Прикладная биохимия и микробиология, 2021, T. 57, № 1, стр. 77-86

МЕТОДИКА

Объект исследования, условия культивирования. Объектом исследования служили бактерии Azotobacter vinelandii (Lipman) Д-08, депонированные в ВКПМ как Azotobacter chroococcum B-5787. Для поддержания культуры A. vinelandii использовали агаризованную среду (г/л): КН₂РО₄ – 0.2; К₂НРО₄ – 0.8; MgSO₄ – 0.2; CaSO₄ – 0.1; FeCI₃ – следы; Na₂MoO₄ – следы; дрожжевой экстракт – 0.5; сахароза – 20.0; агар-агар – 15–20, рН 7.0–7.2. Бактерии выращивали при 28°С в течение 72 ч. Для выращивания инокулята бактерий A. vinelandii использовали жидкую питательную среду аналогичного состава. С поверхности агаризованной среды клетки смывали 10 мл питательной среды и засевали колбы на 250 мл со 100 мл среды с сахарозой. Инокулят выращивали в шейкерах Environmental shaker – Inkubator ES – 20/60 (Латвия) при 28°С и 250 об./мин 24 ч.

Для приготовления питательных сред использовали свеклосахарную мелассу с 48% сахарозы (Ромодановский сахарный завод, Россия). Для культивирования A. vinelandii с мелассой использовали контрольную среду с 4% сахарозы и среды с 5% мелассы (по сахарозе), в которые добавляли барду в количестве 2–15%._. Бактерии выращивали при тех же условиях, что и инокулят при рН 7.0–7.2.

После окончания выращивания клетки осаждали центрифугированием при 8000 g 30 мин, количество биомассы определяли взвешиванием после высушивания образца при 100°С.

Получение криогеля. Для получения криогеля 1 г сухого полисахарида и 4 г поливинилового спирта (ПВС) растворяли в 50 мл воды, выдерживали при –20°С 12 ч, оттаивали, выдерживая при 8°С. Для получения однородных гранул криогель измельчали методом экструзии через отверстия определенного диаметра (d = 2 мм). В качестве контроля использовали криогель, полученный без добавления левана [26].

Активность левансахаразы. Активность левансахаразы регистрировали по накоплению глюкозы, которую определяли с помощью глюкозооксидазно-пероксидазного метода. Реакционная смесь включала: 3 мл 50 мМ фосфатного буфера (рН 6.5) с сахарозой (100 г/л) и 1 мМ СаCl₂. К смеси добавляли 0.5 мл супернатанта и инкубировали при 30°С в течение 7 мин. За единицу активности принимали количество фермента, образующее 1 мкмоль глюкозы в минуту [27]. Белок определяли методом Бредфорда.

Определение содержания левана. Осаждение полисахарида проводили из супернатанта культуральной жидкости (КЖ) 96%-ным этанолом (в соотношении 1 : 2) и высушивали при 102 ± 1.5°С. Содержание полисахарида определяли весовым методом по разнице между весом осадков, образовавшихся при добавлении этанола к культуральной жидкости и к среде после стерилизации.

Жидкостная хроматография полисахаридов. Разделение водорастворимых соединений из КЖ (20 мкл) проводили на жидкостном хроматографе Shimadzu LC-20 A Prominence (Япония) с колонкой Ultrahydrogel 6 × 40 mm Guard Column WATO11565 (Япония). В качестве подвижной фазы использовали деионизированую воду, скорость подачи растворителей не превышала 0.4 мл/мин при 25°С, длина волны оптического детектора – 190 нм. В качестве стандартов использовали декстран с молекулярной массой 12, 25, 80 и 670 кДа.

Инфракрасная спектроскопия. ИК-спектры образцов регистрировали с помощью ИК-Фурье-спектрометра IRPrestige-21 (“Shimadzu”, Япония) в диапазоне от 4000 до 400 см^–1. Сухой полисахарид измельчали вместе с КВr (∼1 мг вещества + 250–300 мг КВr) и с помощью пресс-формы, получали таблетку для регистрации ИК-спектров.

Рентгенофлуоресцентный анализ (РФА). РФА полисахарида проводили для контроля элементного состава образца с помощью анализатора SciAps X_XRF (РФА) SciAps (США), оснащенного рентгеновской трубкой (напряжение 40 или 50 кэВ, ток до 200 мкА, Rh или Au-анод) и высокоскоростным кремниевым дрейфовым детектором площадью 20 мм²SDD, с разрешением 135 эВ на 5.95 Мп К-альфа линии, 250 тыс. импульсов в с. В основе принципа действия анализатора лежит метод энергетической дисперсии, который заключается в анализе смешанных спектров, полученных после возбуждения характеристического рентгеновского излучения, что позволяет оценить вклад (масса, %) различных элементов. Метод позволяет контролировать содержание анализируемых элементов: 100% ~ 0.001%, с относительной погрешностью 0.5–20% (от веса) и стабильностью ≤0.3%, время анализа 1 мин. Высушенные образцы полисахарида фиксировали в ячейке прибора в специальной подложке и проводили анализ.

Содержание ионов меди и кобальта. Содержание ионов определяли с помощью метода спектрофотометрического анализа в водном растворе [28], используя цветную реакцию с 4-(2-пиридилазо)резорцином (ПАР) при длине волны 530 нм. Адсорбент и раствор соли металла (1 : 20) инкубировали в течение: 5, 10, 30 мин, 1, 2, 3 ч, 1 и 4 сут, затем удаляли адсорбент и к раствору соли металла (0.375 мл для соли кобальта, 0.875 мл для соли меди) добавляли 2 мл ПАР, доводя объем до 20 мл водой. Оптическую плотность растворов регистрировали в 1 см кювете относительно воды.

Сорбцию радиоактивных образцов на адсорбенте. Сорбцию на сорбенте оценивали с помощью радионуклидов ²³³U, ²³⁹Pu. Эксперименты проводили при соотношении сорбент : раствор 1 : 50. Перед экспериментом в раствор вносили индикаторные количества - радионуклиды (моль/л): ²³³U – 4.5 × 10^–10, ²³⁹Pu – 8.7 × 10^–8, чтобы исходная концентрация активного нуклида в растворе составляла до 200 Бк/мл.

Радиоактивность. Радиоактивность регистрировали методом жидкостно-сцинтилляционного счета с помощью низкофонового альфа-бета-спектрометра Tri-Carb 3180TR/SL (“Perkin Elmer”, США) с использованием сцинтиллятора Perkin Elmer OptiphaseHisafe3 (соотношение сцинтиллятор : аликвота – 10 : 1). Степень сорбции (S, %) рассчитывали как долю радионуклида, перешедшего из воды на/в сорбент по формуле: $S = \frac{{{{C}_{0}} - C}}{{{{C}_{0}}}} \times 100\% $, где C₀ и C – соответственно начальная и конечная концентрация радионуклида в растворе, Бк/мл.

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием программы Microsoft Excell 2015.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В работе исследовали условия синтеза и молекулярные характеристики левана, выделяемого при культивировании A. vinelandii на средах с мелассой и бардой. Установлено, что среда культивирования (СК) с добавлением 5% мелассы (по сахарозе) и среды с 5% мелассы и добавлением 2–15% барды (комплексная среда) обеспечивали оптимальные условия для эффективного синтеза левансахаразы и левана.

Содержание биомассы при культивировании в присутствии мелассы достигало максимума на 2 сут, добавление барды к среде не оказывало существенного влияния на рост биомассы и только на 3 сут превышало контроль в СК с 5% барды (рис. 1). Максимальное содержание внеклеточного белка в КЖ было выявлено на 4 сут роста в среде с 10% барды (0.197 мг/мл).

Рис. 1.

Динамика роста A. vinelandii на средах с мелассой и различным содержанием барды: 1 – среда с мелассой; 2 – добавление барды, 2%; 3 – добавление барды, 5%; 4 – добавление барды, 10%; 5 – добавление барды, 15%.

При культивировании A. vinelandii левансахаразная активность была максимальной на 2 сут: на среде с мелассой (6.12 ед./мл) и на той же среде с добавлением барды 5 и 10% − 5.4 и 5.25 ед./мл соответственно. Максимальная активность левансахаразы соответствовала и максимальному выходу левана (рис. 2а). Для биотехнологического производства важно контролировать изменение удельной активности левансахаразы, поскольку оно может отражать также и содержание левана в КЖ (табл. 1). Максимальное количество полисахарида накапливалось в 1 сут, максимальная удельная активность левансахаразы зафиксирована на среде с мелассой, что коррелирует с максимальным выходом экзополисахарида (ЭПС).

Рис. 2.

Изменение активности левансахаразы (а, ед. /мл) и накопления левана (б, г /л) при культивировании A. vinelandii на средах с мелассой и бардой. 1 – среда с мелассой; 2 – добавление барды 5%; 3 – добавление барды 10%; 4 – среда с сахарозой.

При культивировании бактерий на среде с мелассой уже на 1 сут содержание левана составляло 22.2 г/л, на вторые сутки достигло максимума 25.6 г/л (рис. 2б), добавление в СК барды (комплексная среда) не способствовало увеличению синтеза левана: на 2 сут выход составил 24.8 г/л при добавлении 5% барды и при 10% барды – 21.1 г/л.

Для понимания механизма сорбции катионов леваном был исследован состав и структура полисахарида. Известно, что молекулярная масса левана зависит от штамма бактерии и может меняться от 5 до 3500 кДа [27]. Молекулярную массу синтезированных полисахаридов исследовали методом ВЭЖХ. При культивировании бактерии на среде с сахарозой было обнаружено три фракции левана с молекулярной массой 600–700, 190–210 кДа и с массой менее 25 кДа (рис. 3а). При культивировании бактерии на среде с мелассой была обнаружена дополнительная фракция левана с молекулярной массой более 1000 кДа (рис. 3б).

Рис. 3.

Распределение по молекулярной массе левана, полученного при культивировании A. vinelandii на среде с сахарозой (а) и мелассой (б). (Красная линия – базовая).

Для изучения возможности сорбции ионов важно знать особенности молекулярной структуры левана, синтезированного на среде с мелассой. С помощью ИК спектроскопии установлено, что в ИК-спектре левана наблюдались полосы, характерные для валентных колебаний гидроксильных групп (область 3700–3100 см^–1), валентных колебаний С–Н-связей метиленовых групп (3000–2800 см^–1) и их асимметричных валентных колебаний (около 2945 см^–1).

В ИК-спектрах область 1500–900 см^–1 характеризует различные колебания: С–Н-, С–О- и О‒Н-гликозидной связи и глюкофуранозного кольца левана: полосы 1450 и 1430 см^–1 обусловлены деформационными плоскостными колебаниями ОН-группы, а также принадлежат колебаниям метиленовой группы (около 1429 см^–1); 900 см^–1 − асимметричным колебаниям кольца в противофазе и колебаниям атома С₁ и 4 окружающим его атомам в β-гликозидных структурах. Полоса около 800 см^–1 обусловлена СН и СН₂‑маятниковыми колебаниями фруктофуранозного кольца молекулы (рис. 4) [20]. Сопоставление ИК-спектра левана данного штамма и данных ИК-спектроскопии леванов Zymomonas mobilis, Bacillus subtilis, видов Halomonas [20, 29, 30] позволяет сделать вывод о том, что образец, полученный на средах с мелассой, идентичен левану других продуцентов.

Рис. 4.

ИК-спектры левана, синтезированного на среде с сахарозой (а), мелассой (б) и с мелассой + 10% барды (в).

В молекуле левана, синтезированного A. vinelandii среде с мелассой, были выявлены изменения как гидратированности молекулы полимера, так и колебаний двойных связей молекулы (область 1800–1500 см^–1, рис. 4). Известно, что полоса с максимумом около 1640 см^–1 обусловлена деформационными колебаниями ОН-групп воды и при увеличении гидратированности левана полоса смещается в область больших волновых чисел (рис. 4а). Таким образом, молекула левана, синтезированного бактериями на СК с мелассой и бардой, менее гидратирована по сравнению с леваном, синтезированном на среде с сахарозой.

В следующей серии экспериментов, с помощью РФА исследовали изменения элементного состава левана, полученного при культивировании A. vinelandii на разных средах (табл. 2). Установлено, что содержание углерода и кислорода в образцах, полученных при культивировании на СК с мелассой и с мелассой и бардой не менялось (30.2–34.1% и 60.2–63.5% соответственно). В то же время при культивировании бактерии на СК с мелассой в молекуле леване снижалось содержание Na, Al, S, Si, P, Mn, Fe, по сравнению с леваном, полученным на среде с сахарозой, но при этом увеличивается содержание Mg, Cl, K, Ca. При культивировании бактерий на комплексной среде (меласса + 5% барды) уменьшалось содержание Na, Al, Si, P, Ca, Mn, Fe, но увеличивается содержание Mg, S, Cl, K, по сравнению с леваном, синтезированном на среде с сахарозой. При культивировании бактерий на комплексной среде (меласса + 10% барды) уменьшалось содержание Al, Si, P, Cl, но увеличивалось Na, Mg, S, K, Ca, Mn, Fe (по сравнению с леваном на среде с сахарозой. Полученные данные свидетельствуют о различном элементном составе левана, полученного при культивировании бактерий на различных сложных средах. Культивирование бактерий на комбинированной среде (особенно меласса + + 10% барды) способствовало синтезу левана с большим молекулярным весом (более 1000 кДа) и измененной молекулярной структурой: снижение вклада колебаний двойных связей и меньшая гидратированность молекулы. Вероятно, причиной этого могло быть увеличение связывания молекулой левана ионов Na, Mg, S, K, Ca, Mn, Fe из среды.

Рис. 5.

РФА-спектры левана, синтезированного на среде с сахарозой (а), мелассой (б) и среде с мелассой и 10% барды (в).

В дальнейшем исследовали сорбционные свойства криогеля с бактериальным леваном, полученным при культивировании на различных средах с вторичными продуктами производства. Известно, что гидрогели во многом аналогичны полимерным материалам и в отличие от смол с жесткой структурой характеризуются гибкой структурой и могут пропускать гораздо больше воды. Наличие специфических функциональных групп (например, OH) в гидрогелях позволяет эффективно адсорбировать частицы на наружной поверхности, а также на внутренней поверхности их трехмерной сети [31]. Для исследования процесса адсорбции ионов Cu²⁺, Со²⁺, Cd²⁺ и Zn²⁺ к растворам солей добавляли измельченный криогель, приготовленный на основе ПВС (контроль) и ПВС с леваном (опыт). В ходе исследования показано, что все образцы были способны в разной степени к сорбции исследуемых ионов. Сорбция ионов меди в контроле достигала 47.3% в течение 3 ч, а при использовании ПВС с нативным леваном уже 57% в течение 2 ч (табл. 3). В экспериментах с кобальтом максимальное значение сорбции в контроле наблюдали через 30 мин – 45.4%, образец с леваном максимально связывал катион через 1 ч – 46.7%. Максимальная сорбция ионов цинка приходилась на 24 ч и составляла 48.2%, в контроле значение было ниже – 33.4% на 18 ч. Эффективная сорбция ионов кадмия наблюдалась уже через 10 мин – 79.2% (табл. 4). В контроле процесс шел медленнее, и эффективность очистки от кадмия была меньше и составляла 60.8%.

Таким образом, из полученных результатов видно, что сорбция ионов меди, цинка и кадмия криогелем с леваном происходила эффективнее, чем с ПВС. Сорбция ионов меди, кобальта, цинка и кадмия достигала максимума в определенный момент времени, а после достижения равновесия процесс постепенно выходил на равновесное плато. Сорбция разных ионов криогелем с леваном имела различную динамику и амплитуду: максимальный эффект обнаружен при сорбции Cd²⁺ в течение 10 мин.

Установлено, что криогели с леваном способны сорбировать радиоактивный плутоний и уран: сорбция урана достигала 55% после двух нед. эксперимента и не достигла равновесия. Такую динамику сорбции, предположительно, можно объяснить большим радиусом гидратированного радионуклида и стерическими трудностями его абсорбции, а также отрицательным зарядом иона. Сорбция плутония происходила быстрее и достигала равновесия уже через 4 ч (40.9%).

Максимальная удельная активность левансахаразы наблюдалась при культивировании бактерии на среде с мелассой, что коррелировало и с максимальным синтезом левана. В этих условиях бактерии синтезировали высокомолекулярный леван (более 1000 кДа) с измененной молекулярной структурой (снижение вклада колебаний двойных связей и меньшая гидратированность молекулы). Все это, вероятно, обусловило увеличение связывания молекулой левана ионов Na, Mg, S, K, Ca, Mn, Fe из среды культивирования. На основе поливинилового спирта и левана были получены криогели, способные эффективно сорбировать ионы меди (максимально за 1 ч), цинка (за 24 ч) и кадмия (за 10 мин), а также радиоактивные плутоний (максимально за 4 ч) и уран (максимально за 168 ч). Все это свидетельствует о возможности использования криогелей ПВС с леваном в качестве компонентов сорбентов при в очистке стоков различных предприятий от тяжелых металлов и радионуклидов. Дальнейшее обращение с сорбентами подразумевает их регенерацию с предварительной десорбцией металлов 1 н раствором соляной кислоты, поскольку известно, что леван обладает устойчивостью к нагреванию, кислотным и щелочным средам, высокой водоудерживающей способностью [21, 32]. В таком режиме возможно многократное использование биосорбентов. Окончательный этап утилизации может быть осуществлен сжиганием, что приводит к 95% сокращению объемов сорбента в виде зольного остатка.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 18-29-05054).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.