1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Прикладная биохимия и микробиология
  4. T. 57, № 4, 2021

Прикладная биохимия и микробиология, 2021, T. 57, № 4, стр. 326-331

CRISPR-интерференция аденилатциклазы Mycobacterium tuberculosis

Н. И. Надолинская 1, *, М. В. Замахаев 1, М. С. Шумков 1, Д. К. Армянинова 1, Д. С. Карпов 2, А. В. Гончаренко 1

1 Институт биохимии им. А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр “Фундаментальные основы биотехнологии” Российской академии наук
119071 Москва, Россия

2 Центр высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины, Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук
119991 Москва, Россия

* E-mail: nioriss@gmail.com

Поступила в редакцию 25.12.2020
После доработки 20.01.2021
Принята к публикации 22.02.2021

Полный текст (PDF)

Аннотация

В работе описана модификация вектора pRH2521 системы pRH2502/pRH2521, используемой для CRISPR-dCas9-опосредованной РНК-интерференции микобактерий. Введенная модификация обеспечивала повышение эффективности клонирования спейсеров направляющих РНК. Способность изменённой системы pRH2502/pRH2521подавлять транскрипцию определенных генов проверена на примере генов аденилатциклаз Mycobacterium tuberculosis. Полученные результаты выявили ограничения использования системы pRH2502/pRH2521 для CRISPR-интерференции, связанные с вероятностью нахождения участка PAM в области промотора подавляемого гена.

Ключевые слова: CRISPR, CRISPRi, туберкулез, микобактерии, аденилатциклазы

Несмотря на усилия медицинского и научного сообщества, туберкулез (ТБ) остается основной причиной смерти среди инфекционных заболеваний. По данным ВОЗ, он ежедневно уносит жизни около 4000 человек [1], что сопоставимо с количеством ежедневных смертей от COVID-19 в пик пандемии коронавирусной инфекции в 2020 г. Функции почти четверти из 4000 генов Mycobacterium tuberculosis (Mtb) остаются неизвестными, хотя 5% из них предположительно значимы для роста [2] и могут быть потенциальными мишенями при разработке противотуберкулёзных препаратов и вакцин. Технология CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) – многофункциональный инструмент генной инженерии [3], созданный из бактериальной системы приобретенной устойчивости к фагам и плазмидам. CRISPR-ассоциированная нуклеаза образует комплекс с направляющей РНК (gRNA), предназначенной для распознавания интересующей целевой последовательности (протоспейсера) и расположенного рядом участка (мотива) PAM (protospacer adjacent motif), состоящего из 2–6 пар оснований ДНК. Результатом узнавания и связывания комплекса gRNA и CRISPR-ассоциированной нуклеазы с целевой последовательностью является ее двухцепочечный разрыв. В процессе репарации разрыва возможно направленное редактирование последовательности ДНК. Позже метод был адаптирован для направленного подавления экспрессии генов без изменения последовательности ДНК. Специфичное подавление транскрипции с использованием CRISPR было названо CRISPR-интерференцией (CRISPRi) [4–6].

Для осуществления CRISPR-Cas9 интерференции нуклеаза Cas9 была лишена эндонуклеазной активности путем замены двух аминокислот (D10A и H841A) в никазных доменах RuvC и HNH исходного белка [5]. Поскольку ДНК-связывающая активность dCas9 не была затронута, комплекс этой нуклеазы с направляющей РНК может обратимо связывать ДНК-мишень, вследствие чего происходит блокировка транскрипции целевых генов. Наличие индуцибельного промотора делает регуляцию системы CRISPRi более тонкой и точной [7]. В результате CRISPRi-опосредованная репрессия генов может достигать 99% и приводить к фенотипическим изменениям, сходным с нокаутированием гена [8]. Такой подход позволяет изучать функции неизвестных генов, не прибегая к длительному и сложному получению делеций.

Оптимизированная для микобактерий система CRISPR-dCas9-опосредованной РНК-интерференции [9] включает вектор для экспрессии dCas9 pRH2502 и вектор pRH2521 для клонирования спейсеров, кодирующих направляющую РНК для нацеливания на интересующий ген. Авторы работы [9] продемонстрировали подавление экспрессии нескольких генов Mtb и возможность модуляции степени ингибирования транскрипции. Ключевым моментом, влияющим на эффективность подавления экспрессии, оказалась близость протоспейсера к промоторному участку.

Методически CRISPR-интерференция с помощью системы pRH2502/pRH2521 включает следующие этапы. Первый – это клонирование подобранных направляющих РНК в вектор pRH2521, затем последовательная трансформация в Mtb вектора pRH2502 с dCas9 (получение клеток Mtb-pRH2502), трансформация вектора с pRH2521-gRNA в Mtb-pRH2502 (получение клеток Mtb-pRH2502/ pRH2521-gRNA). Далее следует индукция CRISPR-интерференции и анализ результатов с помощью ПЦР в реальном времени. Оказалось, что эффективность клонирования спейсеров направляющей РНК в вектор pRH2521 довольно низка. В связи с этим, нами была поставлена задача улучшения эффективности клонирования путeм модификации вектора pRH2521. Модифицированная система была использована для оценки возможности подавления с ее помощью транскрипции генов аденилатциклаз (АС) микобактерий, представляющих значительный научный интерес с позиций их влияния на физиологию Mtb.

Циклический 3', 5'-AMP (cAMP) является одним из наиболее широко распространённых вторичных мессенджеров бактерий, архей и эукариот [10].

У микобактерий АС, осуществляющие синтез сАМР, кодируются необычно большим количеством различных генов. При этом передача сигналов сАМР у Mtb не связана с классической системой катаболитной репрессии, характерной для многих бактерий [11]. Уровень сАМР у туберкулeзной палочки практически не зависит от количества глюкозы в среде культивирования и регулирует иные метаболические пути, а также взаимодействие патогена с хозяином [12].

Ранее нами было показано [13], что гиперэкспрессия гена АС Rv2212 препятствует переходу Mtb в покоящееся состояние. Клетки, гиперэкспрессирующие АСRv2212, демонстрировали значительно более высокую скорость роста в легких и селезeнке инфицированных мышей по сравнению с контрольным штаммом и в отличие от контрольного штамма приводили к гибели ТБ-устойчивых мышей [13]. Вклад остальных генов АС в вирулентность Mtb в настоящее время неизвестен.

Цель работы – модификация системы pRH2502/ pRH2521, используемой для CRISPR-dCas9-опосредованной РНК-интерференции микобактерий, и оценка ее возможностей для CRISPR-интерференции генов АС Rv2212, Rv1320с, Rv1319с, Rv1318с.

МЕТОДИКА

Векторы для экспрессии dСas9 и sgRNA. С целью создания системы для CRISPR/Cas-нокдауна были приобретены векторы (“Addgene”, Великобритания), оптимизированные для работы с микобактериями [9]: плазмида pRH2502, несущая dCas9Spy из Streptococcus pyogenes, и плазмида для направляющих РНК для Cas9 pRH2521.

Модификация вектора pRH2521 для оптимизации клонирования спейсеров направляющих РНК. Для получения вектора pRH2521-α с плазмиды pCRCT был амплифицирован ген α-пептида β-галактозидазы lacZα. ПЦР-продукт гидролизовали по BbsI-сайтам и клонировали в вектор pRH2521, предварительно гидролизованный BbsI. В результате была создана плазмида, позволяющая отбирать колонии бактерий, содержащие вставку спейсеров, с помощью бело-голубой селекции в присутствии субстрата β-галактозидазы X-Gal. Колонии клеток, несущих пустой вектор pRH2521-α, окрашивались в синий цвет, а колонии бактерий, содержащие вставку спейсеров, теряли α-пептид и в присутствии хромогенного субстрата β-галактозидазы X‑Gal не имели синего окрашивания. Названия и последовательности праймеров приведены в табл. 1, сайт BbsI выделен жирным шрифтом.

Таблица 1.  

Олигонуклеотиды и праймеры, использованные в исследовании

Название Последовательность Амплифицируемый участок
UpBbsLacZα ATTTCTACGGGAATGTCTTCTCAG CCGCTACAGGGCGCGTCCCAT Ген α-пептида β-галактозидазы
LowBbsLacZα AGTAGAAAAACGAGTCTTCTGGAA AGCGGGCAGTGAGCGCAA
gRNA Rv2212 CTTGGACTTCGACGCCCTCG Направляющая РНК для гена Rv2212
gRNA Rv1320c GCCACCACTCGACACTTGCC Направляющая РНК для гена Rv1320c
UpRT2212 GCGGGCCGGCTTGCTCACCTACCT Ген Rv2212
LowRT2212 CGGCGTTCGGCTTGCACCATCTCT
UpRT1320 CCGCATTGGGTGTCGTTCG Ген Rv1320с
LowRT1320 TGAGCCAGTAGGTGCCCAGTATGA
UpRT1319 CCGACGGGCGCAACACCTT Ген Rv1319с
LowRT1319 ACGCCCCGCCGATATCCCACAGAA
UpRT1318 TCCCGAAGACAAGGCACTGG Ген Rv1318с
LowRT1318 CCTGGCACTCGGGCATTTCGT T

Подбор спейсеров направляющих РНК для генов аденилатциклаз Mtb. Для подбора спейсеров gRNA использовали ресурс http://grna.ctegd.uga.edu/, в который по просьбе авторов настоящей работы был внесен геном Mtb. Были подобраны направляющие для нокдауна выбранных генов АС с использованием эндонуклеазы Cas9. Последовательности спейсеров направляющих РНК приведены в табл. 1.

Подавление экспрессии генов оперона Rv1320c, Rv1319c, Rv1318c осуществляли с помощью одной общей направляющей gRNA.

Клонирование спейсеров направляющих РНК для генов аденилатциклаз Mtb. Спейсеры направляющих РНК подбирали по принципу максимальной близости к старту транскрипции, насколько это позволяло наличие в целевой области PAM-мотива (рис. 1).

Рис. 1.

Взаимное расположение элементов интерференции генов Rv2212 (а) и Rv1320с (б).

Для клонирования спейсеров направляющих РНК был проведён дизайн олигонуклеотидов, которые, отжигаясь друг на друга, образовывали липкие концы, совместимые с липкими концами вектора pRH2521-α, образующиеся после его гидролиза эндонуклеазой рестрикции BbsI (рис. 2).

Рис. 2.

Спейсер направляющей РНК для подавления экспрессии гена Rv2212 (а) и генов оперона Rv1320c-Rv1319c-Rv1318c (б).

Бактериальные штаммы, среды, условия культивирования. В исследовании использованы бактериальные штаммы Escherichia coli DH5α и M. tuberculosis H37Rv.

Клетки E. coli DH5α выращивали в среде Лурия-Бертани (LB) с добавлением антибиотиков, когда это было необходимо (50 мкг/мл канамицина (Km) и/или 50 мкг/мл гигромицина (Hg). Mtb культивировали в средах Миддлбрука 7H9/7Н10 с добавлением ростовой добавки OADC (“Himedia”, Индия) и 0.025% тилоксапола и, при необходимости, антибиотиков (20 мкг/мл Km и/или 25 мкг/мл Hg). Культивирование микобактерий проводили в соответствии с рекомендациями Т. Пэриш [14].

Векторы системы CRISPRi трансформировали в Mtb последовательно (pRH2502, затем pRH2521-α-gRNA) методом электропорации, которую проводили на приборе Gene Pulser Xcell (“Bio-Rad”, США) согласно протоколу [14].

После электропорации Mtb вектором pRH2502 через 4 нед. были получены единичные колонии на среде с Km. Клетки с плазмидой pRH2502 были выращены в жидкой среде и трансформированы плазмидами pRH2521-α-gRNA. Через 4 нед. на среде с Km и Hg были получены колонии, содержащие пару векторов pRH2502/pRH2521-α-gRNA. Далее трансформанты подращивали на жидкой среде 2–3 нед., после чего синтез направляющих РНК и экспрессию dCas9 индуцировали добавлением тетрациклина в концентрации 20 нг/мл.

