Прикладная биохимия и микробиология, 2021, T. 57, № 4, стр. 394-401

МЕТОДИКА

Объекты исследований. Объектами исследования служили семена и проростки гороха (Pisum sativum L.) сорта Торсдаг. Семена урожая 2017 г. получены при выращивании растений гороха в открытом грунте на территории СИФИБР СО РАН. В качестве инокулятов использовали бактерии Rhizobium leguminosarum bv. viceae (штамм 245 а – RCAM 1022, получен из Всероссийского института сельскохозяйственной микробиологии, г. Пушкин, Россия), и Pseudomonas syringae pv. pisi штамм. 1845, Azotobacter chroococcum штамм Az dl0 ВКМ В-2272 Д, Rhodococcus erythropolis штамм 108 ВКМ – Ac 2784 D из коллекции Центра коллективного пользования (ЦКП “Биоресурсный центр” Сибирского института физиологии и биохимии растений (СИФИБР СО РАН).

Эксперименты с проростками проводили по схеме, описанной нами ранее [12]. Согласно схеме прорастание семян и рост проростков, служивших исходным материалом в работе, проводили на влажной фильтровальной бумаге в термостате без освещения при температуре 21°С в течение 48 ч. Далее проростки инкубировали в условиях гидрокультуры в камере BINDER KBW-240 (“Binder”, Германия) при 21°С, освещении 81 мкМ ⋅ м^–2 ⋅ с^–1 и фотопериоде 16/8 ч (день/ночь) в течение 24 ч. При изучении межбактериальных взаимодействий эндофитных бактерий с вносимыми в среду бактериями в составе инокулятов верхнюю часть проростков (семя + + эпикотиль) располагали на поверхности пластиковой решетки. В отверстия решетки, служившей также крышкой сосуда с водной средой объемом 240 мл, пропускали корни проростков, которые на расстоянии 1.5 см от поверхности решетки погружали в водную среду. При таком размещении верхняя часть проростков не контактировала с водой. Для предотвращения проникновения в сосуды бактерий из внешней среды сверху на крышку сосудов с растениями помещали плотно прилегающие по ее краям стеклянные чашки. Для получения достоверных доказательств выхода эндофитных бактерий из корней в прикорневую зону при проведении экспериментов использовали специальную конструкцию. Она представляла собой стеклянный цилиндр, сверху закрываемый ватным тампоном, и помещенную вертикально в его нижней части пластиковую непрозрачную пробирку объемом 15 мл с крышкой. В отверстие в крышке пробирки продевали корни проростков. Корни внутри пробирки на расстоянии 1.5 см от крышки погружали в водную среду без бактерий.

Средние размеры корней исходных проростков имели длину 30–35 мм, по окончании эксперимента – 46–58 мм. Для оценки взаимодействия растения с возникающими в водной среде ассоциациями бактерий прослеживали влияние последних на рост корней.

В водную среду для проростков вносили необходимые для роста микроэлементы из расчета 1 мл/л воды каждого раствора солей: ZnSO₄ (0.05 г/л), NaMoO₄ (1.76 г/л), CuSO₄ (0.05 г/л), MnCl₂ (0.35 г/л), H₃BO₃ (0.5 г/л). Одновременно с помещением корней проростков в водную среду в нее вносили бактерии R. leguminosarum bv. viceae, P. syringae pv. pisi A. chroococcum, R. erythropolis. В среду с контрольными растениями инокулят не вносили. В начале и конце эксперимента (экспозиции) в водной среде, где росли корни проростков, подсчитывали количество колониеобразующих единиц (КОЕ).

Поверхностное обеззараживание семян, используемых для исследования в них эндофитных бактерий и для получения проростков, проводили в 3 этапа. Вначале промывали их мыльным раствором, затем помещали на 10 мин в 95%-ный этанол, а после отмывания – на 30 мин в 3%-ный раствор пероксида водорода. После отмывки от раствора пероксида семена на 30 мин заливали нагретой до 60°С водой. Для получения проростков после остывания воды семена набухали в течение 6–7 ч. Набухание семян, рост проростков, процедуры, проводимые с проростками, происходили в строго соблюдаемых асептических условиях.

