментных комплексов, продуцируемых этими грибами, характерна несбалансированность по составу между “базовыми” целлюлазами и вспомогательными ферментами. Для решения этой проблемы предложено, например, вводить дополнительно к “базовым” целлюлазам 5–10% ферментного препарата (ФП), содержащего БГ и/или ПМО [6, 7]. Другой подход подразумевает встройку в геном грибов генов, кодирующих гомологичные или гетерологичные БГ или ПМО [8–10]. ФП, полученные из продуцентов в результате гетерологичной экспрессии гена БГ Aspergillus niger (bgl1) или гена ПМО Trichoderma reesei (lpmo) в штамме-реципиенте P. verruculosum, продемонстрировали синергетическое увеличение эффективности действия целлюлазного комплекса P. verruculosum при ферментативном гидролизе различных видов ЛЦМ [9, 11–14].

Цель работы – осуществление одновременной экспрессии генов lpmo и bgl1 в реципиентном штамме P. verruculosum В1-537 (ΔniaD) для создания продуцента P. verruculosum ПМО-БГ, получение на его основе нового ФП с активностями как ПМО, так и БГ и его использование вместе с “базовыми” целлюлазами P. verruculosum В1-537 при гидролизе ЛЦМ.

МЕТОДИКА

Штаммы и ферментные препараты. В работе были использованы штаммы: P. verruculosum В1-537 (ΔniaD) (реципиентный штамм – продуцент “базовых” целлюлаз [15, 16]), P. verruculosum ПМО-БГ (продуцент ПМО и БГ), P. verruculosum ПМО (продуцент ПМО [17]) и P. verruculosum F10 (продуцент БГ [6]).

Для получения комплексного ферментного препарата, содержащего ПМО и БГ, реципиентный штамм P.verruculosum 537 (ΔniaD) был трансформирован плазмидами pСBHI-BGL [6] и pCBHI-PMO [17], полученными ранее. Трансформированные протопласты высевали на селекционную среду с 10 мМ нитрата натрия. В качестве котрансформационной плазмиды, обеспечивающей прототрофность рекомбинантных штаммов после трансформации, была взята плазмида pSTA10, несущая ген niaD, кодирующий нитратредуктазу A. niger. Для трансформации использовался протокол трансформации для P. canescens с модификациями для штамма P. verruculosum [18]. Соотношение плазмид pCBHI-BGL, pCBHI-PMO и pSTA10 было 3 : 3 : 1 (мкг/мкл). Частота событий одновременной трансформации реципиентного штамма двумя плазмидами составляла 15 трансформантов на 1 мкг смеси экзогенных ДНК. Наличие интегративной вставки гетерологичного гена bgl1 A. niger в рекомбинантах доказывалось методом ПЦР с использованием Phire-полимеразы (“ThermoFisher Scientific”, США). Размер гена bgl1 составлял ~2950 п.о. Наличие одновременной сверхэкспрессии гомологичной ПМО и гетерологичной БГ доказывалось электрофоретически по увеличению интенсивности полос белка в районе 35 и 120 кДа соответственно, с последующим масс-спектрометрическим анализом трипсиновых гидролизатов белков на приборе UltrafleXtreme II (“Bruker Daltonics”, Германия). Пептидные фрагменты анализировали с использованием MASCOT (http://www.matrixscience.com), а также сервисов PeptideMass и FindPept (http://expasy. org/tools/).

Штаммы P. verruculosum выращивали в качалочных колбах Эрленмейера емкостью 750 мл в 100 мл ферментационной среды следующего состава (%): KH2PO4 – 1.5, (NH4)2SO4 · 7H2O – 0.5, MgSO4 · 7H2O – 0.03, CaCl2 · 2H2O – 0.03, глюкоза – 1.0, дрожжевой экстракт – 1.0, пшеничные отруби – 1.0, микрокристаллическая целлюлоза (МКЦ) – 40.0. После культивирования в течение 144 ч на качалке при 220 об./мин и 30°С культуральную жидкость (КЖ) отделяли от мицелия центрифугированием в течение 10 мин при 10 700 g.