Подготовка образцов для ПЦР в реальном времени. После 24 ч индукции клеточную биомассу собирали и с помощью коммерческого набора RNeasy Mini Kit (“Qiagen”, Германия) выделяли тотальную РНК, которую затем очищали от примесей ДНК путём обработки ДНКазой I Ambion DNase I RNase free (“Thermo Scientific”, США), не содержащей РНКаз. Удаление примесей ДНК подтверждали ПЦР. Подготовленные образцы РНК служили матрицей для синтеза кДНК с использованием рассеянной затравки. Полученную кДНК использовали в качестве матрицы для ПЦР в реальном времени.

ПЦР в реальном времени. Для проведения ПЦР в реальном времени использовали наборы iQ SYBR Green Supermix Sample (“Bio-Rad”, США). Реакции осуществляли с использованием прибора “Mini Opticon Real-time PCR System” (“Applied Biosystems”, США) согласно протоколу производителя. В качестве референсного гена использовали ген 16S рРНК. Эксперименты проводили в трех технических повторах. Специфические праймеры, использованные в реакции, представлены в табл. 1.

Обработку результатов qRT-PCR проводили с использованием программы LinRegPCR v. 2017.0 (Heart Failure Research Center, Нидерланды), анализ полученных данных осуществляли методом 2–∆∆Ct.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Модификация вектора pRH2521 для оптимизации клонирования спейсеров направляющих РНК. Двухплазмидная система pRH2521/pRH2502 исходно была разработана для CRISPR-интерференции (CRISPR-нокдауна) генов микобактерий [9]; соответствующие модификации и свойства векторов описаны выше. Однако, оказалось, что эффективность клонирования спейсеров направляющей РНК в сайты рестрикции BbsI вектора pRH2521 была низкой, менее 10%, что затрудняло отбор клонов, несущих плазмиду со спейсерами. Для облегчения задачи клонирования спейсеров направляющей РНК в вектор pRH2521 по сайтам BbsI нами был клонирован ген α-пептида β-галактозидазы lacZα. В результате колонии клеток, несущих пустой вектор pRH2521-α, окрашивались в синий цвет, а колонии бактерий, содержащих вектор со вставкой спейсеров, теряли α-пептид и в присутствии X-Gal – хромогенного субстрата β-галактозидазы – не имели синей окраски. Такая модификация вектора pRH2521 позволила легко отбирать целевые клоны с помощью бело-синей селекции.

Оценка эффективности подавления транскрипции генов Rv2212, Rv1318, Rv1319, Rv1320 с помощью системы pRH2502/pRH2521-α CRISPRi. В результате проведения CRISPRi с помощью системы pRH2502/pRH2521-α удалось добиться подавления экспрессии гена Rv2212 на 43% (рис. 3). Гены Rv1320с, Rv1319с, Rv1318с находятся в составе единого оперона и транскрибируются в направлении от Rv1320с к Rv1318с. Транскрипцию генов оперона Rv1320-Rv1319-Rv1318 с помощью выбранной направляющей РНК подавить не удалось. Такой результат, видимо, связан с низким уровнем экспрессии исследуемого оперона в условиях in vitro. Нельзя исключать, что экспрессия оперона в условиях инфицированных макрофагов будет выше и, соответственно, можно будет добиться подавления экспрессии выбранных генов, а также наблюдать фенотипические эффекты такого подавления.

Рис. 3.

Относительная экспрессия (отн. ед.) генов аденилатциклаз Rv2212 и оперона Rv1320c-Rv1319c-Rv1318c в условиях активации системы pRH2502/pRH2521-α при индукции тетрациклином (Tet+). В качестве контроля использован уровень экспрессии в отсутствие индукции тетрациклином(Tet–). Представлены средние значения ± стандартное отклонение.

Авторы системы pRH2502/pRH2521 сообщали о подавления уровня экспрессии от 10–50% и до 80–90%. Это было сделано на генах inhA, dfrA, wag31 и ftsZ, первые два из которых представляют собой мишени для изониазида и метотрексата соответственно [15, 16], а два других участвуют в формировании морфологии клеток [17, 18]. Специфика выбора мишеней интерференции позволила кроме детекции подавления экспрессии наблюдать фенотипические проявления работы CRISPRi.

Более эффективное снижение генной экспресии, возможно, могло бы быть достигнуто при выборе в качестве протоспейсера участка ДНК, комплементарного промоторной области анализируемых генов, однако для ингибируемых генов аденилатциклаз расположение промотора требует уточнения. Другим ограничением метода явилась необходимость присутствия в непосредственной близости от протоспейсера определенного PAM (NGG). В экспериментах Сингха с соавт. [9] были исследованы разные варианты мишеней (захватывающие 35 элемент промотора, участок 5'-нетранслируемой области между сайтом начала транскрипции и кодоном инициации трансляции и последовательность на 5'-конце белок-кодирующей области ДНК). По результатам исследования авторы сделали вывод о важности выбора протоспейсера вблизи промоторной области. К сожалению, найти подходящие направляющие РНК в функционально различных участках матрицы оказывается возможным не для всех генов. Аналогичным образом, не для всех генов известна область промотора. И, кроме того, в узкой области желаемого места отжига направляющей РНК далеко не всегда можно обнаружить PAM, что также является ограничением метода и, по-видимому, одной из причин неудачного подавления оперона Rv1320-Rv1319-Rv1318.

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что проведенная модификация вектора pRH2521 для оптимизации клонирования спейсеров направляющих РНК позволяет легко осуществлять селекцию целевых клонов. Система pRH2502/pRH2521-α может быть эффективно использована для CRISPR-интерференции, но с ограничениями, которые определяются возможностью нахождения PAM в области картированного промотора.

Работа выполнена при частичной поддержке РФФИ (грант № 1901500149A).

Список литературы

  1. Global Tuberculosis Report.World Health Organization, 2020. Geneva.

  2. Zhang Y., Ioerger T., Huttenhower C., Long J., Sassetti C., Sacchettini J. et al. // PLoS Pathog.2012. V. 8. № 9. e1002946.

  3. Zhang F., Wen Y., Guo X. // Human Molecular Genetics. 2014. V. 23. № R 1. P. R40–R46.

  4. Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. // Science (New York). 2012. V. 337. № 6096. P. 816–821.

  5. Qi L., Larson M., Gilbert L., Doudna J., Weissman J., Arkin A., Lim W. // Cell. 2013. V. 152. № 5. P. 1173–1183.

  6. Larson M., Gilbert L., Wang X., Lim A., Weissman J., Qi L. // Nat. Protoc. 2013. V. 8. P. 2180–2196.

  7. Ehrt S., Schnappinger D. // Future Microbiol. 2006. V. 1. № 2. P. 177–184.

  8. Cleto S., Jensen J., Wendisch V., Lu T. // ACS Synthetic Biology. 2016. V. 5. № 5. P. 375–385.

  9. Singh A., Carette X. et al. // Nucleic Acids Research 2016. V. 44. № 18. P. e143.

  10. Botsford J., Harman J. // Microbiol. Rev. 1992. V. 56. № 1. P. 100–122.

  11. De Carvalho L., Fischer S., Marrero J., Nathan C., Ehrt S., Rhee K. // Chem. Biol. 2010.V. 17. № 10. P. 1122–1131.

  12. Bai G., Schaak D., McDonough K. // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2009. V. 55. № 1. P. 68–73.

  13. Shleeva M., Kondratieva T., Demina G., Rubakova E., Goncharenko A., Apt A., Kaprelyants A. // Front. Cell. Infect. Microbiol. 2017. V. 7. № 370.

  14. Mycobacteria Protocols. / Ed. T. Parish, D. Roberts. N.Y.: Media Springer Science + Business, 2015. 103 p.

  15. Larsen M., Vilchèze C. et al. // Mol. Microbiol. 2002. V. 46. № 2. P. 453–66.

  16. White E., Ross L., Cunningham A., Escuyer V. // FEMS Microbiol Lett. 2004. V. 232. № 1. P. 101–105.

  17. Kang C., Nyayapathy S., Lee J., Suh J., Husson R. // Microbiology (Reading). 2008.V. 154. (Pt 3). P. 725–735.

  18. Dziadek J., Rutherford S., Madiraju M., Atkinson M., Rajagopalan M. // Microbiology (Reading). 2003. V. 149. (Pt 6). P. 1593–1603.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Прикладная биохимия и микробиология

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал