Прикладная биохимия и микробиология, 2021, T. 57, № 1, стр. 46-53

МЕТОДИКА

Получение препарата внеклеточных протеиназ S. strictum. Для получения препарата протеиназ продуцент культивировали в глубинных условиях в два этапа. На первом этапе культуру микромицета, выращенную на скошенной среде Чапека, переносили в посевную среду и выращивали посевной мицелий (48–72 ч). На втором этапе часть биомассы (10% по объему) переносили в ферментационную среду, выращивание проводили 96–120 ч при температуре 28°C на качалке при 220 об/мин. Среда для биосинтеза ферментов имела следующий состав (в г/л): сахароза – 40.0, К₂НРО₄ – 4.4, NaNO₃ – 19.0 и KNO₃ – 2.5, рН 6.5. Среда для посевного мицелия имела тот же состав но концентрация их была уменьшена в 2 раза.

По окончании культивирования культуральную жидкость (КЖ) микромицета отделяли от мицелия центрифугированием при 15 000 g в течение 15 мин при 4°С. Белки из КЖ осаждали двукратным объемом ацетона, охлажденным до –20°С, выдерживали в течение 1 ч при 4°С для формирования осадка, а затем фильтровали. Отфильтрованный осадок высушивали над хлористым кальцием в вакуумном эксикаторе в течение 3 сут.

Выделение внеклеточных протеиназ S. strictum. Для разделения белков, осажденных из КЖ, использовали препаративное изоэлектрофокусирование (ИЭФ) по методу Вестерберга [23]. ИЭФ проводили в колонке объемом 110 мл (“Pharmacia”, Швеция) при напряжении 800 В течение 36 ч при 4°С в широком градиенте рН амфолинов (рН 3.0–10.0) и градиенте сахарозы 0–40%. После проведения ИЭФ собирали на холоде фракции объемом 1.5–2 мл, в которых измеряли рН, содержание белка и активность протеиназ.

Электрофорез в ПААГ и определение белков. Гомогенность белков во фракциях после ИЭФ определяли с помощью электрофореза по Лэммли в 15%-ном ПААГ, в присутствии ДДС-Na [24]. Для окраски гелей использовали 0.08%-ный раствор Кумасси бриллиантового голубого G-250 в 3.5%-ной хлорной кислоте [25]. Для определения молекулярной массы протеиназ использовали набор метчиков Unstained Protein Molecular Weight Marker (“Thermoscientific”, США).

Количественное содержание белка в пробах определяли спектрофотометрически при 280 нм в кювете с длиной пути в 1 см [26]. Для расчета концентрации строили калибровочную кривую по БСА.

Определение фибринолитической (плазминоподобной) и активирующей плазминоген активности методом фибриновых пластин. Фибринолитическую и активирующую плазминоген активность определяли на фибриновых пластинках по модифицированному методу Аструпа–Мюллерца–Лассена [4]. Для приготовления фибриновых пластин смешивали 900 мкл 3%-ного раствора бычьего фибриногена и 200 мкл раствора тромбина (2 мг/мл) в физиологическом растворе. Смесь аккуратно перемешивали и переносили в чашки Петри (d = 9 см). Образование и уплотнение фибринового геля происходило в течение 1 ч при комнатной температуре. После этого часть чашек Петри прогревали в течение 30 мин при 86°С, при этом инактивировали плазминоген. Для измерения фибринолитической и активирующей плазминоген активности на пластины наносили по 30 мкл пробы и инкубировали в течение 4 ч в термостате. Затем на пластинах измеряли площадь зоны лизиса. Разность в размерах зон на непрогретых и прогретых чашках служила показателем способности фермента активировать плазминоген. Данные выражали в усл. ед./мл. За 1 усл. ед. принимали количество фермента, образующего зону гидролиза фибриновой пластины, равную 1 мм².

Определение протеолитической активности при гидролизе белков-субстратов. В полученном препарате внеклеточных протеиназ и фракциях после ИЭФ проводили реакции казеинолиза, фибринолиза и фибриногенолиза с 1%-ными суспензиями соответствующих белков в 0.05 М трис-HCl буфере, рН 8.2.

Для проведения реакций к 200 мкл фильтрата культуральной жидкости добавляли 400 мкл 1%‑ной суспензии фибрина в 0.05 М трис-HCl буфере, рН 8.2, и инкубировали при постоянном перемешивании в течение 10–30 мин при 37°С [11, 27]. Активность выражали в мкмолях тирозина, образовавшегося в течение 1 мин в 1 мл культуральной жидкости (Е_Тир).

Определение протеолитической активности с использованием хромогенных пептидных субстратов. Для определения амидолитической активности выделенных протеиназ проводили инкубацию с 0.05%-ными растворами хромогенных пептидных субстратов (“Chromogenix”, Италия) – п-нитроанилидов, расщепляемых протеиназами системы гемостаза: тромбином – Tos-Gly-Pro-Arg-pNA, плазмином – H-D-Val-Leu-Lys-pNA (S-2251), фактором Xa – Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA (S-2765), урокиназой – pGlu-Gly-Arg-pNA (S-2444) и тканевым активатором плазминогена – H-D-Ile-Pro-Arg-pNA (S-2288).

Реакцию проводили в 200 мкл пробы при постоянном перемешивании в течение 5 мин при 37°С, как описано ранее [28]. Оптическую плотность измеряли при 405 нм на спектрофотометре Hitachi 200-20 (“Hitachi”, Япония). За 1 единицу активности (Е_pNA) принимали количество мкмоль п-нитроанилина, образовавшегося в результате гидролиза за 1 мин.

Ингибиторный анализ. В качестве ингибиторов для металлопротеиназ использовали этилендиаминтетраацетат (ЭДТА, 1.1 мг/мл) и о-фенантролин (0.5 мг/мл), цистеиновых протеиназ – п-хлормеркурийбензоат (п-ХМБ, 0.5 мг/мл) и сериновых протеиназ – фенилметилсульфонил фторид (ФМСФ, 0.3 мг/мл), а также ингибиторы химотрипсиноподобных протеиназ – тозилфенилаланилхлорметилкетон (ТФХК, 0.4 мг/мл) и трипсиноподобных протеиназ – тозиллизилаланилхлорметилкетон (ТЛХК, 0.4 мг/мл) и соевый ингибитор трипсина (1.1 мг/мл). При изучении действия ингибиторов молярное соотношение фермент-ингибитор составляло 1 : 10 и 1 : 100 [29]. Начальную и остаточную протеолитическую активность фермента определяли при 37°С после его преинкубации с ингибитором в течение 120 мин при 25°С, как описано выше, и выражали в процентах от контроля (без ингибитора).

Определение рН-оптимума, рН-стабильности, термостабильности и температурного оптимума ферментов. Для изучения рН-стабильности и оптимума рН для действия ферментов использовали 0.4 М натрий-ацетат-фосфат-боратный буфер со значениями рН 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0 и 11.0.

Для определения рН-стабильности 100 мкл пробы и 150 мкл буфера инкубировали в течение 3 ч при 25°С. Затем добавляли 100 мкл раствора хромогенного субстрата урокиназы в 0.05 М трис-HCl-буфере, рН 8.2, и инкубировали еще в течение 5 мин при 37°С. Для определения рН-оптимума 100 мкл пробы ферментов, 150 мкл буфера и 100 мкл раствора хромогенного субстрата урокиназы инкубировали в течение 5 мин при 37°С.

Для измерения термостабильности фермента 50 мкл пробы и 200 мкл 0.05 М трис-HCl-буфера, рН 8.2, инкубировали в течение 3 ч при 25, 30, 37, 45, 55 и 65°С, а затем добавляли 100 мкл раствора хромогенного субстрата урокиназы и инкубировали в течение 5 мин при 37°С. Для измерения температурного оптимума действия фермента 50 мкл пробы, 200 мкл буфера и 100 мкл раствора хромогенного субстрата урокиназы инкубировали в течение 5 мин при соответствующей температуре.

Реакцию останавливали 200 мкл 50%-ной уксусной кислоты, и измеряли поглощение при 405 нм.

Определение углеводного компонента протеиназ. Присутствие в составе выделенных протеаз углеводного компонента выявляли методом дот-блоттинга, инкубируя нанесенные на нитроцеллюлозные мембраны пробы в растворах периодной кислоты и реактива Шиффа (фуксинсернистой кислоты), как описано ранее [30]. В качестве положительного контроля использовали раствор 0.5 мг/мл внеклеточной дрожжевой инвертазы, а в качестве отрицательного – раствор 0.5 мг/мл БСА.

Тромболизис. Для приготовления тромбов во взвешенных пробирках-эппендорфах смешивали 200 мкл плазмы и 20 мкл 0.1%-ного раствора тромбина в 0.1 М трис-HCl-буфере, рН 7.0, и оставляли на 30 мин при 37°С, после чего повторно взвешивали со стабилизированным тромбом. Затем добавляли 250 мкл пробы и инкубировали при перемешивании (250 об./мин) в течение 30, 60 и 90 мин при 37°С. При этом наблюдалось частичное разжижение тромба и отделение его от стенок пробирки. Лизат аккуратно убирали при помощи фильтровальной бумаги и взвешивали остаток вместе с пробиркой. После чего рассчитывали количество, в %, не прогидролизованного тромба [5].

Ферментативные реакции, требующие постоянного перемешивания, проводили в термошейкере TS-100 (“BioSan”, Латвия). Для измерения оптической плотности использовали спектрофотометр BioSpectrometer® kinetic (“Eppendorf”, Германия).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Микромицет вида S. strictum (W. Gams) Summerbell был выделен из полифилетичного рода Acremonium в 2011 г. Он принадлежит к анаморфам грибов аскомицетного аффинитета рода Sarocladium, семейства Sarocladiaceae, порядка Hypocreales, класса Sordariomycetes, отдела Ascomycota. Эти грибы занимают различные экологические ниши и выделяются из почвы и растительных остатков. Среди них встречаются фитопатогенные и ассоциированные с другими грибами формы. Штамм S. strictum 203 был выделен из культуры A. longa Mecht. 1 как микофил – перспективный продуцент фибринолитических протеиназ [20].

Изучение в культуральной жидкости S. strictum 203 активности внеклеточных протеиназ по отношению к белковым компонентам тромба и хромогенным пептидным субстратам подтвердило сделанное ранее предположение об их возможности осуществлять реакцию активации плазминогена. Как видно из табл. 1, протеиназы микромицета были способны расщеплять субстраты плазмина, тромбина и фактора Ха, а также проявляли активность активаторов плазминогена: тканевого (по субстрату D-Ile-Pro-Arg-pNA) и урокиназы (по субстрату pGlu-Gly-Arg-pNА). Важно отметить, что в среднем значение активности урокиназы в 1.7 раз превышало значение активности по отношению к другим исследованным субстратам. Можно предположить, что активация плазминогена протеазами S. strictum 203, выявленная ранее, происходила по урокиназному типу. В связи с этим субстрат урокиназы был использован в дальнейшем для определения специфической активности протеиназ продуцента.

Для изучения протеолитического комплекса S. strictum 203 был получен препарат его внеклеточных протеиназ осаждением сульфатом аммония из КЖ гриба. Препарат представлял собой гомогенный порошок желтовато-белого цвета без запаха, хорошо растворимый в воде.

Проведение ИЭФ препарата позволило обнаружить в составе протеолитического комплекса продуцента как минимум 3 протеиназы (обозначенные как протеиназы I, II и III) с pI 4.5, 7.2 и 11.8 (рис. 1). При использовании для определения протеолитической активности во фракциях, полученных после ИЭФ, двух субстратов – казеина и хромогенного пептидного субстрата урокиназы, были отмечены различия в степени их гидролиза различными протеиназами. Так, в отличие от протеиназы III, протеиназы I и II обладали низкой казеинолитической активностью и проявляли большую урокиназную активность (рис. 1). Все выделенные ферменты при проведении электрофореза в ПААГ оказались гомогенными белками с молекулярной массой около 35 кДа (рис. 2), что могло свидетельствовать о том, что они являлись изоферментами. Подобная характеристика была также показана для протеиназ, образующих протеолитические комплексы у других микромицетов [12, 32].

Рис. 1.

Изоэлектрофокусирование препарата протеиназ S. strictum 203; 1 – A₂₈₀, 2 – активность урокиназы, 3 – рН, 4 – казеинолитическая активность.

Рис. 2.

Электрофорез в ПААГ в присутствии ДДС–Na протеиназ S. strictum 203 : 1 – белки-маркеры молекулярной массы (сверху вниз : β-галактозидаза, БСА, овальбумин, лактатдегидрогеназа, эндонуклеаза рестрикции Bsp981, бета-лактоглобулин, лизоцим), 2 – протеиназа I, 3 – протеиназа II, 4 – протеиназа III.

Изучение субстратной специфичности выделенных протеиназ показало, что их активность по отношению к исследуемым субстратам тканевого активатора плазминогена и плазмина различалась. Так, протеиназа I не действовала на эти субстраты, протеиназа II не обладала активностью по отношению к субстрату тканевого активатора плазминогена и слабо гидролизовала субстрат плазмина, а протеиназа III расщепляла оба субстрата (рис. 3). При этом две протеиназы проявляли выраженную урокиназную активность. Наибольшей активностью по отношению к субстрату урокиназы обладала протеиназа II (170.0 Е_pNA/мг × × 10^–3). Протеиназа I обладала более узкой субстратной специфичностью с выраженной урокиназной активностью, а протеиназа III проявляла широкую субстратную специфичность. Можно предположить, что урокиназная активность и обусловливала активирующее плазминоген действие.

Рис. 3.

Амидолитическая активность протеиназ S. strictum 203 (I, II и III) по отношению к хромогенным пептидным субстратам плазмина (1), тканевого активатора плазминогена (2) и урокиназы (3).

Методом фибриновых пластин были обнаружены фибринолитическая и активирующая плазминоген активность исследуемых протеиназ (табл. 2). Первые две протеиназы характеризовались высокой фибринолитической (193.6 и 169.8 усл. ед./мг соответственно) и активирующей плазминоген активностью (443.7 и 414.2 усл. ед./мг соответственно). Протеиназа III оказалась более активной (в 3.4 и 1.6 раз соответственно) и гидролизовала субстрат с одинаковой активностью, не проявляя выраженного активирующего плазминоген действия.

Фибринолитическая и фибриногенолитическая активность у протеиназ I и II была выражена слабо (табл. 2). Протеиназа III проявляла как фибрино- так и фибриногенолитическую активность (191.6 и 217.7 Е_Тир/мг).

Для установления класса изучаемых протеиназ был проведен ингибиторный анализ (табл. 3). Наиболее эффективно ингибировал протеиназы I и II соевый ингибитор трипсина в соотношениях фермент : ингибитор, равных 1 : 10 и 1 : 100. Небольшое ингибирующее действие на протеиназу I оказывали ТФХК (ингибитор химотрипсиновых протеиназ) и ФМСФ (ингибитор сериновых протеиназ), а протеиназа II только частично ингибировалась ФМСФ. Протеиназа III ингибировалась соевым ингибитором трипсина и ФМСФ в соотношениях 1 : 10 и 1 : 100. Протеиназы также незначительно ингибировались п-ХМБ, взаимодействующим с тиоловыми группами (табл. 3). Таким образом, можно предположить, что протеиназы S. strictum 203 являются трипсиноподобными тиолзависимыми протеиназами серинового типа.

Изучение рН стабильности протеиназ, входящих в состав комплексного препарата, полученного из КЖ микромицета S. strictum 203, показало, что активность протеиназы I наиболее эффективно проявлялась в области щелочных рН (рис. 4), в то время как протеиназы II и III сохраняли высокую активность при нейтральном рН. Активность всех трех протеиназ подавлялась при низких (до 5.0) и высоких (с 11.0) рН. Оптимум рН для протеиназы I находился ~10.0, протеиназа II проявляла одинаково высокую активность в диапазоне рН от 5 до 8, оптимум рН для протеиназы III находился ~8 (рис. 3). Из полученных результатов следовало, что оптимальный рН для действия препарата ферментов нейтральный и слабо щелочной. Такие условия проявления активности ферментов совпадали со значением рН крови человека и предполагают возможность использования в дальнейшем препарата в клинике в качестве тромболитика.

Рис. 4.

Влияние рН на активность (а) и стабильность (б) протеиназы I (1), II (2) и III (3) S. strictum 203.

В результате изучения термостабильности протеиназ микромицета было показано, что протеиназа I проявляла высокую урокиназную активность и была стабильна в течение 3 ч инкубации при 30 и 37°С (рис. 5). Протеиназы II и III проявляли высокую активность после инкубации при 30°С, а после 3 ч инкубации при 55°С все протеиназы инактивировались. Температурный оптимум действия протеиназ I и II составлял 55°С (рис. 4). Протеиназа III была одинаково активна в диапазоне 37–55°С.

Рис. 5.

Влияние температуры на активность (а) и стабильность (б) протеиназы I (1), II (2) и III (3) S. strictum 203.

Определение методом дот-блоттинга содержания гликопротеинов реактивом Шиффа в протеиназах, синтезируемых S. strictum 203, показало, что они различались по уровню гликозилирования. На рис. 6 видно, что наиболее гликозилированной оказалась протеиназа I, чуть меньше – протеиназа II. В составе протеиназы III гликозидные компоненты не были обнаружены.

Рис. 6.

Определение углеводного компонента в молекулах протеиназ I (1), II (2) и III (3), синтезируемых S. strictum 203, а также инвертазы дрожжей (“+”, положительный контроль) и БСА (“–”, отрицательный контроль).

Для изучения способности протеиназ продуцента к тромболизису был изучен гидролиз свежеобразованных тромбов плазмы крови in vitro. Как видно на рис. 7, протеиназа III вносила наибольший вклад в тромболитический потенциал препарата. Так, масса нелизированного тромба после инкубации с ним в течение 90 мин составила 42.9%. Протеиназы I и II вносили меньший вклад в тромболизис, а масса нелизированного тромба при их использовании в течение того же времени составила 58.0 и 63.2% соответственно.

Рис. 7.

Лизис тромба (остаточная масса, %) протеиназами I (1), II (2) и III (3), синтезируемыми S. strictum 203.

Таким образом, установлено, что комплекс внеклеточных протеолитических ферментов S. strictum 203, обладающий тромболитической активностью, представлен тремя щелочными трипсиноподобными тиолзависимыми протеиназами серинового типа с разными изоэлектрическими точками, но близкими значениями молекулярных масс (около 35 кДа). Одна из протеиназ (протеиназа III) оказалась негликозилировановым белком, остальные были гликопротеинами. Спектр протеолитической активности по отношению к белкам – компонентам тромба также оказался различен. Так, протеиназа I обладала более узкой субстратной специфичностью с выраженной урокиназной активностью и невысокой фибрино- и фибриногенолитической активностью, а протеиназа III проявляла широкую субстратную специфичность. Предположено, что урокиназная активность протеаз обусловливала активирующее плазминоген действие. Комплекс ферментов может найти применение в медицинской практике в качестве тромболитического агента.