Ферментные препараты B1-537, ПМО-БГ, ПМО и БГ были получены путем лиофильного высушивания КЖ штаммов P. verruculosum В1-537 (ΔniaD), P. verruculosum ПМО-БГ, P. verruculosum ПМО и P. verruculosum F10 на лиофильной сушке Benchtop 6K ES (“SP Scientific/Virtis”, США).

Реагенты. Для создания буферных смесей использовали реактивы фирм “Bio-Rad” (США), “Panreac” (Германия), “Helicon” и “Реахим” (Россия).

При ферментативном гидролизе ЛЦМ в качестве субстратов использовали: МКЦ (ТУ 20.16.59-001-40693384-209, “Кристацелл”, Россия); тростник обыкновенный из Астраханской обл., дезинтегрированный, обработанный 1.5%-ным NaOH при 120°C в течение 1 ч с последующей нейтрализацией и многократной отмывкой дистиллированной водой; полубеленую сульфатную лиственную целлюлозу (“Архангельский ЦБК”, Россия).

Для определения активностей ФП в качестве субстратов использовали МКЦ, ксилан из бука, Na-соль карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ), п-нитрофенил-β-глюкозид (пНФГ) (все производства “Sigma”, США), 2,6-диметоксифенол (2,6-ДМФ, “Thermo Fisher Scientific Inc.”, США), пероксид водорода 3%-ный (“Тульская фармацевтическая фабрика”, Россия).

Определение активностей ФП. За единицу активности принимали такое количество фермента, которое катализирует образование 1 мкмоль продукта за 1 мин.

Активности по отношению к полисахаридным субстратам (концентрация 5 г/л в реакционной смеси) определяли по начальным скоростям образования восстанавливающих сахаров (ВС) при рН 5.0 и 50°С методом Шомоди–Нельсона [19].

Активности по отношению к пНФГ (0.9 мМ в реакционной смеси) определяли по скорости образования п-нитрофенола при рН 5.0 и 50°С [19].

Активность ПМО с использованием 2,6-ДМФ в качестве модельного субстрата и H2O2 в качестве косубстрата определяли при рН 7.5 и 30°С согласно методике, описанной в работе [20]. Концентрацию хромогенного продукта рассчитывали, используя коэффициент экстинкции 53 200 М–1 см–1.

Содержание белка в ФП определяли методом Лоури, используя бычий сывороточный альбумин в качестве стандарта.

Электрофорез в 12%-ном ПААГ с Na-ДДС (ЭФ-ПААГ) проводили на приборе MiniProtein (“Bio-Rad”, США) согласно руководству к прибору. Содержание отдельных белков в ФП оценивалось методом денситометрии.

Анализ состава ФП. Анализ компонентного состава ФП проводили в соответствии с методикой, приведенной в работе [21]. На первой стадии проводили хроматографическое фракционирование ФП с использованием анионообменного носителя Source 15Q. Для каждой фракции проводили ЭФ-ПААГ, а также определяли активности по отношению к разным субстратам и содержание белка. Ферментный состав каждой фракции идентифицировали на основе измерения активностей и масс-спектрометрического анализа трипсиновых гидролизатов соответствующих белковых полос, полученных с помощью ЭФ-ПААГ [22]. Для определения содержания индивидуальных ферментов в составе ФП использовали метод денситометрии, оценивая долю фермента во фракции на основе интенсивности его полосы в электрофоретическом геле. Затем, зная содержание белка в этой фракции и долю фермента, рассчитывали его содержание в исходном препарате.

Биоконверсия ЛЦМ. Биоконверсию ЛЦМ проводили при концентрации “базового” целлюлазного ФП, полученного с помощью штамма P. verruculosum В1-537, 1 г/л (по белку), что соответствовало дозировке 10 мг белка/г субстрата. В реакционную смесь вносили дополнительно 0, 10 или 20% ФП ПМО-БГ, или ПМО, или БГ из расчета 0, 1 или 2 мг белка/г субстрата.

Гидролиз проводили в пластиковых пробирках объемом 2 мл (объем реакционной смеси 1.5 мл) в термостатируемом шейкере Biosan TS-100 (“Biosan”, Латвия) в присутствии 0.1 г/л антибиотика ампиокса при рН 5.0 и 40°С. Концентрация субстрата составляла 100 г/л в пересчете на сухое вещество.

В ходе процесса отбирали аликвоты, в которых определяли концентрацию ВС методом Шомоди–Нельсона и глюкозы, используя набор “Фотоглюкоза” и инструкцию к нему (“Импакт”, Россия). Качественный и количественный состав низкомолекулярных сахаров определяли с помощью ВЭЖХ-системы Agilent 1100 (“Agilent”, США) на колонке Диасфер-110-Амин (5 мкм, 4.0 × 250 мм). В качестве элюента использовали смесь ацетонитрил-вода 75 : 25 при скорости элюции 1 мл/мин, объем анализируемого образца 10–100 мкл.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Активность и состав используемых ФП. Для используемых в работе ФП были измерены активности по отношению к ряду субстратов (табл. 1). ФП ПМО-БГ и БГ обладали высокой β-глюкозидазной активностью (по отношению к пНФГ) – 31 800 и 61 100 ед./г белка, β-глюкозидазная активность ФП В1-537 и ПМО была низкой.

Таблица 1.  

Активности ферментов в используемых ФП (ед./г белка)

ФП Субстрат
пНФГ 2,6-ДМФ МКЦ КМЦ ксилан
ПМО-БГ 31 800 ± 700 41 ± 3 310 ± 20 2950 ± 250 2790 ± 200
БГ 61 100 ± 900 0 400 ± 30 3390 ± 300 3310 ± 280
ПМО 500 ± 10 73 ± 6 450 ± 40 3370 ± 290 8700 ± 710
В1-537 1800 ± 80 0 860 ± 70 13 000 ± 900 19 800 ± 950

Активность полисахаридмонооксигеназы у ФП ПМО-БГ и ПМО по отношению к 2,6-ДМФ составила 41 и 73 ед./г белка, у ФП, полученного с помощью штаммов В1-537 и БГ, отсутствовала. Относительно низкое значение активности ФП ПМО-БГ и ПМО по 2,6-ДМФ объяснялась невысокими каталитическими константами по отношению к этому субстрату, характерными для всех ПМО. Так, активность очищенной ПМО из Neurospora crassa, определенная по этой же методике, составляла 32 ед./г [20].

КМЦазная (эндоглюканазная) активность препаратов ПМО-БГ, БГ и ПМО была приблизительно одинаковой (около 3000 ед./г белка), у ФП В1-537 активность по КМЦ была выше и составляла 13 000 ед./г белка.

Активность по МКЦ (целлобиогидролазная активность), возрастала от 310 до 850 ед./г в ряду ФП ПМО-БГ, БГ, ПМО и В1-537.

Активность ксиланазы ФП ПМО-БГ и БГ составляла около 3000 ед./г белка, у ФП ПМО и В1-537 ксиланаза была выше – 8700 и 19  800 ед./г белка соответственно.

На рис. 1 представлен данные ЭФ-ПААГ для ФП ПМО-БГ, а также для ФП реципиентного штамма В1-537. На электрофореграмме ПМО-БГ присутствуют две мажорные полосы около 120 и 33 кДа, соответствующие БГ и ПМО. Для ФП В1-537 характерен белковый кластер ЦБГI и ЦБГII в диапазоне 50–65 кДа (общее содержание всех ЦБГ составляло около 60%) и несколько белковых полос в диапазоне 35–50 кДа, соответствующих ЭГI и ЭГII (общее содержание всех ЭГ около 15%). Эти белки или отсутствуют в ФП ПМО-БГ, или их содержание снижено в несколько раз (табл. 2).