Наличие и состав эндофитных бактерий в семенах исследовали через 24 ч их набухания в стерильной воде. Семена, растирали до кашицы в керамической ступке, заливали небольшим объемом стерильной воды, перемешивали полученную массу и после 24-часового настаивания отбирали 1 мл жидкости для микробиологического анализа.

Культуры бактерий. Культуры бактерий выращивали на твердых агаризованных средах. Для бактерий R. leguminosarum bv. viceae и P. syringae pv. pisi среды готовили на гороховом отваре по прописи Берестецкого [19], для бактерий A. chroococcum использовали среду Эшби, для R.erythropolis – питательный агар на основе гидролизата говяжьего мяса (ГМФ-Агар, “Научно-исследовательский центр фармакотерапии ООО”, Россия).

Определение количества бактерий в водной среде роста корней. Титр бактерий, вносимых в водную среду, определяли по оптической плотности при 595 нм на фотометре для микропланшетов “iMark” (“Bio-Rad Microplate Manager”, США), и по количеству КОЕ. КОЕ в водной среде определяли в момент помещения на неё корней и через 24 ч. КОЕ подсчитывали, после разведения и высева разбавленных в 10²–10⁶ раз суспензий на твердые агаризованные среды. Суспензии с бактериями из водной среды с проростками контроля наносили на твердую среду, приготовленную на гороховом отваре в соответствии с прописью из работы [19]. Рост бактерий инокулятов оценивали по соотношению КОЕ в средах с растениями в начале и через 24 ч экспозиции, выраженному в процентах. Содержание (общее) эндофитных бактерий за 24 ч экспозиции в тех же средах оценивали по соотношению КОЕ для них и бактерий инокулятов, и выражали в %. Основой для дифференцированного подсчета КОЕ для этих двух групп бактерий были морфологические показатели для их колоний.

Исследование состава эндофитных бактерий. Состав эндофитных бактерий исследовали на основании морфологических признаков колоний на твердых средах в чашках Петри, которые засевали водными суспензиями из сосудов с растениями, а также из водных вытяжек семян. Для микроскопических исследований окрашенных по Граму клеток использовали инвертированный микроскоп “Axio Observer” (“Carl Zeiss Microscopy”, Германия).

Изучение деструкции N-ФНА эндофитными бактериями. Суспензию клеток (смыв с твердого субстрата) переносили для адаптации в течение суток в конические колбы с жидкой минимальной средой, приготовленной, как описано в работе [20]. Суспензии с адаптированными бактериями переносили в ту же культуральную среду (объемом 250 мл) внесенную в коническую стеклянную колбу объемом 500 мл для инкубациив течение 1 сут с 10 мкМ N-ФНА (“Sigma”, США). При исследованиях деградации N-ФНА объем вносимых суспензий рассчитывали для получения конечного титра бактерий – 1.5 × 10³ кл./мл. Титр суспензии рассчитывали, измеряя оптическую плотность на планшетном спектрофотометре “Immunochem-2100” при 675 нм (“High Technology Inc.”, США).

Колбы с бактериями помещали на роторную качалку (60 об./мин) и выращивали при температуре 20–22°С. Выросшую культуру центрифугировали при 8000 g в течение 20 мин при 4°С. Из супернатанта после подкисления 2 н HCl до рН 3.0–4.0 этилацетатом экстрагировали ароматические соединения. Полученные экстракты упаривали досуха в вакууме в темноте, сухой остаток растворяли в небольших объемах очищенного от перекисей этилацетата и помещали в стеклянные бутылочки для газо-хромато-масс-спектрометрического (ГХ-МС) анализа

Анализ состава ароматических продуктов деградации N-ФНА. Анализ состава этилацетатных экстрактов из культуральных сред проводили методом ГХ-МС на газожидкостном хроматографе с масс-спектрометрическим детектором с использованием хромато-масс-спектрометра “7000QQQTripleQuad/ 7890A MSD/DS” (“Agilent Technology”, США), как описано в работе [13]. Для идентификации анализируемых соединений использовали библиотеки масс-спектров NIST08 и WILEY7, а также проводили сравнение с аутентичными образцами N-ФНА (“Sigma”, США), бис (2-этил-гексил) фталата (синоним – диоктилфталат), диэтилфталата (“Sigma–Aldrich”, Германия) и дибутилфталата (“Реахим”, Россия).

Статистическая обработка. Для статистической обработки полученных результатов использовали пакет R 3.6.2. На рис. 1 и в табл. 2 и 3 приведены средние значения полученных показателей и стандартные отклонения для них, рассчитанные из трех независимых экспериментов.

Рис. 1.

Скорость роста корней проростков гороха (мм/ч) в течение 24 ч при инокуляции разными видами бактерий: К – контроль; бактерии инокулята водной среды: Rhi – R. leguminosarum bv. viceae, Az – A. chroococcum, Ps – P. syringae pv pisi, Rho – R. erythropolis.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Для выяснения роли эндофитных бактерий, появляющихся в прикорневой зоне корней проростков гороха в результате перемещения из корневых тканей во внешнюю среду, в биоконтроле ризосферного микробиома исследования проходили по двум направлениям. Первое из них связано с выявлением изменений в составе и концентрации бактерий в водной среде для роста корней проростков гороха (Pisum sativum L.) через 1 сут после внесения в нее разных видов ризосферных бактерий. Второе направление исследований связано с выяснением возможного вклада изучаемых эндофитных бактерий в метаболизм N-ФНА.

Приведенные в табл. 1 результаты свидетельствуют об обнаружении эндофитных бактерий гороха в семенах и появлении части этих бактерий в ризосфере корней проростков. Результаты в табл. 1 показали, что максимально 6 из 11 выделенных из семян культур бактерий обнаруживались в водной среде, где происходил рост корней проростков гороха. Верхняя часть проростков (семя + эпикотиль и часть прилегающего к ним корня длиной 1.5 см) не касались поверхности водной среды (см. Методику), куда была погружена большая часть корня. Наиболее вероятно, что обнаруженные в водной среде бактерии перемещались в среду из семени через ткани корня.

Все эти бактерии были грамположительными. Из них 4 культуры (№ 2, 7, 8, 11, табл. 1) палочковидной формы, спорообразующие, относились к роду Bacillus. В культурах 1, 3, 4, 5, 10 (табл. 1) представлены бактерии, имеющие форму кокков, а культуры 6, 10 не образующие споры палочки.

В настоящее время не ясно, почему только 6 из 11 обнаруженных нами в семенах эндофитных бактерий оказались способными транспортироваться из корней в водную среду. Возможно, ответом станут данные по определению у них активности гидролитических ферментов, которые, скорее всего, и обусловливают их продвижение через ткани корней.

Обнаружение бактерий в прикорневой зоне проростков гороха послужило основанием для изучения их взаимодействия с ризосферными бактериями. Такие взаимодействия неизбежно должны происходить с нодулирующими корни гороха бактериями R. leguminosarum. Вероятны они и с бактериями, являющимися патогенами для названного растения, к которым, в частности, относятся P. syringae pv. pisi, использованные в экспериментах. Без сомнения, те же эндофитные бактерии в ризосфере будут иметь влияние на свободноживущие почвенные бактерии. Такое влияние было подтверждено результатами работы, в которой в качестве инокулятов для корней проростков использовали представителей свободноживущих бактерий A. chroococcum и R. erythropolis. A. chroococcum – азотфиксирующие бактерии, могли оказывать положительное влияние на рост растений гороха [21]. R. erythropolis, был выделен из ризосферы растений Elytrigia repens, росших на загрязненных нефтепродуктами почвах. Штамм способен активно деградировать полициклические ароматические соединения и положительно влиял на рост растений в условиях загрязнения почв нефтепродуктами [22, 23].

Соотношения концентраций эндофитных бактерий и бактерий, использованных в качестве инокулятов, определенные в водной среде по величине КОЕ через 1 сут экспозиции может служить показателем межмикробных взаимодействий в прикорневой зоне проростков гороха. Вторым показателем взаимодействий является количество вариантов эндофитных бактерий, появившихся на твердой среде совместно с бактериями инокулятов.

Титр бактерий инокулятов, вносимых в среду для корней проростков гороха, рассчитывали по показателям оптической плотности и затем корректировали по КОЕ после высева суспензии на твердые среды в чашках Петри. В начале экспериментов показатели КОЕ варьировали в пределах 0.1–0.3 × 10⁷ кл./мл – для ризобий, и 1.4–1.9 × × 10⁷ кл./мл – для псевдомонад, азотобактеров и родококков. Бактерии в среде роста корней неинокулированных проростков (контроль) в начале экспозиции отсутствовали, а через 24 ч их роста суммарный показатель КОЕ для всех обнаруженных нами в этой среде эндофитных бактерий составлял 2.29 ± 0.03 × 10⁷ кл./мл.

Компоненты корневых экссудатов, по-видимому, способствовали росту бактерий, внесенных в водную среду в качестве инокулята, но в разной степени для различных исследуемых видов. Из результатов табл. 2 следует, что максимальный прирост КОЕ наблюдали у A. chroococcum. За ним в порядке убывания могут быть размещены ризобии, родококки и псевдомонады.

О различном характере взаимодействий бактерий, внесенных в водную среду роста корней в виде инокулята, с бактериями, поступившими в эту среду из корней можно судить по результатам, приведенным в табл. 2. Так, в водной среде с ризобиями доля эндофитных бактерий выше, чем ризобий (табл. 2). При этом состав колоний эндофитных бактерий по морфолого-культуральным показателям был аналогичен их составу в среде контроля (табл. 1). Возможно, имеет место совместимость исторически сформировавшихся бактериальных ассоциаций, которые благоприятны для сосуществования каждого из представителей не только в тканях растения, но и в ризосфере растения-хозяина.

В среде с азотобактером обнаружено всего четыре варианта эндофитных бактерий (табл. 1). Это может быть связано со слабым ростом некоторых эндофитов на среде Эшби. В процессе работы выяснилось, что очень слабый рост на среде Эшби имели 2 из 6 культур (культуры бактерий № 1 и 5, табл. 1) эндофитных бактерий, выделенных из водных сред. По результатам, представленным в табл. 2, количество эндофитных бактерий в среде роста корней составляло около 50% от количества клеток A. chroococcum. Это достаточно хороший показатель совместного роста бактерий азотобактера и эндофитных бактерий. К такому заключению можно придти, учитывая, что доминирующие в ростовой среде бактерии A. chroococcum отличались от трех других видов инокулированных бактерий наиболее высоким приростом (табл. 2).

Твердые среды на основе горохового отвара и ГМФ-агара, использованные, соответственно, для анализа состава бактерий в водных средах с псевдомонадами и родококками (см. Методику), вполне подходили и для роста на них колоний всех выделенных изолятов эндофитных бактерий. Поэтому наблюдаемое в табл. 1 отсутствие четырех форм эндофитных бактерий в водных средах с P. syringae pv. pisi и R. erythropolis, наиболее вероятно объясняется антибактериальным действием этих двух видов бактерий. Кроме того, можно утверждать, что псевдомонады и родококки сосуществовали с двумя, но не одинаковыми представителями эндофитных бактерий семян гороха. Можно предположить избирательное подавление псевдомонадами и родококками эндофитных бактерий. Подтверждают отмеченное выше действие псевдомонад и родококков в отношении эндофитных бактерий растений гороха представленные в табл. 2 показатели относительного содержания последних в средах роста корней. Они более низкие, чем в средах с ризобиями и азотобактером. При этом самое низкое содержание эндофитных бактерий в среде с родококками.

Для оценки взаимодействия растения с формирующимися в водной среде ассоциациями бактерий прослеживали их влияние на линейный рост корней проростков гороха. Оказалось, что инокуляция бактериями R. leguminosarum bv. viceae и P. syringae pv. pisi не приводила к изменениям скорости их роста (рис. 1). Бактерии A. chroococcum усиливали, а бактерии R. erythropolis, напротив, заметно снижали рост корней. Примечательно, что два последних вида характеризовались высокой гормонсинтезурующей активностью [23, 24]. Именно этим свойством A. chroococcum объяснялось ускорение роста инокулированных этими бактериями корней проростков гороха в работе [21]. Однако причина ингибирующего влияния бактерий R. leguminosarum erythropolis, также активно синтезирующих ростстимулирующие фитогормоны, на рост корней тех же растений пока не ясна. Возможно, в клетках этого вида бактерий образуются соединения неизвестной природы негативно действующие на эндофитные бактерии растений гороха и на рост его корней.

В работах [12, 25] было показано, что в корнях бобовых культур и их корневых экссудатов обнаружены вещества N-ФНА и фталаты. Названные соединения оказывали ростподавляющее действие на бактерии R. leguminosarum bv. viceae, P. syringae pv. pisi, Clavibacter michiganensis sps. sepedonicus [12, 13]. Было установлено, что перечисленные виды бактерий способны образовывать фталаты при деградации N-ФНА [13]. То есть ряд видов бактерий, отнесенные к разным родам, способны деградировать полициклические ароматические соединения (ПАУ) по пути с образованием о-фталевой кислоты и затем фталатов. Обнаружена аналогичная способность к деструкции N-ФНА и у штамма A. chroococcum (данные не опубликованы), использованного в работе. У R. erythropolis способность к деградации N-ФНА не была исследована, однако ранее у этого вида установили высокую активность при деградации ПАУ нефти с образованием протокатеховой кислоты [22].

Обнаружение в среде роста корней проростков гороха эндофитных бактерий позволило предположить, что в их взаимоотношениях с ризосферными бактериями также могут быть задействованы N-ФНА и фталаты. В составе этих соединений, являющихся компонентами корневых экссудатов растений гороха [12, 25], возможны количественные и качественные (в составе фталатов) изменения при участии ризосферных бактерий, способных деградировать N-ФНА и преобразовывать одни виды фталатов в другие [14]. Правомерным является выяснение роли эндофитных бактерий в возникновении изменений в количестве N-ФНА и в составе фталатов.

Результаты, представленные в табл. 3, показали, что все 6 бактериальных культур, которые были выявлены в зоне роста корней проростков гороха, способны деградировать N-ФНА с образованием фталатов. Наиболее высокая деградирующая активность у культур № 3 и № 6, самая низкая – у культуры № 5. У исследуемых культур при деградации N-ФНА в культуральных средах, где они инкубировались в присутствии вышеназванного субстрата, оказалось различным соотношение видов фталатов (табл. 3). Диоктилфталат, характеризующийся сильным антибактериальных действием [13, 14], среди продуктов деградации N-ФНА преобладал в среде, куда вносили бактерии культуры № 3 и составлял большой процент в среде с бактериями культур № 1 и № 6. Дибутилфталат доминировал среди продуктов деградации N-ФНА в средах с бактериями большинства культур (исключая культуру № 6). Наиболее активно образовывали дибутилфталат бактерии культуры № 6. Данное соединение не всегда выказывает негативное действие на бактерии. Исследованиями авторов работы [14] обнаружено ингибирование этим соединением образования бактериальных биопленок. Подавление роста бактерий в планктонной культуре он вызывал только при высоких концентрациях, а при более низких стимулировал этот процесс. Таким образом, показано, что обнаруженные в ризосфере проростков гороха эндофитные бактерии способны образовывать фталаты при деградации N-ФНА.

Итак, приведенные в настоящей работе результаты показывают, что в ризосфере растений гороха наблюдался различный характер взаимодействия между эндофитными бактериями и свободноживущими ризосферными бактериями, характеризующимися разными типами отношений с растениями гороха. Благоприятным оказалось сосуществование этих бактерий с ризобиями, нодулирующими корни гороха. P. syringae pv. pisi, патоген для растений гороха, поражающий органы надземной части данного растения, по сравнению с тремя другими исследуемыми нами видами бактерий, показал наименее интенсивный рост в среде роста корней (табл. 3) и обнаружил способность подавлять эндофитные бактерии растения-хозяина (табл. 1, 3). Бактерии A. chroococcum и R. erythropolis, использованные в эксперименте, существенно различались по активности роста в среде обитания корней и по характеру влияния на эндофиты гороха. Влияние корневых экссудатов гороха, очевидно, способствовало хорошей адаптации бактерии A. chroococcum , которые при этом не вызвали значительных изменений в составе и концентрации эндофитных бактерий. Этот вид бактерий положительно влиял на рост корней проростков гороха. В противоположность азотобактерам, родококки показали в водной среде невысокий прирост и наибольшую для четырех обсуждаемых видов бактерий антибактериальную активность, а также ингибирующее действие на рост корней гороха.