Прикладная биохимия и микробиология, 2021, T. 57, № 6, стр. 536-548

ИДЕНТИФИКАЦИЯ NO У ГРИБОВ

Образование NO в митохондриях [9] или клетках [10] дрожжей можно исследовать методами амперометрии, с использованием NO-чувствительного электрода Кларка, однако этот метод не получил широкого распространения для других грибов.

Для идентификации и функциональной оценки эндогенного оксида азота в клетках грибов применяют методы с использованием различных флуоресцентных индикаторов – 4-амино-5-метиламино-2',7'-дифлуоресцеин диацетата (DAF-FM DA) [11–16] и диаминородамина (DAR-4M) [17]. Флуоресцентный краситель DAF-FM очень чувствителен к NO (предел обнаружения – 3 нМ), а DAF-FM DA способен пассивно диффундировать через клеточные мембраны и, проникнув в клетку, превращается эстеразами в DAF-FM [18].

Эффект, наблюдаемый после добавления доноров оксида азота, а также ингибиторов NO-синтазы млекопитающих и скавенджеров NO, является показателем синтеза оксида азота в клетках грибов [11–13, 19–22]. В качестве соединений, генерирующих оксид азота в растворах (доноров NO), используют молсидомин [23], нитропруссид натрия (SNP) [12, 20, 21, 24–26], S-нитрозо-N-ацетилпенициламин (SNAP) [25], S-нитрозоцистеин (SNC) [27], S-нитрозо-N-ацетилцистеин (SNAC) [27], S-нитрозоглутатион (GSNO) [27–29], диэтилентриамин (DETA) [30], 2,2-(гидроксинитрозогидразино)-бисэтанамин [31] и диэтилентриамин-NO-ат [32]. При низких значениях рН донором NO может служить нитрит натрия, при этом нитрозирующим агентом является протонированная азотистая кислота (pK_a 3.4) [27]:

NO доноры – гетерогенная группа молекул, способная выделять NO или его производные, такие как нитроксильный анион или катион нитрозония. Учитывая тот факт, что многие NO доноры в определенных концентрациях нетоксичны для клеток млекопитающих, в последнее время для борьбы с микотоксинами и токсикогенными грибами внимание исследователей привлекли наноматериалы, выделяющие это соединение [33]. Применение оксида азота в комбинации с наночастицами повышает стабильность, улучшает адресную доставку и контролируемое и долгосрочное высвобождение NO [34].

Для ингибирования NO-синтазной активности, ответственной за реакцию взаимодействия кислорода и L-аргинина с образованием оксида азота и L-цитруллина, у грибов применяют нитро-L-аргинин [11, 21, 29], метил-L-аргинин ацетат (L-NMMA) [11], аминогуанидин [20, 36], метиловый эфир N-нитро-L-аргинина (L-NAME) [10, 12, 20, 35], L-N6-(1-иминоэтил)-лизин (L-NIL) [35], 1-[2-(трифтор-метил)фенил]имидазол (TRIM) [13]. Скавенджерами NO могут служить оксигемоглобин Fe(II) [27] и 2-(4-карбоксифенил)-4,4,5,5-тетраметилимидазолин-1-оксил-3-оксид (cPTIO) [16, 36, 37].

УЧАСТИЕ NO В ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ И БИОХИМИЧЕСКИХ ПРОЦЕССАХ У ГРИБОВ

Апоптоз и стресс. Избыточное количество оксида азота может привести к повреждению клеток и вызвать апоптоз. Получены свидетельства об участии NO в апоптозе, индуцированном пероксидом водорода, у дрожжей Saccharomyces cerevisiae [10, 38]. Для этого же гриба показано, что NO в низких концентрациях оказывает цитопротекторный эффект при стрессе, вызванным повышением температуры или гидростатического давления [39]. В условиях гипоксии митохондрии S. cerevisiae способны к NO₂-зависимому синтезу NO при участии флавогемоглобина YHb и цитохром-с-оксидазы [9], причем изоформы последнего фермента по-разному влияют на продукцию NO в зависимости от концентрации кислорода [40]. Получены также данные, свидетельствующие о синтезе NO из Arg в клетках этих дрожжей в ответ на тепловой стресс [41].

NO способен защитить клетки шампиньона двуспорового Agaricus bisporus от окислительного стресса [31]. Обработка донором NO, 2,2-(гидроксинитрозогидразино)-бисэтанамином, уменьшала окислительное повреждение в собранных плодовых телах. При этом NO снижает содержание супероксид-радикала и H₂O₂, ингибирует полифенолоксидазу и активирует такие антиокислительные ферменты как каталаза, супероксиддисмутаза и аскорбатпероксидаза.

При тепловом стрессе оксид азота эффективно уменьшает окислительное повреждение в мицелии вешенки степной Pleurotus eryngii var. tuoliensis [14] и Trichoderma harzianum LTR-2 [37]. Обнаружено также при данном виде стресса увеличение экспрессии генов, кодирующих белки теплового шока, у Ganoderma oregonense [42].

NO может служить регулятором метаболизма металлов у грибов, причем его действие зависит от концентрации соединения. NO в низких концентрациях защищает клетки S. cerevisiae от токсичности ионов Cu²⁺, однако при обработке высокими концентрациями NO наблюдали противоположный эффект [43]. При этом происходило изменение активности Cu-зависимого фактора транскрипции Ace1, что может свидетельствовать об участии оксида азота в метаболизме Cu у этого гриба. При добавлении NO к мицелию P. eryngii, обработанному высокими концентрациями Cd²⁺, отмечено увеличение биомассы [44]. На основании анализа секвенирования РНК установлено, что увеличение толерантности к кадмию обусловлено активацией ряда оксидоредуктаз, дегидрогеназ, трансфераз и транскрипционных факторов в присутствии экзогенного NO. Защитный эффект оксида азота от токсичного Cd²⁺ выявлен также у трутовика лакированного Ganoderma lucidum [45]. В мицелии этого гриба под действием кадмия образуются H₂O₂ и ${\text{O}}_{2}^{ - },$ а также запускается перекисное окисление липидов. Однако обработка 100 мM SNP (донор NO) предотвращает эти процессы и активирует пероксидазу и каталазу.

Показано, что в условиях нитрозативного стресса, вызванного присутствием NO, выделяющегося при обработке клеток DETA паразита-некротрофа Botrytis cinerea, основной системой детоксикации NO служит флавогемоглобин BCFHG1 [30]. Флавогемоглобины являются NO-оксидоредуктазами, известными также как NO-диоксигеназы (КФ 1.14.12.17). Эти ферменты катализируют превращение NO в ${\text{NO}}_{3}^{ - }$ в присутствии НАДФH, ФАД и O₂.

Взаимодействие грибов. Оксид азота может быть вовлечен в механизм взаимодействия различных видов грибов. Показано, что в ответ на обработку элиситором, выделенного из аскомицета Alternaria alternate, в клетках базидиомицета Inonotus obliquus происходит генерация NO [36]. Очевидно, оксид азота является медиатором элиситора, приводящего к активации фенилаланин-аммиак-лиазы и увеличению биосинтеза антиоксидантных полифенолов у чаги скошенной I. obliquus. Авторы предположили, что при взаимодействии этих грибов NO участвует в сигнальном пути, независимом от действия оксилипинов.

Прорастание спор и рост мицелия. NO подавляет образование псевдомицелия у дрожжей Candida tropicalis [23].

В диплоидных клетках аспергилла гнездового Aspergillus nidulans NO, образованный донором SNP, способен ингибировать рост мицелия при концентрациях SNP от 40 до 320 μM. Процесс сопровождался индукцией митотического кроссинговера [22].

При рН 4.5 обработка 2 мМ нитритом в течение 24 ч уменьшает прорастание спор патогенного гриба Aspergillus fumigatus на 23%, а при увеличении концентрации до 5 мМ через 16 ч наблюдается гибель 100% спор [27]. Нитрозо-производные глутатиона, SNC, SNAP и SNAC также губительны для этих спор, но в меньшей степени. В противоположность этому GSNO не обладал фунгицидным действием, а наоборот, стимулировал прорастание спор.

Фунгицидную активность газообразного NO сравнили в опытах in vitro с патогенными грибами, развивающимися на растениях после сбора урожая. Обработке подвергали такие грибы как Aspergillus niger, Monilinia fructicola (возбудитель бурой гнили косточковых плодов) и Penicillium italicum (поражает плоды цитрусовых) [46]. Кратковременная обработка оксидом азота (50–500 мкл/л) ингибировала прорастание спор и рост мицелия, что позволило предложить NO в качестве природного фунгицида при хранении фруктов и овощей. Сходные результаты получены для Penicillium expansum, другого патогенного гриба, также поражающего фруктовые плоды [26]. Оксид азота, выделяющийся при действии 6 мМ SNP, ингибировал рост мицелия. Авторы обнаружили, что экзогенный NO в высоких концентрациях индуцирует образование активных форм кислорода (АФК), которые способны вызвать окислительное повреждение белков, необходимых для прорастания спор этих грибов. Вместе с тем, при индукции внутриклеточного синтеза NO у S. cerevisiae, вызванного добавлением синтетического фунгицидного гесапептида PAF26, аккумуляции АФК не наблюдалось [15]. В присутствии ингибитора NO-синтазы, L-NAME, происходило частичное восстановление роста дрожжей, обработанных PAF26.

В опытах in vitro NO, образованный донорами SNP и SNAP, активировал прорастание, но уменьшал жизнеспособность бластоконидий у Candida albicans [25], причем действие NO на споры было более заметным при кислых, чем при щелочных рН. Примечательно, что бластоконидии оказались более чувствительными к действию NO, чем гифы мицелия.

АФК и NO координированно регулируют прорастание спор и последующий рост зародышевых трубок ржавчинного гриба, Puccinia striiformis Westend f. sp. tritici [47]. По-видимому, в контроле прорастания трубок NO действует только совместно с АФК, так как повышение или снижение уровня одного из компонентов оказывает негативное влияние на процесс, тогда как накопление высокого уровня и NO, и АФК обеспечивало нормальный рост гриба. Очевидно, что для регулирования прорастания необходим определенный баланс NO и АФК. При достижении этого баланса как NO, так и АФК предпочтительно локализуются в порах и апексе растущих зародышевых трубок и влияют на их полярный рост.

Обработка аскомицета Trichophyton rubrum интенсивным импульсным светом с длиной волны 420 нм приводила к увеличению уровня NO в клетках и ингибированию их роста по сравнению с контролем in vitro [48].

Аккумуляция NO выявлена на всех стадиях прорастания конидий Colletotrichum coccoides, вызывающего антракноз у томатов [11]. Вместе с тем, добавление экзогенного NO ингибировало прорастание спор этого гриба, а обработка ингибиторами нитро-L-аргинином и L-NMMA в разной степени ускоряла процесс, указывая на регуляторную роль NO в прорастании спор.

Применение флуоресцентного красителя DAR-4M и NO-скавенджеров позволило выявить синтез NO при прорастании и на ранних стадиях развития Magnaporthe oryzae, аскомицета, вызывающего гниль риса [17]. Вместе с тем, делеция ряда генов, кодирующих ферменты, потенциально ответственные за синтез этого соединения, не сказывается на генерации NO. Флуоресцентные сигналы, обнаруженные после действия DAF-FM DA, также свидетельствовали о возможности вовлечения NO в процесс прорастания спор и созревания аппрессориев у этого гриба [49].

Обработка Fusarium oxysporum f. sp. fragariae донором NO SNP приводила к дозо-зависимому уменьшению прорастания конидий и увеличению скорости роста мицелия [50]. Регуляция роста мицелия оксидом азота сопровождалась изменением образования супероксид аниона.

Дифференцировка грибов. В литературе приводятся данные о действии NO как сигнальной молекулы, контролирующей дифференцировку грибов, принадлежащих к различным таксономическим группам.

NO при участии L-Arg и cGMP влияет на конидиогенез митоспорового гриба Coniothyrium minitans [12, 21], паразитирующего на склероциях грибов – нитроаргинин ингибирует образование пикнидий, а добавление SNP приводит к образованию спор у дефицитного по конидиогенезу мутанта. Наибольшая концентрация NO выявлена в мицелии на стадии инициации пикнидий (72 ч постинокуляции).

Майер с соавт. [19] изучили действие SNP – донора NO, и L-NAME – ингибитора NO-синтазной активности, на образование спорангиофоров у зигомицета Phycomyces blakesleeanus. Указанные соединения действовали противоположным образом на формирование микро- и макроспорангиофоров: под действием SNP отмечено увеличение числа макроструктур и уменьшение числа микроструктур, а в присутствии L-NAME выявлена обратная зависимость, причем процесс был гораздо сильнее выражен при макроспорангиогенезе.

Корейские исследователи обнаружили стимуляцию образования плодовых тел в присутствии SNP у базидиомицета Flammulina velutipes и подавление процесса при добавлении L-NAME и аминогуанидина [20].

Виера с соавт. [13], используя флуоресцентный индикатор DAF-FM DA, выявили образование ^∙NO при споруляции водного хитридиомицета Blastocladiella emersonii. Если обработку клеток флуоресцентным детектором проводили в присутствии NO-синтазного ингибитора L-NAME, то интенсивность зеленого флуоресцентного сигнала резко снижалась. Применение количественного хемилюминесцентного анализа подтвердило, что при индукции образования подвижных зооспор происходило увеличение внутриклеточных продуктов, являющихся производными NO, почти в 3 раза.

В работе Пенгкита с соавт. [16] для идентификации и функциональной оценки эндогенного NO у аскомицета Neurospora crassa также был использован метод с этим же флуоресцентным индикатором. Степень флуоресценции, показывающая уровень внутриклеточного содержания оксида азота, сильно возрастала в гифах мицелия при росте в погруженной культуре, а также в конидиофорах при конидиогенезе в поверхностной культуре. Авторы также показали, что обработка мицелия NO-скавенджером, сPTIO, приводила к резкому уменьшению уровня транскрипции генов con-10 и con-13, экспрессия которых возрастает при конидиогенезе. Авторы предположили, что оксид азота образуется внутри молодых растущих гиф и участвует в формировании конидий.

Под действием NO, генерированного донором SNP, происходило уменьшение образования конидий у аскомицета A. nidulans [22]. Позднее было показано, что у этого гриба синтез эндогенного NO возрастал на ранних стадиях дифференцировки, при переходе от вегетативного роста к конидиогенезу и добавление экзогенного NO служило индуктором этого перехода [51]. Уровень NO определял баланс между бесполым и половым циклами A. nidulans – искусственное повышение концентрации NO приводило к уменьшению конидиогенеза и индукции образования плодовых тел, клейстотециев, содержащих аскоспоры [32, 51].

Грибы могут обладать разной чувствительностью к NO в зависимости от стадии дифференцировки. Так, обработка клеток Bacillus cinerea [30] экзогенным NO, образованным донором DETA, приводит к изменению экспрессии гена, ответственного за синтез флавогемоглобина в мицелии и спорах. Установлено, что данный белок участвует в детоксикации NO, превращая активный NO радикал в нитрат. При обработке NO максимальная экспрессия гена, кодирующего этот белок, отмечена в прорастающих конидиях B. cinerea, но отсутствовала в растущем и активно ветвящемся мицелии.

В связи с тем, что свет является важным регуляторным фактором целого ряда жизненных циклов грибов, особый интерес представляет изучение роли оксида азота в трансдукции фотосигнала у P. blakesleeanus [19], F. velutipes [20], N. crassa [16, 24, 52] и A. nidulans [53].

Синий свет ингибирует образование микроспорангиофоров, но стимулирует формирование макроспорангиофоров у P. blakesleeanus [19]. Донор NO SNP способен замещать эффект активирующего действия света при макроспорангиогенезе, а ингибиторы NO-синтазной реакции подавлять его. Вместе с тем, свет индуцирует образование цитруллина из аргинина в наиболее важных для развития фазах роста – логарифмической фазе роста мицелия и при созревании макроспорангиофоров. Ингибирование биосинтеза тетрагидробиоптерина BH₄, кофактора NO-синтазы (NOS), приводило к ингибированию фотоморфогенеза. При дифференцировке поверхностной культуры P. blakesleeanus значения удельной активности фермента в экстрактах мицелия и скорость образования NO в клетках гриба, измеренная хемилюминесцентной детекторной системой, были сходны и составляли от 1 до 10 пмоль ∙ мин^–1 ∙ мг белка^–1. Характерно, что образование цитруллина и эмиссия NO стимулировались светом и ингибировались при росте гриба на среде с 2,4-диамино-6-гидроксипиримидином, ингибитором биосинтеза BH₄. Авторы предположили, что NOS участвует в передаче светового сигнала при формировании спорангиев.

Перед образованием плодовых тел в освещенном мицелии опенка зимнего F. velutipes NO-синтазная активность возрастала в 72 раза [20], тем не менее оценить вклад действия света в этот процесс сложно, так как авторы не исследовали темновые контроли и, кроме того, одновременно с освещением культур изменили температурный режим с 18 до 10°С.

Результаты, полученные при действии SNP, экзогенного донора NO и специфических ингибиторов NOS, позволили предположить, что NO ингибирует светостимулируемое образование конидий у аскомицета N. сrassa [24]. Наряду с этим, авторы, измерив превращение ³H-L-аргинина в ³H-L-цитруллин, выявили наличие NO-синтазной активности в клетках гриба. Следует отметить, что роль оксида азота в фотопроцессах N. сrassa можно оценить по присутствию конечных продуктов распада NO, нитрата и нитрита, в мицелии и среде культивирования, используя определенные мутанты гриба [29, 52]. Клетки дикого типа N. сrassa и других высших грибов обладают высокой активностью нитратредуктаз (НР) и нитритредуктаз (НиР), что позволяет им утилизировать нитрат и нитрит. В связи с этим измерение выхода этих ионов из клеток дикого типа невозможно, однако трудности можно избежать, используя мутанты, лишенные данных ферментов. Так, при использовании nit-6 штамма N. сrassa, в котором отсутствует НиР, но осуществляется каталитическое превращение нитрата в нитрит, выход ${\text{NO}}_{2}^{ - }$ можно рассматривать как показатель суммарного содержания ${\text{NO}}_{3}^{ - }$ и ${\text{NO}}_{2}^{ - }$ вне клетки. Анализ динамики выхода ионов нитрита из мицелия в ходе фотоиндуцированного каротиногенеза [52] и фотостимулируемого конидиогенеза [29] nit-6 штамма N. сrassa свидетельствовал о возможном участии NO-генерирующего механизма в трансдукции фотосигнала гриба. Введение в среду культивирования донора оксида азота, GSNO, ингибировало, а ингибитора NOS, нитро-L-аргинина, стимулировало фотоконидиогенез N. сrassa, что указывает на участие NO в данном процессе. Вместе с тем, отсутствие выхода ${\text{NO}}_{2}^{ - }$ из мицелия этого же штамма в ходе светозависимого развития протоперитециев, предшественников женских половых структур, свидетельствует о малой вероятности вовлечения NO в половой процесс гриба. Таким образом, в зависимости от природы трех светорегулируемых процессов (индукция каротиногенеза, стимуляция бесполого или полового циклов) роль NO-генерирующего механизма в трансдукции фотосигнала N. crassa может отличаться. Вместе с тем, светозависимые изменения удельной активности NOS, определенные измерением превращения ³H-L-аргинина в ³H-L-цитруллин, в фотокаротиногенезе и фотоконидиогенезе N. сrassa выявлены не были [35].

Действие света на A. nidulans в присутствии кислорода инициирует образование бесполых спор, а темновые условия и гипоксия приводят к образованию половых структур. Недавно у данного гриба выявлена светорегулируемая индукция образования NO [53]. Уровень NO возрастал при освещении мицелия, культивируемого на нитрате или Arg, и уменьшался в темноте. Свет активирует 2 гена, связанных с регуляцией уровня NO, – fhbB, кодирующий флавогемоглобин, и agaA, кодирующий аргиназу, контролирующую уровень внутриклеточного аргинина. Флавогемоглобин превращает NO в безопасный нитрат, а Arg может служить субстратом для NOS. Для светозависимой индукции указанных генов необходимо функционирование гена фитохрома fphA, а ген lreA действует как репрессор в присутствии Arg в среде. При дифференцировке гриба концентрация внутриклеточного Arg возрастает, причем более заметно при индукции полового развития, чем бесполого. Аргининовый метаболизм и свет контролируют уровень конидиогенеза. Делеция fhbB приводит к частичной потере световой регуляции конидиогенеза на среде с Arg или нитратом, в то время как делеция fhbA влияет на световую регуляцию только на среде с нитратом. Авторы предположили, что нитрат-регулируемый fhbA и свето-регулируемый fhbB необходимы для корректной световой регуляции конидиогенеза A. nidulans.

СИНТЕЗ NO В КЛЕТКАХ ГРИБОВ

Вопрос о природе генерации NO у грибов в значительной степени остается открытым. Синтез NO может осуществляться неэнзиматически и энзиматически. Неэнзиматически образование NO происходит из ${\text{NO}}_{2}^{ - }$ при низких значениях рН.

Известно, что у млекопитающих основным ферментом синтеза NO является NO-синтаза (КФ 1.14.13.396), представленная 3 формами, нейрональной (nNOS), индуцибельной (iNOS) и эндотелиальной (eNOS), кодируемыми разными генами [54]. Естественно, что по аналогии с млекопитающими наиболее вероятным претендентом на роль фермента, ответственного за синтез оксида азота у грибов, считался именно этот фермент. Однако вопрос о существовании NO-синтазной активности в клетках грибов до сих пор является дискуссионным. Оказалось, что типичные полноценные гены, кодирующие NOS млекопитающих, в геноме большинства грибов, как и у высших растений, отсутствуют. В связи с этим для обозначения энзима, осуществляющего функции NOS у этих организмов, иногда даже используется термин NO-синтазоподобная (NOS-like) активность. Вместе с тем, у некоторых из них активность фермента определяется изотопным методом, по превращению ³H- или ¹⁴C-L-аргинина в ³H- или ¹⁴C-L-цитруллин. Среди таких грибов – N. crassa [24, 35], F. velutipes [20], P. blakesleeanus [19], S. cerevisiae [10, 39], B. emersonii [13] и C. minitans [21].

Показано, что подобно ферменту млекопитающих, NOS F. velutipes использует в качестве кофакторов НАДФН, ФАД, ФМН и BH₄, но в отличие от него, не нуждается в ионах Ca²⁺ и кальмодулине [20]. K_M и V_max для данного фермента составляют 3.3 × 10^–5 M и 2.4 × 10^–4 μмоль/мин/мг белка соответственно, энзим ингибируется нитро-L-аргинином и аминогуанидином с величинами K_i 2.9 × 10^–4 и 3.3 × 10^–4 M соответственно. Авторы предполагают, что при действии этих ингибиторов, благодаря их низкому сродству к ферменту, происходит лишь задержка образования плодовых тел, но не полное ингибирование процесса. NOS F. velutipes представлена димером с молекулярной массой 100 кДа и имеет активность >500 пмоль/мин/мг белка (плодовые тела).

Активность NOS возрастает после обработки клеток дрожжей S. cerevisiae пероксидом водорода [10]. Кроме того, при этом наблюдается 2-кратное увеличение внутриклеточной концентрации L-Arg, что может быть определяющим фактором для синтеза NO при Н₂О₂-индуцированном апоптозе.

NO-синтазная активность выявляется в ходе споруляции хитридиомицета B. emersonii [13], достигая максимума через 150 мин после начала процесса и снижаясь при добавлении ингибиторов фермента, L-NAME и TRIM. Фермент является Ca²⁺-зависимым, обнаруживая в этом сходство с nNOS формой фермента млекопитающих.

Активность NOS гриба-паразита C. minitans достигала максимального уровня 20 пмоль/мин/мг белка на ранней стадии формирования пикнидий (72 ч постинокуляции) [21]. Это время совпадало с максимумом образования NO в клетках.

Данные о существовании различных форм NOS грибов, аналогичных формам, обнаруженным для фермента животных, немногочисленны. NO-синтазная активность аскомицета N. crassa по ряду свойств (чувствительность к ионам кальция, действие специфических ингибиторов фермента, Вестерн-блот анализ) сходна с iNOS формой фермента млекопитающих [35]. В работе использовали поликлональные антитела против iNOS изоформы фермента млекопитающих, иммуногеном для которых был С-концевой пептид, содержащий 14 аминокислот iNOS, полученный из макрофагов мыши. Молекулярная масса фермента составляет около 130 кДа, что близко к таковой для iNOS животных [55]. Использование моноклональных антител против nNOS позволило обнаружить конститутивную форму фермента с молекулярной массой 60 кДа у дрожжей S. cerevisiae [56, 57]. Домитрович с соавт. [39] выявили в экспоненциальной фазе роста этого же организма экспрессию nNOS, iNOS, и eNOS с молекулярными массами 160, 130 и 132 кДа, соответственно. Индуцированная NOS у этого гриба обладает изоформной специфичностью и зависит от метаболического состояния клеток и ответа на стресс. Молекулярная масса NOS I. obliquus, определенная изоферментным методом, составила 85 кДа для конститутивной и 110 кДа для индуцибельной форм фермента [58]. Совместное культивирование базидиомицета I. obliquus и трутового гриба Phellinus morii приводило к 5-кратному увеличению активности iNOS у первого гриба с последующим резким возрастанием образования NO [58]. По мнению авторов эта форма фермента может действовать как важный регулятор, влияющий на продукцию метаболитов фенилпропаноидов во время межвидовых взаимодействий между грибами.

Как указано выше, у грибов не удалось найти полноценный ген NOS животного типа. Вместе с тем, в грибных геномах P. blakesleeanus и Magnaporthe grisea обнаружен по крайней мере один фрагмент последовательности ДНК, сходный с таковым для NOS млекопитающих [13]. Сходные участки аминокислотных NO-синтазо-подобных последовательностей обнаружены в ходе анализа in silico у грибов Aspergillus oryzae, Glomerella graminicola и Colletotricum gloeosporioides [59]. Используя этот же метод, авторы выявили консервативные аминокислотные NO-синтазо-подобные последовательности у Macrophomina phaseolina. При помощи биоинформационного анализа в геноме базидиомицета I. obliquus были выявлены гены, имеющие определенное сходство с аналогичными генами, кодирующими конститутивную и индуцибельную формы NOS млекопитающих [58]. Недавно [16] в геноме N. crassa обнаружен ряд генов, имеющих высокую степень гомологии с генами NOS у других грибов и человека. Основываясь на их свойствах, авторы предположили возможность наличия различных путей синтеза NO (зависимого и независимого от NOS) у данного гриба.

У M. oryzae делеции ряда генов биосинтеза Arg, субстрата для NOS [49], а также генов NO-синтазо-подобной активности [17] не влияли на синтез NO, что также подтверждило возможность генерации NO у грибов независимым от NOS способом.

У дрожжей S. cerevisiae Arg-зависимое образование NO опосредовано флавопротеином Tah18 [41]. При этом в ответ на действие таких стрессоров как высокая температура, высушивание и замораживание/оттаивание происходит активация генов N-ацетилтрансферазы MPR1 и пролиноксидазы PUT1, что ведет к значительному увеличению содержания Arg, являющегося субстратом NOS [41, 60]. Предполагают, что Tah18 белок гомологичен редуктазному домену NOS [61]. Установлено, что Tah18 переносит электроны от НАДФН на Fe-S кластеры Dre2 белка через ФАД и ФМН [62]. В условиях окислительного стресса Tah18-Dre2-комплекс распадается, что приводит к функциональному изменению Tah18 и электроны от НАДФН используются для синтеза NO. По-видимому, в условиях окислительного стресса Tah18-Dre2-комплекс может использоваться в качестве молекулярного переключателя для контроля синтеза NO, индуцируя апоптоз или защищая клетку дрожжей [61].

Корпас и Баррозо [63] в 2017 г. предложили для высших растений гипотезу, согласно которой L-Arg-зависимая NO-синтазо-подобная активность может быть результатом кооперативного действия нескольких различных ферментов, собранных в сложный комплекс. Предложенный механизм синтеза NO может существовать и у грибов.

Синтез NO может осуществляться не только NOS. Маркос с соавт. [51] обнаружили, что при дифференцировке A. nidulans синтез NO регулируется НР, причем ген niaD, кодирующий НР, активируется при индукции конидиогенеза даже в условиях репрессии азотом в присутствии аммония. Вместе с тем это не универсальный механизм, так как с использованием мутантов, дефицитных по НР и НиР, показано, что эти ферменты не участвуют в синтезе NO у аскомицета M. oryzae [17]. Установлено также, что НиР внутренней мембраны митохондрий грибов при участии НАДН способна восстанавливать NO^2– в NO [31]. Предполагают, что митохондриальные цитохром-с-оксидаза и НиР обеспечивают образование NO в условиях гипоксии или аноксии [9, 40].

Другими возможными кандидатами, ответственными за образование оксида азота у грибов, могут быть также ксантиноксидоредуктаза [64], p450:НАДФН-P450-редуктаза [17], некоторые мембраносвязанные ферменты [64, 65] или это может быть неэнзиматический синтез [66].

ПУТИ ДЕЙСТВИЯ NO У ГРИБОВ

Мишени для действия NO в клетках грибов разнообразны (рис. 1).

Рис. 1.

Основные пути синтеза, действия и детоксикации оксида азота у грибов.

Геном. Образующийся из оксида азота в клетке пероксинитрит представляет собой сильный окислитель, который способен повреждать ДНК. Рекомбиногенный потенциал NO на клетки A. nidulans оценивали по действию SNP, экзогенного донора NO [22]. Это соединение стимулировало возникновение разрывов ДНК в G2 периоде деления. Авторы предполагают, что изменения интенсивности конидиогенеза A. nidulans, вызванные SNP, могут быть связаны с нарушением оксидом азота транскрипционной активации структурных, специфичных для споруляции генов.

У дрожжей Kluyveromyces lactis после действия газообразного NO наблюдалось ингибирование ДНК-связывающей активности транскрипционного фактора LAC9, содержащего “цинковый палец” [67]. Поскольку NO способен вызывать S-нитрозилирование тиолов цинк-серных кластеров, что приводит к обратимому разрушению структур “цинковых пальцев”, это обеспечивает молекулярный механизм для регулирования транскрипции генов.

Обработка дрожжей S. cerevisiae GSNO, донором NO, вызывала мягкий окислительный стресс и увеличение активности антиоксидантных ферментов – супероксиддисмутазы и каталазы [28]. Предполагают, что в транскрипционной активации синтеза этих ферментов участвует Yap1p, ключевой регулятор ответа дрожжей на окислительный стресс.

Для выявления механизма действия NO, связанного с повышением толерантности P. eryngii к тяжелым металлам, Ли с соавт. [21] использовали транскрипционный анализ. Авторы обнаружили значительное увеличение экспрессии 45 генов, кодирующих оксидоредуктазы, дегидрогеназы, редуктазы, трансферазы и факторы транскрипции, в образцах, обработанных экзогенным NO, что способствовало повышению устойчивости гриба к чрезвычайно высокому уровню кадмия. Наиболее многочисленными оказались гены, кодирующие ферменты, участвующие в окислительно-восстановительных процессах, включая предположительно пиридиннуклеотид-дисульфид-оксидоредуктазы, ацил-КоА-редуктазы, альдегиддегидрогеназу, сульфитредуктазу, оксалатдекарбоксилазу и формиатдегидрогеназу.

Насуно с соавт. [68] наблюдали у дрожжей S. cerevisiae под действием экзогенного NO индукцию экспрессии Cu-регулируемых генов, находящихся под контролем транскрипционного фактора Mac1, включая ген CTR1, кодирующий высокоаффинный транспортер меди. Оказалось, что NO усиливает связывание Mac1 с промоторами генов-мишеней. Обработка оксидом азота в условиях высокотемпературного стресса приводила к возрастанию ряда параметров – транскрипции гена CTR1, внутриклеточной концентрации меди, активности Cu,Zn-супероксиддисмутазы и жизнеспособности клеток. Наряду с этим, NO не влиял на экспрессию гена MAC1, что, по мнению авторов, свидетельствует об активации Mac1 за счет NO-зависимой посттрансляционной модификации путем S-нитрозилирования и/или фосфорилирования. Вместе с тем у этих же дрожжей NO ингибировал активность Cu-регулируемого транскрипционного фактора Асе1, что приводило к ингибированию Cu-зависимой индукции гена CUP1 [69]. Предполагают, что под действием оксида азота происходит модификация связывающих металлы тиолов Ace1, уменьшающая способность фактора связывать медь.

Чен с соавт. [42] сравнили транскриптом мицелия Ganoderma oregonense, подвергнутого тепловому стрессу (32°C) и воздействию экзогенного NO, с таковым, полученным в условиях регуляции NO при нормальной температуре культивирования. В дополнение к усилению регуляции генов, кодирующих белки теплового шока (HSP), в условиях теплового стресса по сравнению с контролем, после обработки NО был выявлен ряд новых HSP – HSP 78, HSP 70, HSP 104, HSP 30 и HSP C4. Предполагают, что NO активирует HSP для защиты G. oregonense от абиотического стресса. Кроме того, тепловой стресс приводит к увеличению экспрессии генов, регулирующих активность оксидазы D-аминокислот и оксидоредуктазы.

S-Нитрозилирование и нитрование остатков аминокислот. NO-зависимые пост-трансляционные модификации могут изменять функциональную активность белков, участвующих в сигнальной трансдукции при разных физиологических и стрессовых условиях. Взаимодействие NO с белками способно приводить к S-нитрозилированию Cys остатков или нитрованию остатков Tyr. Выше уже упоминалось о том, что NO может быть использован в ответах клеток грибов на разные типы стресса. Так, на основании активации синтеза NO и S-нитрозилирования глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы, а также корреляции между уровнем внутриклеточной концентрации супероксидных анионов и образованием NO, Альмейда с соавт. [10] предположили участие NO в передаче сигнала при Н₂О₂-индуцированном апоптозе S. cerevisiae. Ингибирование синтеза NO при помощи L-NAME привело к уменьшению S-нитрозилирования фермента, увеличению уровня АФК и выживаемости клеток. Оксид азота, синтезированный в митохондриях этих дрожжей, участвует в передаче сигнала в других стрессовых условиях – при гипоксии, вызывая увеличение уровня экспрессии гена гипоксии CYC7, которое сопровождается возрастанием нитрования Tyr в белке [9]. Авторы обнаружили, что митохондрии дрожжей продуцируют NO при концентрации растворенного кислорода ниже 20 µМ. Процесс катализируется цитохром-с-оксидазой и является рН-зависимым. Предполагают существование механизма положительной обратной связи, при котором NO, образованный в митохондриях, индуцирует экспрессию гена COX5b, кодирующего 5b-субъединицу цитохром-с-оксидазы, увеличивающую продукцию оксида азота в условиях гипоксии [40].

Известно, что в противоположность S-нитрозилированию нитрование Tyr осуществляется не оксидом азота, а продуктом его взаимодействия с супероксидом $\left( {{\text{О}}_{{\text{2}}}^{{ \bullet - }}} \right)$ – пероксинитритом (ONOO^–) [70]. Предполагают, что нитрование Tyr изменяет такие свойства аминокислоты как редокс-потенциал, объем, гидрофобность и pK(a) фенольной группы, что в свою очередь, может привести к глубоким изменениям структурных и функциональных свойств белка [71], определяя участие NO в широком спектре сигнальных и регуляторных процессов.

Использование двумерного гель-электрофореза с последующим Вестерн-блот-анализом позволило выявить нитрование цитозольных и митохондриальных белков S. cerevisiae [72]. Среди 8 белков митохондрий, подвергшихся нитрованию, 2 были идентифицированы как аконитаза и изоцитратдегидрогеназа. Позднее Канг с соавт. [73] изучили нитропротеомный профиль у этих же дрожжей и нашли изменения в состояниях нитрования 14 белков, участвующих в передаче сигнала спаривания – α-фактора. Показано, что вокруг нитрованных остатков Tyr группировались остатки таких аминокислот как Asp, Glu и His. Предполагают, что остатки Tyr нитрируются легче, когда остатки кислых аминокислот находятся в непосредственной близости, а также что конформационные изменения при нитровании приводят к тому, что остатки нитротирозина оказываются спрятанными внутри молекулы белка.

Протеом. Лай с соавт. [74] использовали протеомный подход для оценки механизма действия экзогенного NO при прорастании спор P. expansum. Методами двумерного электрофореза и масс-спектрометрии было показано, что после обработки спор NO происходило увеличение активности глутаминсинтетазы, амидогидролазы, нитрилаз, диоксигеназы оксида азота и HSP 70, а также уменьшение активности тетратрикопептидного структурного повтора, УДФ-N-ацетилглюкозамин пирофосфорилазы, энолазы, HSP 60 и K-гомологичного РНК-связывающего домена.

cGMP-зависимый сигнальный путь. NO способен изменять физиологический ответ клеток через cGMP-зависимый сигнальный путь за счет активации растворимой гуанилатциклазы [75]. Реализация данного пути обнаружена при конидиогенезе C. minitans [21] и биогенезе зооспор в водной культуре B. emersonii [13]. При дифференцировке C. minitans динамика изменения активности NOS была сходна с таковой для уровня cGMP, причем самая высокая активация наблюдалась на стадии пикнидиальной инициации [21].

При споруляции B. emersonii наряду с возрастанием уровня NO наблюдается стимуляция образования cGMP. При этом происходит активация транскрипционного профиля генов, кодирующих гуанилатциклазу и cGMP-фосфодиэстеразу [13]. У дрожжей Schizosaccharomyces pombe эффект действия потенциальных ингибиторов гуанилатциклазы и NOS свидетельствует о NO-регулируемом спорообразовании через cGMP-зависимый путь [76]. Очевидно, что cGMP действует в качестве важного внутриклеточного вторичного мессенджера в NO-опосредованном процессе образования спор у столь разных по таксономической принадлежности грибов.

Флавогемоглобины, нитрозотионеин (iNT), S-нитрозоглутатионредуктаза (GSNO-редуктаза) и NO-редуктаза. При индукции конидиогенеза у A. nidulans NO-метаболизирующие флавогемоглобины FhbA и FhbB участвуют в координированной регуляции переключения от вегетативного роста к размножению [51]. Экспрессия цитоплазматического fhbA гена и гена НР niaD возрастала в течение первых часов конидиогенеза (до 10 ч) и затем снижалась, а увеличение экспрессии fhbВ гена митохондрий наблюдалась в более поздний период развития (в интервале от 24 до 120 ч). Важно, что регуляция экспрессии первых 2 генов определяется глобальным регулятором азотного метаболизма AreA и специфичным регулятором нитратного пути NirA. Считают, что у данного гриба гомеостаз NO достигается за счет баланса его синтеза, осуществляемого НР, и распада в результате действия флавогемоглобинов. Установлено также, что индуцибельный FhbA защищает НР и НиР от повреждения высокими концентрациями NO [77].

Флавогемоглобины различных видов дрожжей: S. cerevisiae (ScYhb1), C. albicans (CaYhb1) и S. pombe (SPAC869.02c), содержат 3 консервативных фрагмента – N-концевой гемовый, ФАД-связывающий и С-концевой НАД(Ф)-связывающий домены [78]. У S. cerevisiae и S. pombe флавогемоглобины кодируются одним геном – ScYHB1 и SPAC869.02c соответственно, а у C. albicans – тремя (CaYHB1, CaYHB4 и CaYHB5), причем сходство последовательностей для первого и трех последних составляет от 31 до 25%. Предполагают, что флавогемоглобины способны защитить дрожжевые клетки как от внешних, так и внутренних источников NO и активных форм азота (АФА). Очевидно, что обнаруженные различия в составе и функционировании соединений могут быть обусловлены адаптацией к разным нишам обитания указанных видов дрожжей.

Баланс синтеза и распада NO важен для регуляции физиологических функций, так как избыток NO может вызвать нитрозативный стресс благодаря высокой реактивности NO и АФА. У A. nidulans в условиях нитрозативного стресса NO-индуцируемый 23-аминокислотный пептид нитрозотионеин (iNT) способен обезвреживать NO посредством S-нитрозилирования Cys остатков [79]. Тиоредоксин и его редуктаза денитрозировали S‑нитрозилированный пептид, снижали клеточный S-нитрозотиол и обеспечивали толерантность гриба к NO, что указывает на опосредованное пептидами каталитическое удаление NO.

GSNO рассматривают как одну из физиологических форм хранения и транспорта оксида азота в высших растениях [80]. Очевидно, такой способ депонирования и детоксикации NO существует и в грибах. При совместном культивировании I. obliquus и P. morii наблюдается аккумуляция оксида азота, который используется для обратимого S-нитрозилирования фенилаланин-аммиак-лиазы, 4-кумарат-КоА-лигазы и стирилпирон-синтазы, ферментов, участвующих в биосинтезе стирилпирона [81]. При этом в регуляции как специфичности, так и обратимости S-нитрозилирования белка у I. obliquus принимает участие GSNO-редуктаза и тиоредоксин-подобные белки.

Удаление избыточно-токсичного NO из клеток грибов также может осуществлять NO-редуктаза – фермент, катализирующий образование N₂O из оксида азота [82]. Известно, что у грибов для этого используется цитохром Р-450nor, который передает электроны от НАДН без участия электрон-транспортной цепи. При нитратной диссимиляции у мутанта F. oxysporum, неспособного синтезировать NO-редуктазу и флавогемоглобин, отмечено нарушение работы дыхательной системы и ингибирование роста [83].

* * *

Основной метод, применяемый для идентификации и действия эндогенного оксида азота в клетках грибов – использование флуоресцентных индикаторов. В последнее время для оценки участия NO в различных физиологических процессах этих организмов получило широкое применение доноров и скавенджеров NO, а также ингибиторов NO-синтазы млекопитающих. Достигнуты значительные успехи в исследовании роли оксида азота в регуляции у грибов апоптоза, различных видов стресса, метаболизма металлов, мицелиального роста, прорастания спор и дифференцировки. Уровень NO способен определять баланс между бесполым и половым циклами этих организмов, причем в регуляции жизненных циклов особое значение может приобретать участие оксида азота в трансдукции фотосигнала. Это может быть важно при разработке подходов к управлению жизненными циклами промышленно-значимых грибов. Разнообразие NO-зависимых сигнальных путей, задействованных в различных биологических процессах грибов, свидетельствует о сложности механизмов, регулируемых NO. Это расширяет наши знания о проблеме регуляции оксида азота у эукариот. Среди них – участие оксида азота в S-нитрозилировании и нитровании остатков аминокислот, инициировании разрывов ДНК, транскрипционной активации определенных генов и синтезе cGMP. Несмотря на отсутствие в геноме типичных полноценных генов, кодирующих NOS млекопитающих, у ряда грибов методом, основанным на превращении ³H- или ¹⁴C-L-аргинина в ³H- или ¹⁴C-L-цитруллин, выявлен данный фермент. Представляется важным дальнейшее подробное изучение ферментов, определяющих синтез NO, у этих организмов, а также NO-метаболизирующих флавогемоглобинов и NO-редуктазы.

Работа выполнена в рамках госзадания 0104-2019-0024 для ФИЦ биотехнологии РАН.