Рис. 1.

Электрофорез в ПААГ с Na-ДДС. ФП: 1 – В-1‑537, 2 – ПМО-БГ, 3 – ПМО, 4 – БГ. М-маркеры, указаны молекулярные массы стандартных белков.

Таблица 2.  

Содержание основных ферментов (%) в используемых ФП

ФП Фермент, %
БГ* ПМО ЦБГ ЭГ ксиланаза
ПМО-БГ 43 34 15 5 2
БГ 80 0 10 5 2
ПМО 2 70 25 7 2
В1-537 3 0 60 15 3

* Указано содержание собственной и/или клонированной БГ.

Содержание ферментов в ФП ПМО-БГ, определенное с помощью хроматографического фракционирования, составило 34% (ПМО) и 43% (БГ) от общего количества белка, препарат также содержал небольшое количество ЦБГ (15%) и ЭГ (5%). Согласно литературным данным [23, 24], для проявления синергетического эффекта между целлюлазами и вспомогательными ферментами, достаточно небольших количеств последних (около 10% каждого), поэтому с точки зрения состава вспомогательных ферментов новый ФП перспективен в качестве добавки к “базовому” целлюлазному комплексу.

Используемые в работе ФП БГ содержал около 80% β-глюкозидазы [6], ФП ПМО имел в своем составе около 70% ПМО [16] (табл. 2).

Биоконверсия ЛЦМ. Для биоконверсии были использованы следующие материалы: МКЦ, тростник обыкновенный и полубеленая сульфатная лиственная целлюлоза. Для увеличения реакционной способности тростник был подвергнут щелочной предобработке по методике [25, 26]. МКЦ и полубеленая целлюлоза какой-либо дополнительной обработке не подвергались, так как обладали достаточно высокой реакционной способностью [27].

В качестве источника “базовых” целлюлаз (ЦБГ и ЭГ) для гидролиза ЛЦМ использовали ФП В1-537, в качестве источника одновременно БГ и ПМО – ФП ПМО-БГ, в качестве источника только БГ – ФП БГ, только ПМО – ФП ПМО (форезы последних двух ФП также представлены на рис. 1).

После 48 ч гидролиза МКЦ (рис. 2а) под действием базового ФП В1-537, внесенного из расчета 10 мг белка/г субстрата, концентрация глюкозы и ВС в реакционной смеси составила 14 и 19 г/л соответственно (исходная концентрация МКЦ была 100 г/л). Полученные результаты свидетельствовали об относительно низкой степени конверсии субстрата под действием “базового” целлюлазного комплекса, а также об образовании в качестве продуктов гидролиза целлоолигосахаридов помимо глюкозы, что было подтверждено данными ВЭЖХ-анализа (данные не приведены).

Рис. 2.

Концентрация глюкозы (1) и ВС (2) после 48 ч гидролиза МКЦ (а), предобработанного тростника (б) и полубеленой сульфатной лиственной целлюлозы (в) в присутствии базового ФП В1-537 (10 мг белка/г субстрата или 1 г белка/л в реакционной смеси), а также при добавлении к нему 10 или 20% ФП БГ, ПМО или ПМО-БГ.

При внесении в реакционную смесь дополнительно к препарату В1-537 10% ФП ПМО-БГ (1 мг белка/г субстрата) концентрация глюкозы и ВС через 48 ч гидролиза увеличилась до 26 и 27 г/л соответственно. Вклад ФП ПМО-БГ составил 2 г/л глюкозы и 3 г/л ВС при использовании этого ФП в дозировке 1 мг белка/г субстрата. Таким образом, внесение в реакционную смесь относительно небольшого количества вспомогательного ФП ПМО-БГ привело к увеличению эффективности действия базового ФП В1-537 на 60% по выходу глюкозы и 30% по выходу ВС.

Увеличение концентрации ФП ПМО-БГ до 20% в реакционной смеси (до 2 мг белка/г субстрата) не привело к существенному увеличению выхода продуктов.

При использовании в качестве вспомогательного только ФП БГ (10%, 1 мг белка/г субстрата) привело к увеличению выхода глюкозы и ВС после 48 ч гидролиза до 24 и 25 г/л, т.е. эффективность действия ФП В1-537 увеличилась на 59% по выходу глюкозы и 20% по выходу ВС. Увеличение концентрации ФП БГ до 20% (2 мг белка/г субстрата) не приводило к существенному увеличению выхода продуктов. Вклад ФП БГ составил 1.6 или 2.9 г/л глюкозы и 1.9 или 4.6 г/л ВС при внесении 1 или 2 мг белка/г субстрата соответственно.

В случае использования в качестве вспомогательного только ФП ПМО было отмечено преимущество смеси ФП В1-537 с 20% ПМО, которая обеспечивала выход глюкозы и ВС до 23 и 27 г/л, эффективность действия ФП В1-537 увеличивалась на 42% по выходу глюкозы и на 18% по выходу ВС. Вклад ФП ПМО составил 2.2 или 3.0 г/л глюкозы и 2.8 или 4.6 г/л ВС при внесении в реакционную смесь 1 или 2 мг белка/г субстрата соответственно.

Таким образом, при гидролизе МКЦ предпочтительным источником вспомогательных ферментов оказался ФП ПМО-БГ: 10%-ной добавки ФП ПМО-БГ оказалось достаточно для максимально возможного в условиях эксперимента увеличения эффективности базового ФП В1-537 до 60% по выходу глюкозы и до 30% по выходу ВС.

После 48 ч гидролиза предобработанного тростника (рис. 2б) базовым ФП В1-537 (10 мг белка/г субстрата) концентрация глюкозы и ВС в реакционной смеси составляла 23 и 42 г/л соответственно. Полученные результаты свидетельствовали об образовании помимо глюкозы в качестве продуктов гидролиза целлоолигосахаридов, а также продуктов гидролиза гемицеллюлоз. ВЭЖХ-анализ гидролизата показал присутствие ксилозы (3 г/л), арабинозы (1 г/л) и целлоолигосахаров (преимущественно целлобиозы) суммарно около 5 г/л.

При внесении в реакционную смесь 10% вспомогательного ФП ПМО-БГ концентрации глюкозы и ВС после 48 ч гидролиза составили 43 и 64 г/л соответственно, а при внесении 20% ПМО-БГ – 50 и 68 г/л. Увеличение эффективности действия базового ФП В1-537 составило 80 и 100% для выхода глюкозы (при дополнительных 10 и 20% ФП ПМО-БГ) и 40% – для выхода ВС. Вклад ФП ПМО-БГ составил 1.0 или 1.6 г/л глюкозы и 3.5 или 7.0 г/л ВС при внесении 1 или 2 мг белка/г субстрата соответственно.

Использование в качестве вспомогательного только ФП БГ привело к увеличению концентрации глюкозы и ВС после 48 ч гидролиза до 42 и 60-62 г/л (при внесении 10 и 20% ФП БГ соответственно), т.е. эффективность действия ФП В1-537 увеличивалась на 78 и 70% по выходу глюкозы и на 27 и 22% по выходу ВС. Вклад ФП БГ составил 1.6 или 3.3 г/л глюкозы и 6.7 или 10.3 г/л ВС при внесении 1 или 2 мг белка/г субстрата соответственно.

Использование только ФП ПМО в качестве вспомогательного при гидролизе тростника было мало эффективным и не давало значимого увеличения выхода глюкозы относительно действия только одного ФП В1-537.

Таким образом, при гидролизе предобработанного тростника эффективность ФП ПМО-БГ как источника вспомогательных ферментов относительно ФП БГ и ФП ПМО была очевидной. Использование ФП ПМО-БГ приводило к увеличению до 100% по выходу глюкозы и до 40% по выходу ВС.

После 48 ч гидролиза полубеленой сульфатной лиственной целлюлозы (рис. 2в) под действием индивидуального базового ФП В1-537 (10 мг белка/г субстрата) концентрация глюкозы и ВС в реакционной смеси составила 34 и 40 г/л соответственно. По данным ВЭЖХ помимо глюкозы в качестве продуктов образуются ксилоза (4 г/л) и целлоолигосахариды (преимущественно целлобиоза, около 2 г/л).

При внесении в реакционную смесь 10% вспомогательного ПМО-БГ концентрация глюкозы и ВС после 48 ч гидролиза составили 64 и 68 г/л соответственно, а при внесении 20% ПМО-БГ – 69 и 77 г/л. Увеличение эффективности действия базового ФП В1-537 составило 80% по выходу глюкозы и 50 и 70% по выходу ВС при внесении дополнительных 10 и 20% ФП ПМО-БГ соответственно. Вклад ФП ПМО-БГ составил 2.2 или 4.0 г/л глюкозы и 3.4 или 6.1 г/л ВС при концентрации 1 или 2 мг белка/г субстрата.

Использование в качестве вспомогательного только ФП БГ привело к увеличению концентрации глюкозы и ВС после 48 ч гидролиза до 55–57 и 58–63 г/л соответственно (при внесении 10 или 20% ФП БГ), то есть эффективность действия ФП В1-537 увеличилась на 81-90 или 34-37% по выходу глюкозы и ВС соответственно. Вклад ФП БГ составил 3.0 или 4.9 г/л глюкозы и 4.5 или 7.6 г/л ВС при концентрации 1 или 2 мг белка/г субстрата.

Использование 10-20% вспомогательного ФП ПМО при гидролизе полубеленой целлюлозы было мало эффективным и давало лишь небольшое увеличение выхода глюкозы относительно базового ФП В1-537.

Таким образом, так же как и в случае предобработанного тростника, при конверсии полубеленой сульфатной лиственной целлюлозы эффективность ФП ПМО-БГ как источника вспомогательных ферментов относительно ФП БГ и ФП ПМО очевидна. Использование ФП ПМО-БГ приводило к увеличение выхода глюкозы до 50% и выхода ВС до 30%.

* * *

Результаты биоконверсии ЛЦМ зависят от сбалансированности состава гидролитического комплекса, состоящего из экзо- и эндодеполимераз (ЦБГ и ЭГ), а также присутствия в реакционной смеси вспомогательных ферментов (БГ и ПМО). Принято считать, что доля вспомогательных ферментов должна составлять около 10% каждого от общего пула ферментов “базового” целлюлазного комплекса [6, 7, 23, 24]. В настоящей работе показано, что уже добавление 10% (по белку) ФП ПМО-БГ, содержащего одновременно БГ и ПМО примерно в равных соотношениях, существенно увеличивало эффективность гидролиза МКЦ, предобработанного тростника и полубеленой целлюлозы под действием базового целлюлазного комплекса P. verruculosum, причем ФП ПМО-БГ превосходил по эффективности ФП, содержащие только БГ или ПМО.

В работе [7] замена 10% целлюлаз на эквивалентное количество ПМО из T. reesei, Myceliophthora thermophila или Thielavia terrestris приводила к увеличению выхода ВС на 17–18% при гидролизе МКЦ. Смесь “базового” целлюлазного комплекса P. verruculosum с гомогенными ПМО T. reesei и БГ A. niger давала увеличение выхода глюкозы на 100% при гидролизе МКЦ, при этом основной синергетический эффект наблюдался при добавлении к целлюлазам БГ, а вклад ПМО составлял лишь 5% [28]. В работах [6, 11] добавление ФП, содержащего преимущественно БГ, к “базовому” целлюлазному комплексу P. verruculosum увеличивало выход продуктов гидролиза измельченной осиновой древесины и пергамента на 80 и 43% соответственно. В настоящей работе добавление ФП ПМО-БГ к “базовому” целлюлазному комплексу P. verruculosum было наиболее эффективно при гидролизе предобработанного тростника и полубеленой сульфатной лиственной целлюлозы и это обеспечивало увеличение выхода глюкозы на 80–100%.

Полученные результаты позволяют рекомендовать новый ФП ПМО-БГ как источник дополнительных ферментов для интенсификации процесса биоконверсии ЛЦМ.

Работа была выполнена в рамках ГЗ НИР МГУ АААА-А21-121011290089-4.

Авторы благодарят сотрудников ЦКП “Промышленные биотехнологии” ФИЦ Биотехнологии РАН.

Список литературы

  1. Nieves R.A., Ehrman C.I., Adney W.S. et al. // World J. Microbiol. Biotechnol. 1998. V. 14. P. 301–304. https://doi.org/10.1023/A:1008871205580

  2. Gusakov A.V. // Trends Biotechnol. 2011. V. 29. № 9. P. 419–425. https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2011.04.004

  3. Чекушина А.В., Доценко Г.С., Синицын А.П. // Катализ в промышленности. 2012. Т. 6. С. 68–76.

  4. Kubicek C.P., Mikus M., Schuster A. et al. // Biotechnol. Biofuels. 2009. V. 2. P. 19–33. https://doi.org/10.1186/1754-6834-2-19

  5. Lynd L.R., Weimer P.J., van Zyl W.H., Pretorius I.S. // Microbiol. Molec. Biol. Rev. 2002. V. 66. № 3. P. 506–577. https://doi.org/10.1128/mmbr.66.3.506-577.2002

  6. Dotsenko G.S., Gusakov A.V., Rozhkova A.M., Korotkova O.G., Sinitsyn A.P. // Process Biochem. 2015. V. 50. P. 1258–1263.

  7. Булахов А.Г., Гусаков А.В., Чекушина А.В., Сатратдинов А.Д., Кошелев А.В., Матыс В.Ю., Синицын А.П. // Биохимия. 2016. Т. 81. № 5. С. 701–709.

  8. Чекушина А.В., Доценко Г.С., Кондратьева Е.Г., Синицын А.П. // Биотехнология. 2013. Т. 3. С. 58–68.

  9. Синицын А.П., Короткова О.Г., Синицвна О.А., Рожкова А.М., Доценко Г.С., Проскурина О.В., Осипов Д.О., Кондратьева Е.Г., Чекушина А.В. // Биокатализ. 2015. Т. 15. № 6. С. 78–83.

  10. Bulakhov A.G., Volkov P.V., Rozhkova A.M., Gusakov A.V., Nemashkalov V.A., Sinitsyn A.P. // PLoS ONE. 2017. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0170404

  11. Синицын А.П., Скомаровский А.А., Чекушина А.В., Синицына О.А., Немашкалов В.А., Кондратьева Е.Г., Рожкова А.М., Кошелев А.В. // Биокатализ. 2015. Т. 15. № 5. С. 74–77. https://doi.org/10.18412/1816-0387-2015-5-74-74-77

  12. Синицын А.П., Синицына О.А., Зоров И.Н., Рожкова А.М. // Прикл. биохимия и микробиология. 2020. Т. 56. № 65. С. 551–560. https://doi.org/10.31857/S0555109920060161

  13. Семенова М.В., Гусаков А.В., Телицын В.Д., Синицын А.П. // Прикл. биохимия и микробиология. 2021. Т. 57. № 5. С. 477–484. https://doi.org/10.31857/S0555109921050147

  14. Короткова О.Г., Семенова М.В., Морозова В.В., Зоров И.Н., Соколова Л.М., Бубнова Т.М., Окунев О.Н., Синицын А.П. // Биохимия. 2009. Т. 74. № 5. С. 699–709.

  15. Morozova V.V., Gusakov A.V., Andrianov R.M. et al. // Biotechnol. J. 2010. V. 5. № 8. P. 871–880. https://doi.org/10.1002/biot.201000050

  16. Синицын А.П., Синицына О.А., Рожкова А.М. // Биотехнол. 2021. Т. 36. №6. С. 24–41. https://doi.org/10.21519/0234-2758-2020-36-6-24-41

  17. Semenova M.V., Gusakov A.V., Volkov P.V., Matys V.Y., Nemashkalov V.A., Telitsin V.D., Rozhkova A.M., Sinitsyn A.P. // Mol. Biol. Rep. 2019. V. 46. P. 2363–2370. https://doi.org/10.1007/s11033-019-04693-y

  18. Aleksenko A.Y., Makarova N.A., Nikolaev I.V., Clutterbuck A.J. // Current Genetics. 1995. V. 28. P. 474–478.

  19. Синицын А.П., Черноглазов В.М., Гусаков А.В. // Итоги науки и техники. М.: ВИНИТИ, Биотехнология. 1990. № 25. С. 148.

  20. Breslmayr E., Hanzek M., Hanrahan A., Leitner C., Kittl R., Santek B., Oostenbrink C., Ludwig R. // Biotechnol. Biofuels. 2018. V. 11. P. 79. https://doi.org/10.1186/s13068-018-1063-6

  21. Markov A.V., Gusakov A.V., Kondratyeva E.G., Okunev O.N., Bekkarevich A.O., Sinitsyn A.P. // Biochem. 2005. V. 70. P. 657–663. https://doi.org/10.1007/s10541-005-0166-4

  22. Gusakov A.V., Semenova M.V., Sinitsyn A.P. // J. Anal. Chem. 2010. V. 65. P. 1446–1461. https://doi.org/10.1134/S1061934810140030

  23. Vaaje-Kolstad G., Westereng B., Horn S.J., Liu Z., Zhai H., Sørlie M., Eijsink V.G. // Science. 2010. V. 330. № 6001. P. 219–222. https://doi.org/10.1126/science1192231

  24. Гусаков А.В., Синицын А.П. // В кн.: Химия биомассы: биотоплива и биопластики [Ред. С.Д. Варфоломеев]. М.: Научный мир, 2017. С. 65–99.

  25. Доценко Г.С., Чекушина А.В., Кондратьева Е.Г., Пра-вильников А.Г., Андрианов Р.М., Осипов Д.О. и др. // Лесной Вестник. 2012. Т. 8. С. 129–135.

  26. Karp S.G., Osipov D.O., Semenova M.V., Rozhkova A.M., Zorov I.N., Sinitsyna O.A., Soccol C.R., Sinitsyn A.P. // Agronomy. 2020. V. 10. № 9. https://doi.org/10.3390/agronomy10091348

  27. Новожилов Е.В., Синельников И.Г., Аксенов А.С., Чухчин Д.Г., Тышкунова И.В., Рожкова А.М., Осипов Д.О., Зоров И.Н., Синицын А.П. // Катализ в промышленности. 2015. Т. 15. № 5. С. 78–83. https://doi.org/10.18412/1816-0387-2015-5-78-83

  28. Проскурина О.В., Короткова О.Г., Рожкова А.М., Кондратьева Е.Г., Матыс В.Ю., Зоров И. Н., Кошелев А. В., Окунев О. Н., Немашкалов В. А., Бубнова Т. В., Синицын А.П. // Прикл. биохимия и микробиология. 2015. Т. 51. № 6. С. 592–599. https://doi.org/10.7868/S0555109915060124

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Прикладная биохимия и микробиология

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал