1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Прикладная биохимия и микробиология
  4. T. 57, № 3, 2021

Прикладная биохимия и микробиология, 2021, T. 57, № 3, стр. 235-244

Плазмиды деградации хлорфеноксиуксусных кислот бактерий рода Raoultella

Н. В. Жарикова 1, *, Т. Р. Ясаков 1, Е. Ю. Журенко 1, В. В. Коробов 1, Т. В. Маркушева 1

1 Уфимский Институт биологии УФИЦ РАН
450054 Уфа, Россия

* E-mail: puzzle111@yandex.ru

Поступила в редакцию 17.08.2020
После доработки 27.11.2020
Принята к публикации 22.12.2020

Полный текст (PDF)

Аннотация

Представители вида Raoultella planticola, выделенные из почв, загрязненных отходами химического производства, использовали 2,4-дихлорфеноксиуксусную/2,4,5-трихлорфеноксиуксусную кислоты в качестве единственного источника углерода и энергии. Установлено, что клетки штаммов 33-4ch, 36D и 36T содержали плазмиды, обозначенные pRP33-4ch, pRP36D и pRP36Т соответственно. Анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов показал, что pRP33-4ch и pRP36Т, вероятно, являлись одной и той же плазмидой, в то время как в профилях рестрикции pRP36D содержались дополнительные фрагменты. Методом элиминации плазмид установлено, что гены деградации хлорфеноксиуксусных кислот имели внехромосомную локализацию. ПЦР-анализ показал отсутствие в геномах исследуемых штаммов известных генов инициации (tfdA и tftA) конверсии хлорфеноксиуксусных кислот. Идентифицированные промежуточные метаболиты (хлорфеноксиуксусная, феноксиуксусная кислоты и 2-кето-3-метил-муконовый полуальдегид) свидетельствовали о способности штаммов 33-4ch, 36D и 36T осуществлять полное дехлорирование ароматического кольца субстрата с последующим его мета-расщеплением.

Ключевые слова: 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота, 2,4,5-трихлорфеноксиуксусная кислота, плазмида деградации, tfd, tft, 2-гидроксимуконовый полуальдегид

2,4-Дихлорфеноксиуксусная (2,4-Д) и 2,4,5-трихлорфеноксиуксусная (2,4,5-Т) кислоты относятся к группе синтетических ауксинов, которые с конца второй мировой войны широко используются в качестве действующих агентов селективных гербицидов. Масштабное применение этих агрохимикатов привело к адаптации к ним почвенной микробиоты и селекции бактерий, способных к их активной деградации. Известно, что такие процессы идут, в основном, на уровне генов реакций первичного окисления субстратов, которые часто локализуются на внехромосомных элементах, что объясняет механизмы их распространения среди бактериальных популяций [1].

Известно, что в зависимости от степени галогенированности субстрата аэробная деградация хлорароматических соединений, в том числе и хлорфеноксиуксусных кислот, может пойти двумя основными метаболическими путями. Бактерии разлагают моно- и дихлорированные субстраты обычно по хлоркатехольному пути с последующим орто-расщеплением ароматического кольца [2]. Классический путь бактериальной деградации 2,4-Д штаммом Cupriavidus necator (ранее Alcaligenes eutrophus, Ralstonia eutropha и Wautersia eutropha) JMP134, локализованный на плазмиде pJP4, начинается с образования 2,4‑дихлорфенола (2,4-ДХФ) [3, 4]. Стадия инициации катализируется α-кетоглутарат(α-кГ)-зависимой диоксигеназой, кодируемой геном tfdA. 2,4-Дихлорфенолгидролаза (TfdB) осуществляет трансформацию 2,4-ДХФ до 3,5-дихлоркатехола (3,5-ДХК), а tfdCDEF-кодируемые ферменты – дальнейшую конверсию последнего через модифицированный орто-путь расщепления вплоть до β-кетоадипата (рис. 1а). Такой путь установлен для большинства известных к настоящему моменту бактериальных деструкторов 2,4-Д, относящихся к β- и γ-подклассам Proteobacteria родов Achromobacter, Burkholderia, Delftia, Halomonas, Pseudomonas, Ralstonia, Rhodoferax, Variovoraxи и др., полученных из почв сельскохозяйственного и промышленного назначения [5]. Для многих штаммов этой группы, так же как для штамма C. necator JMP134, характерна плазмидная локализация tfdA, tfdB и tfdCDEF детерминант деградации [6]. Необходимо отметить, что существуют другие группы деструкторов 2,4-Д, которые содержат или гомолог tfdA гена – tfdAα или негомологичные гены – cadAB, но все они строго принадлежат к таксону α-Proteobacteria.

Рис. 1.

Пути аэробной деградации хлорированных феноксиуксусных кислот у бактерий: а – 2,4-Д штамма C. necator JMP134 [3], б – 2,4,5-Т штамма B. phenoliruptrix АС1100 [8–10]. Условные обозначения: I – 2,4-Д; II – 2,4-дихлорфенол; III – 2,4-дихлоркатехол; IV – 2,4-дихлор-цис, цис-муконат; V – транс-2-хлордиенлактон; VI – цис-2-хлордиенлактон; VII – 2-хлормалеилуксусная кислота; VIII – 2,4,5-Т; IX – 2,4,5-трихлорфенол; X – 2,5-дихлоргидрохинон; XI – 5-хлоргидроксигидрохинон; XII – 2-гидрокси-1,4-бензохинон; XIII – гидроксигидрохинон; XIV – малеилуксусная кислота; XV – β-кетоадипат; TCA – цикл трикарбоновых кислот.

Второй основной метаболический путь установлен для бактерий, растущих на полигалогенированных ароматических субстратах, где ключевым метаболитом является не хлоркатехол, а хлорированные гидрохинон и/или гидроксигидрохинон. В дальнейшем происходит расщепление ароматического кольца с образованием малеилацетата, а затем – β-кетоадипата [7]. Подобным образом происходит конверсия 2,4,5-Т у штамма Burkholderia phenoliruptrix (ранее Pseudomonas cepacia, Burkholderia cepacia) АС1100 (рис. 1б), гены деградации которого имеют хромосомную локализацию [8–10].

Стадия инициации происходит в результате монооксигеназной активности 2,4,5-Т-оксигеназы, которая превращает 2,4,5-Т в 2,4,5-трихлорфенол [11]. Гены, кодирующие α- и β-субъединицы многокомпонентной 2,4,5-Т оксигеназы, отнесенной к оксигеназам Риске-типа, получили обозначение tftAB и позднее были локализованы еще у нескольких штаммов рода Burkholderia [12, 13].

Цель работы – исследование катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот и локализации генов деградации у бактерий рода Raoultella.

МЕТОДИКА

Объектами исследований служили три природных бактериальных штамма 33-4ch, 36D и 36T, изолированные из образцов почвы, загрязненной отходами химического производства (Уфа, Россия).

Выделение геномной ДНК, амплификация частичной последовательности гена 16S рРНК и секвенирование были описаны ранее в статье Жариковой с соавт. [14], дальнейший анализ проведен в работе Коробова с соавт. [15].

Методики выделения плазмидной ДНК, ее рестрикционный анализ и элиминация плазмид из клеток штаммов с использованием бромистого этидия опубликованы ранее [16].

Лизис клеток и выделение ДНК-матриц для ПЦР-реакций получали нагреванием бактериальных клеток 7 мин до 95°C, с последующим осветлением клеточного лизата центрифугированием в течение 5 мин на MiniSpin (“Eppendorf”, США) при 9840 g.

ПЦР проводили с использованием амплификатора ThermalCycler (“Applied Biosysteme”, США) в объеме 25 мкл, содержащем 67 мM трис-HCl (pH 8.3), 17 мM (NH4)2SO4, 0.001%-ный Tвин 20, 2.5 мM MgCl2, 25 пмоль каждого праймера, 2 мМ дНТФ – 1.0 мкл и 1.25 единиц Taq-полимеразы (“Sigma-Aldrich”, США), ДНК-матрица – 1 мкл осветленного клеточного лизата с концентраций геномной ДНК ~25 нг.

Амплификации гена tfdA проводили по следующей программе: 1) 95°С – 6 мин; 2) 94°С – 45 с; 3) 64°С – 30 с; 4) 72°С – 2 мин; 5) повтор 2, 3, 4 – 50 циклов; 6) 72°С – 2 мин. Использовали праймеры tfdA_F, 5' – GAGCACTACGCACTGAACTCCCG – 3', tfdA_R, 5' – CTTCGGCCACCGGAAGGCCT – 3' [17]. В качестве положительного контроля служила pJP4, плазмида деградации 2,4-Д.

Для амплификации гена tftA использовали следующие праймеры: tftA_F – 5' – ACATTCGACGGGAATTGGAA – 3', tftA_R – 5' – AGGATTGAAGAAATCCTGATA – 3', предложенные Хуонг с соавт. [13]. Реакцию проводили по следующей схеме: 94°С – 2 мин; 94°С – 1 мин; 50°С – 1 мин; 72°С – 1 мин; повтор 2, 3, 4 – 30 циклов; 72°С – 2 мин. В качестве положительного контроля использовали ДНК штамма Burkholderia sp. M38-VN3-2W, любезно предоставленную автором Хуонгом [13], с известной нуклеотидной последовательностью tftA.

Культуры бактерий (накопительные и чистые) выращивали в конических колбах (250 мл) на минимальной солевой среде М9 [18], содержащей в качестве единственного источника углерода 2,4‑Д/2,4,5-Т в концентрации 100 мг/л. Культивирование проводили при температуре 28°С в термостатируемой установке УВМТ-12-250 (“Элион”, Россия) при 120 об/мин. Интенсивность роста культуры оценивали по оптической плотности (OП590) клеточной суспензии с использованием фотоколориметра КФК-2 (Россия).

Определение количества хлорфеноксиуксусных кислот в культуральной жидкости проводили согласно руководству [19] с небольшими модификациями. Для анализов отбирали по 5 мл культуральной жидкости, освобождали от клеток центрифугированием при 3600 g в течение 30 мин. Супернатант подкисляли 2 н соляной кислотой до рН 2.0 и добавляли в пробы в качестве внутреннего стандарта 2,4,5-Т (при определении количества 2,4-Д) и 2,4-Д (при определении 2,4,5-Т) до конечной концентрации каждой метки 100 мг/л. Затем из проб хлорфеноксиуксусные кислоты экстрагировали трехкратно равными объемами хлороформа. После испарения хлороформа экстракты метилировали свежеприготовленным диазометаном и переводили в гексан (2 мл). Половину полученного образца использовали для определения интермедиатов, а остальное – для фракционирования методом тонкослойной хроматографии на пластинах силуфол UV-254 (“Ch-emapol”, Чехия). Сканирование образцов проводили при длине волны 260–280 нм в камере Хромоскана (“Joyce-Loebl”, Великобритания). Содержание хлорфеноксиуксусных кислот определяли по калибровочному графику для чистого стандарта.

Продукты метаболизма хлорфеноксиуксусных кислот определяли на хромато-масс-спектрометре NERMAG R-30-10 с хроматографом Carlo Erba MEGA 536010 (“Hewlett-Packard”, США). Условия определения: капиллярная колонка 15 м × × 0.25 мм, привитая фаза ДВ-1, растворитель гексан, температура инжектора 200°С, интерфейса 250°С, колонки от 80 до 250°С, скорость нагрева 3.5 мин. Масс-спектры электронного удара получали при температуре источника ионов, равной 250°С, энергии электронов, равной 70 эВ.

Интермедиаты идентифицировали с использованием системы обработки данных MS HP ChemStation, содержащей библиотеку из 138 000 масс-спектров Base Date WILEY138L.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Штаммы 36D и 36Т были испытаны на способность использовать 2,4-Д и 2,4,5-Т в качестве единственного источника углерода и энергии. Третий штамм – 33-4ch, уже описанный ранее как деструктор 2,4,5-Т [20 ] , культивировали только на 2,4-Д. Периодическое культивирование штаммов проводили в течение недели. Значительная убыль концентрации субстрата наблюдалась в период активного роста штаммов (1–2 сут), а после 5 сут она практически не менялась (рис. 2). Таким образом, все исследуемые штаммы проявили способность к конверсии 2,4-Д и 2,4,5-Т, однако более предпочтительным для них, особенно для 36D, оказался последний субстрат.

Рис. 2.

Зависимость значений ОП590 культуральной жидкости штаммов R. planticola 36 D (1), R. planticola 33 4ch (2) и R. planticola 36T (3) при выращивании культур на 2,4-Д (а) и 2,4,5-Т (б), динамика концентрации 2,4-Д (в) и 2,4,5-Т(г) в зависимости от времени.

В разное время активность штаммов-деструкторов 2,4-Д исследовали в условиях использования 2,4-Д как единственного источника углерода и энергии в концентрации от нескольких мг/л до нескольких сотен мг/л или даже г/л [5].

В то же время, в отличие от хорошо изученных и довольно распространенных бактерий, метаболизирующих 2,4-Д, известно на порядок меньше чистых культур, осуществляющих конверсию более хлорированного производного – 2,4,5-Т [21].

Впервые такой штамм АС1100 был получен с использованием технологии так называемого плазмид-ассоциированного молекулярного бридинга. Активно растущая культура АС1100 (таксономия этого штамма менялась: ранее была идентифицирована как Pseudomonas cepacia, потом Burkholderia cepacia, а затем Burkholderia phenoliruptrix) метаболизировала более 97% 2,4,5-T, присутствующего в среде в концентрации 1 мг/мл, в течение 6 сут. Однако способность к разложению 2,4,5-Т у штамма AC1100 оказалась нестабильной и самопроизвольно терялась с высокой частотой, что, скорее всего, было связано с его гибридным происхождением [22].

Второй штамм Nocardioides simplex 3E, изолированный в 1990 г., был способен использовать 2,4,5-Т при достаточно высоких концентрациях – до 4.0 мМ, однако полная деградация ксенобиотика происходила только при концентрации 0.04 мМ [23].

Относительно недавно, в 2007 г., из почв Вьетнама были выделены 353 штамма-деструктора 2,4-Д и 2,4,5-Т, От общего количества изолированных штаммов 65% оказались деструкторами 2,4,5-Т. Способность всех изолятов к деградации хлорфеноксиуксусных кислот проверялась на солевой среде, содержащей 100 мг/л 2,4-Д/2,4,5-Т [13].

Таким образом, исследованные в данной работе штаммы (особенно 36D) оказались более перспективными в качестве потенциальных агентов утилизации 2,4,5-Т и в дальнейшем могут быть использованы для решения проблем ремедиации территорий загрязненным этим гербицидом.

Известно, что конверсию 2,4-Д и 2,4,5-Т, как правило, контролируют разные генные кластеры, локализация которых часто коррелируют с таксономическим положением штамма.

Для культур 36D и 36Т были определены практически полные последовательности (1439 п.н., соответствующие позициям 42-1481 по номенклатуре E. coli) амплификатов генов, кодирующих 16S pРНК, которые оказались идентичными друг другу и 16S pДНК штамма Raoultella planticola 33-4ch (DQ333356), депонированной в базе данных GenBank ранее [20 ] .

Сравнение последовательностей 16S рДНК исследуемых штаммов и двух видов, принадлежащих к роду Klebsilella – K. planticola и K. ornithinolytica, продемонстрировало высокую степень их сходства (идентичность составила 99.5–99.8 и 99.3–99.6% соответственно).

Известно, что для представителей рода Klebsilella внутривидовые уровни сходства последовательностей 16S рДНК обычно превышают 99.0%. В то же время уровни межвидового сходства варьируют от 96.6 до 98.6% с одним исключением: сходство последовательностей 16S рДНК между K. planticola и K. ornithinolytica достигает внутривидового уровня 99.0–99.4% [24]. Некоторые исследователи даже не считают их разделение на два вида оправданным и рассматривают K. ornithinolytica как биогруппу K. planticola.

В пределах 16S рДНК у представителей рода Klebsiella выявлено несколько вариабельных областей, на протяжении которых были обнаружены сигнатурные нуклеотиды, которые оказались специфичны для каждого вида этого рода. В вариабельной области V7 (позиции 489–653) были идентифицированы только два нуклеотида в пределах целой последовательности 16S рДНК, по которым можно различить представителей видов K. planticola и K. ornithinolytica [24] (рис. 3).

Рис. 3.

Сравнение частичных нуклеотидных последовательностей вариабельной области V7 16S рДНК штаммов 36D (а) и 36T (б) и родственных культур Escherichia coli K-12, Klebsilella planticola ATCC 33531, Klebsilella planticola 7444, Klebsiella ornithinolytica 590681 и Enterobacter aerogenes NCTC 10006. Черным цветом выделены сигнатурные нуклеотиды.

Таким образом, наличие специфичных нуклеотидов в положениях 590 и 649 в последовательностях штаммов 36D и 36Т свидетельствовало об их принадлежности к виду K. planticola. Так как ранее три вида рода – K. planticola, K. ornithinolytica и K. terrigena были реклассифицированы в новый род Raoultella [25], то исследуемые штаммы были идентифицированы как Raoultella planticola 36D и Raoultella planticola 36Т.

Известно, что у β- и γ-подклассов Proteobacteria за деградацию 2,4-Д отвечает tfd-группа генов, которые часто локализованы на плазмидах [5]. Однако среди деструкторов γ-Proteobacteria ранее не идентифицировались штаммы, принадлежащие к роду Raoultella или реклассифицированые по принадлежности к данному роду виды K. planticola, K. ornithinolytica и K. terrigena.

Поиск внехромосомных элементов в клетках штаммов R. planticola 33-4ch, R. planticola 36D и R. planticola 36Т выявил наличие плазмид, обозначенных нами как pRP33-4ch, pRP36D и pRP36Т соответственно. С целью оценки их разнообразия был проведен анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) с использованием BamH I, Hind III и Pst I ферментов (рис. 4).

Рис. 4.

Электрофорез плазмид pRP33-4ch, pRP36D и pRP36Т после обработки BamH I (а), Hind III (б) и Pst I (в) ферментами рестрикции: 1, 2 – ДНК- маркеры λPst I и λHind III соответственно; 3, 5, 7 – нативные препараты pRP33-4ch, pRP36D, pRP36T; 4, 6, 8 – рестриктированные препараты pRP33-4ch, pRP36D, pRP36T. Стрелками показаны размеры фрагментов ДНК маркеров.

Профили рестрикции pRP33-4ch и pRP36Т по всем трем ферментам оказались идентичными, в то время как в профиле плазмиды pRP36D, в целом несомненно сходном с предыдущими, содержались дополнительные фрагменты (дорожки 6 на рис. 4а–4в). Скорее всего, pRP33-4ch и pRP36Т являются одной и той же плазмидой (или очень близкими), а pRP36D – ее вариантом, которая “захватила” некую нуклеотидную последовательность.

Размеры плазмид составили для pRP33-4ch и pRP36Т 110, а для pRP36D – 130 т. п. н. Известные плазмиды деградации β- и γ-подклассов Proteobacteria обладали сопоставимыми размерами, например: pJP4 (88 т. п. н.), pIJB1 (102 т. п. н.), pEST4011 (70 т. п. н.) и pMSB1 (80 т. п. н.) штаммов C. necator JMP134, Burkholderia cepacia 2a, Achromobacter xylosoxidans EST4002 и Azotobacter chroococcum MSB-1 соответственно [3, 26–28].

Для локализации детерминант катаболизма 2,4-Д и 2,4,5-Т в геномах штаммов R. planticola 33-4ch, R. planticola 36D и R. planticola 36Т применялся метод элиминации плазмид. В случае необратимой утраты исследуемых свойств считали, что детерминанты деградации расположены вне хромосомы.

Бесплазмидные клетки были получены при использовании концентрации бромистого этидия 200 мкг/мл, а сам факт элиминации подтверждался отсутствием плазмид в препаратах внехромосомной ДНК.

В ходе дальнейшей работы бесплазмидные варианты исследуемых штаммов проверялись на способность использовать 2,4-Д и 2,4,5-Т в качестве единственного источника углерода и энергии. При этом отдельные колонии высевались на агаризованную минимальную среду М9 с 2,4-Д/2,4,5-Т в качестве единственного источника углерода и энергии. Контролем в эксперименте служил рост исходных штаммов на тех же средах и их бесплазмидных вариантов на богатой среде (МПА) (табл. 1).

Таблица 1.  

Оценка способности штаммов R. planticola 33-4ch, R. planticola 36D и R. planticola 36Т к конверсии 2,4-Д и 2,4,5-Т после элиминации плазмид

Штамм Оценка роста штаммов на средах
МПА М9 с добавлением
2,4-Д 2,4,5-Т
33-4ch (pRP33-4ch–) + – –
33-4ch (pRP33-4ch+) контроль + + +
36D (pRP36D–) + – –
36D (pRP36D+) контроль + + +
36Т (pRP36Т–) + – –
36Т (pRP36Т+) контроль + + +

Бесплазмидные варианты штаммов R. planticola 33-4ch, R. planticola 36D и R. planticola 36Т не были способны использовать 2,4-Д и 2,4,5-Т в качестве единственного источника углерода и энергии. Следовательно, детерминанты катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот расположены на плазмидах pRP33-4ch, pRP36D и pRP36Т соответственно.

Известно, что у групп бактериальных деструкторов 2,4-Д и 2,4,5-Т стадии инициации катализируют α-кетоглутарат-зависимая диоксигеназа (TfdA) и 2,4,5-Т-оксигеназа (TftAB) соответственно. Однако ПЦР-анализ с использованием праймеров, разработанных на кодирующие их гены tfdA [17] и tftA [13] не выявил их наличия в геномной ДНК исследуемых штаммов, в то время как целевые ПЦР-продукты присутствовали в обоих положительных контролях.

Поиск промежуточных метаболитов в средах культивирования изучаемых штаммов в условиях использования 2,4-Д и 2,4,5-Т как единственных источников углерода и энергии показал присутствие хлорфеноксиуксусной, феноксиуксусной и 3-метил-2,6-диоксо-4-гексеновой (2-кето-3-метил-муконовый полуальдегид) кислот (табл. 2). Ранее для культуры R. planticola 33-4ch были установлены идентичные интермедиаты деградации 2,4,5-Т [20 ] . Следовательно, конверсия 2,4-Д и 2,4,5-Т у штаммов R. planticola 36D и R. planticola 36Т и R. planticola 33-4ch, вероятно, происходит одним общим путем через одинаковые промежуточные метаболиты (рис. 5а).

Таблица 2.  

Масс-спектрометрический анализ метаболитов конверсии 2,4-Д, и 2,4,5-Т у штаммов R. planticola 33-4ch, R. planticola 36D и R. planticola 36Т

Метаболит Основные пики в масс-спектре m/z, % 33-4ch 36D 36Т
2,4-Д 2,4,5-Т[20 ] 2,4-Д 2,4,5-Т 2,4-Д 2,4,5-Т
Метиловый эфир 4-хлорфеноксиуксусной кислоты М+ 200 (100), 202 (32), 143 (32), 141 (100), 141 (100), 113 (38), 111 (58) + + + + + +
Метиловый эфир феноксиуксусной кислоты М+ 166 (50), 107 (120), 77 (80) + + + + + +
Метиловый эфир 3-метил-2,6-диоксо-4-гексеновой кислоты М+ 156 (2), 126 (6), 111 (10), 97 (20), 95 (20),85 (21), 83 (21), 71 (16), 57 (100), 44 (50) + + + + + +
Рис. 5.

Схемы вероятного метаболизма: а – 2,4-Д и 2,4,5-Т у штаммов R. planticola 33-4ch, R. planticola 36D и R. planticola 36Т; б – 4-хлорфенола у культуры C. testosteroni JH5 [30]. Условные обозначения: I – 2,4,5-трихлорфеноксиуксусная кислота, II – 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота, III – 4-хлорфеноксиуксусная кислота, IV – феноксиуксусная кислота, V – фенол, VI – катехол, VII– 2-гидроксимуконовый полуальдегид VIII – 4-хлорфенол, IX – 4-хлоркатехол, X – 5-хлор-2-гидроксимуконовый полуальдегид, в скобках показаны предполагаемые метаболиты.

Обнаружение в среде культивирования исследуемых штаммов 4-хлорфеноксиуксусной и феноксиуксусной кислот показало, что на начальной стадии конверсии хлорфеноксиуксусных кислот происходило восстановительное дехлорирование субстрата, а не его гидроксилирование с отщеплением остатка уксусной кислоты и образованием соответствующего хлорфенола как при деградации субстратов штаммами C. necatorJMP134 и B. phenoliruptrix АС1100, рассмотренными выше (рис. 1).

Реакции восстановительного дехлорирования описаны в путях деградации хлорфеноксиуксусных кислот для двух штаммов: N. simplex 3E [23] и A. chroococcum [29], однако кодирующие их гены до сих пор не известны. Стоит отметить, что диссимиляция 2,4-Д у A. chroococcum MSB-1, также как у штаммов 33-4ch, 36D и 36Т, контролируется плазмидой pMSB1 [28].

По современным представлениям ключевой стадией конверсии хлорароматических соединений является раскрытие ароматического кольца. Эта реакция катализируется диоксигеназами, и может происходить между гидроксильными группами (орто-расщепление) или по соседству с одним из гидроксилов (мета-расщепление) [2, 7].

Обнаруженный метаболит конверсии хлорфеноксиуксусных кислот с открытой углеродной цепью (2-кето-3-метилмуконовый полуальдегид) является метилированным производным 2-гидроксимуконового полуальдегида. Последний представляет собой классический интермедиат мета-расщепления ароматического кольца катехола, в основном характерного для метаболизма метилированных ароматических соединений. Однако известны случаи, когда бактерии использовали мета-путь для конверсии хлорфенолов. Так, у штамма Comamonas testosteroni JH5 при минерализации 4-хлорфенола был идентифицирован 5-хлор-2-гидроксимуконовый полуальдегид – метаболит мета-расщепления хлорированного катехола (рис. 5б) [30].

Таким образом, штаммы R. planticola 33-4ch, R. planticola 36D и R. planticola 36Т, вероятно, осуществляют полное дехлорирование субстрата с последующим мета-расщепления его ароматического кольца (рис. 5а). Ранее подобный путь был описан для культуры Cellulosimicrobium sp. NPZ-121 [31].

Исследованные в данной работе штаммы рода Raoultella проявляют полисубстратную активностью в отношении сразу двух хлорфеноксиуксусных кислот. Не смотря на то, что 2,4,5-Т считается более сложным субстратом для бактерий и известно немного чистых культур природных штаммов, способных к полной его деградации, оказалось, что изучаемые культуры (особенно 36D) являются более эффективными деструкторами 2,4,5-Т, а не 2,4-Д. Поскольку часто встает проблема очистки экотопов от целого спектра загрязнителей хлорароматической природы, в том числе 2,4-Д и 2,4,5-Т, штаммы R. planticola 33-4ch, R. planticola 36D и R. planticola 36T особенно интересны как потенциально полисубстратные агенты ремедиации таких территорий.

Работа выполнена в рамках государственного задания Минобрнауки России № 075-00326-19-00 по теме № АААА-А18-118022190098-9 с использованием оборудования центра коллективного пользования УФИЦ РАН “Агидель”.

Список литературы

  1. Phale P.S., Shah B.A., Malhotra H. // Genes. 2019. V. 10. № 8. P. 569. https://doi.org/10.3390/genes10080569

  2. Arora P.K., Bae H. // Microb. Cell. Fact. 2014. V. 13. № 31. https://doi.org/10.1186/1475-2859-13-31

  3. Don R.H., Weightman A.J., Knackmuss H.J, Timmis K.N. // J. Bacteriol. 1985. V. 161. № 3. P. 85–90.

  4. Laemmli C., Werlen C., van der Meer JR. // Arch. Microbiol. 2004. V. 181. № 2. P. 112–121. https://doi.org/10.1007/s00203-003-0634-4

  5. Жарикова Н.В., Ясаков Т.Р., Журенко Е.Ю., Коробов В.В., Маркушева Т.В. // Успехи современной биологии. 2017. Т. 137. № 5. С. 514–528. https://doi.org/10.7868/S0042132417050076

  6. Kumar A., Trefault N., Olaniran A.O. // Critical Reviews in Microbiology. 2016. V. 42. № 2. P. 194–208. https://doi.org/10.3109/1040841X.2014.917068

  7. Enguita F.J., Leitão A.L. // Biomed Res. Int. 2013. V. 2013. https://doi.org/10.1155/2013/542168

  8. Danganan C.E., Ye R.W., Daubaras D.L., Xun L., Chakrabarty A.M. // Appl. Environ. Microbiol. 1994. V. 60. № 11. P. 4100–4106.

  9. Daubaras D.L., Saido K., Chakrabarty A.M. // Appl. Environ. Microbiol. 1996. V. 62. № 11. P. 4276–4279.

  10. Zaborina O., Daubaras D.L., Zago A., Xun L., Saido K., Klem T., Nikolic D., Chakrabarty A.M. // J. Bacteriol. 1998. V. 180. № 17. P. 4667–4675.

  11. Xun L., Wagnon K.B. // Appl. Environ. Microbiol. 1995. V. 61. № 9. P. 3499–3502.

  12. Rice J.F., Menn F.-M., Hay A.G., Sanseverino J., Sayler G.S. // Biodegradation. 2005. V. 16. P. 501–512. https://doi.org/10.1007/s10532-004-6186-8

  13. Huong N.L., Itoh K., Suyama K. // Microbes Environ. 2007. V. 22. № 3. P. 243–256. https://doi.org/10.1264/jsme2.22.243

  14. Zharikova N.V., Iasakov T.R., Bumazhkin B.K., Patutina E.O., Zhurenko E.I., Korobov V.V., Sagitova A.I., Kuznetsov B.B., Markusheva T. V. // Saudi J. Biol. Sci. 2018. V. 25. № 4. P. 660–671. https://doi.org/10.1016/j.sjbs.2016.02.014

  15. Коробов В.В., Журенко Е.Ю., Жарикова Н.В., Ясаков Т.Р., Маркушева Т.В. // Вестник Московского университета. 2017. Серия 16: Биология. Т. 72. № 4. С. 235–240. https://doi.org/10.3103/S0096392517040083

  16. Маркушева Т.В., Журенко Е.Ю., Галкин Е.Г., Коробов В.В., Жарикова Н.В., Гафиятова Л.Р. // Генетика. 2004. Т. 40. № 11. С. 1469–1476.

  17. Bælum J., Henriksen T., Christian H., Hansen B., Jacobsen C.S. // Appl. Environ. Microbiol. 2006. V. 72. № 2. P. 1476–1486. https://doi.org/10.1128/AEM.72.2.1476-1486.2006

  18. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. 480 с.

  19. Методы определения микроколичеств пестицидов. / Ред. М.А. Клисенко М.: Медицина, 1984. 256 с. 20.

  20. Жарикова Н.В., Маркушева Т.В., Галкин Е.Г., Коробов В.В., Журенко Е.Ю., Ситдикова Л.Р., Колганова Т.В., Кузнецов Б.Б., Турова Т.П. // Прикл. биохимия и микробиология. 2006. Т. 42. № 3. С. 292–297. https://doi.org/10.1134/S0003683806030069

  21. Жарикова Н.В., Ясаков Т.Р., Журенко Е.Ю., Коробов В.В., Маркушева Т.В. // Генетика. 2018. Т. 54. № 3. С. 292–305. https://doi.org/10.7868/S0016675818030025

  22. Kilbane J.J., Chatterjee D.K., Karns J.S., Kellogg S.T., Chakrabarty A.M. // Appl. Environ. Microbiol. 1982. V. 44. № 1. P. 72–78. https://doi.org/10.1128/AEM.44.1.72-78.1982

  23. Golovleva L.A., Pertsova R.N., Evtushenko L.I., Baskunov B.P. // Biodegradation. 1990. V. 1. № 4. P. 263–271.

  24. Boye K., Hansen D. // Int. J. Med. Microbiol. 2003. V. 292. № 7–8. P. 495–503. https://doi.org/10.1078/1438-4221-00228

  25. Drancourt M., Bollet C., Carta A., Rousselier P. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001. V. 51. № 3. P. 925–932. https://doi.org/10.1099/00207713-51-3-925

  26. Xia X.S., Smith A.R., BruceI. J. // FEMS Microbiol. Lett. 1996. V. 144. № 2–3. P. 203–206. https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.1996.tb08531.x

  27. Vedler E., Koiv V., Heinaru A. // Gene. 2000. V. 255. P. 281–288. https://doi.org/10.1016/s0378-1119(00)00329-2

  28. Balajee S., Mahadevan A. // FEMS Microbiol. Lett. 1989. V. 65. № 1–2. P. 223–228. https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.1989.tb03626.x

  29. Balajee S., Mahadevan A. // Xenobiotica. 1990. V. 20. № 6. P. 607–617. https://doi.org/10.3109/00498259009046876

  30. Hollender J., Hopp J., Dott W. // Appl. Environ. Microbiol. 1997. V. 63 № 11. P. 4567–4572. https://doi.org/10.1128/AEM.63.11.4567-4572.1997

  31. Коробов В.В., Журенко Е.Ю., Галкин Е.Г., Жарикова Н.В., Ясаков Т.Р., Стариков С.Н., Сагитова А.И., Маркушева Т.В. // Микробиология. 2018. Т. 87. № 1. С. 93–96. https://doi.org/10.7868/S002636561801010X

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Прикладная биохимия и микробиология

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал