Прикладная биохимия и микробиология, 2021, T. 57, № 1, стр. 54-58

МЕТОДИКА

Объектом исследования служили 10-суточные проростки кукурузы (Zea mays L., сорт Воронежская 76), выращенные гидропонным способом при 25°С. Для выделения мезофильной ткани листья кукурузы (2 г) гомогенизировали в 10 мл 0.1 М трис-HCl буфера, pH 6.5, содержащего 0.01 М MnCl₂, 0.04 М ДТТ и 0.04 М ЭДТА. Гомогенат фильтровали через 4 слоя марли и центрифугировали при 3000 g в течение 5 мин. Полученный супернатант представлял собой мезофилл [7].

Активность МЭ в прямой и обратной реакции определяли спектрофотометрически на СФ-2000 (“Ломо”, Россия) по изменению оптической плотности реакционной смеси при 340 нм, свидетельствующей о скорости образования или расходования НАДФН [8, 9]. Определение скорости восстановления пирувата осуществляли в среде, содержащей 100 мМ трис-HCl буфер, рН 6.5, 1.5 мМ пируват и 0.15 мМ НАДФН. Измерение активности фермента в прямой реакции проводили в реакционной среде следующего состава: 100 мМ трис-HCl буфер, рН 6.5, 4 мМ малат и 1 мМ НАДФ⁺. В качестве кофермента использовали 5 мМ MnCl₂. За единицу ферментативной активности НАДФ⁺-МЭ принимали количество фермента, которое превращало (для обратной реакции) или образовывало (для прямой реакции) 1 мкМ НАДФН за 1 мин при 25°С.

Влияние оксиредуцирующих дегидрогеназ уменьшали понижением pH cреды выделения и определения активности фермента (pH 6.5) и использования MnCl₂.

Очистка изоформ фермента на первом этапе включала осаждение белковой фракции супернатанта (мезофилла) сульфатом аммония от 35 до 85% насыщения. Полученный осадок растворяли в 100 мМ трис-HCl буфера, рН 6.5, и для освобождения от низкомолекулярных примесей наносили на колонку (1.5 × 20 см) с сефадексом G-25 (“Pharmacia”, Швеция), уравновешенную тем же буфером. Собранные фракции (1.5 мл), содержащие фермент, наносили на колонку (1.5 × 12 см) с ДЭАЭ-Sephacel (“GE Healthcare”, Швеция), уравновешенную 100 мМ трис-HCl буфером, рН 6.5. Элюцию связавшихся с сорбентом белков проводили линейным градиентом NaCl от 50 до 150 мМ в том же буфере [10, 11].

Электрофорез в 7%-ном полиакриламидном геле (ПААГ) проводили по методу, описанному в работах [12, 13]. На дорожку наносили не более 120 мкг белка.

Специфическое проявление активности малатдегидрогеназы на геле осуществляли тетразолиевым методом [14, 15]. Гели инкубировали в 15 мл 0.1 М трис-НСl-буфера, рН 6.5, содержащем 0.2 мл 2 М малата натрия, 18 мг НАДФ⁺, 10 мг нитросинего тетразолия, предварительно растворенного в 0.5 мл этиленгликоля, и 0.6 мг феназинметасульфата (ФМС). Локализацию фермента устанавливали по накоплению диформазана.

Гели, на которые наносили 5–7 мкг белка, были также окрашены нитратом серебра [16–18].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При проведении электрофореза в ПААГ в мезофилле листьев кукурузы была обнаружена только одна изоформа НАДФ⁺-МЭ с относительной электрофоретической подвижностью 0.1 (рис. 1). Активность данного фермента определялась в цитоплазматической фракции мезофилла листьев кукурузы и составляла 98–99% от его общей активности в клетке. Это указывало на субклеточную локализацию НАДФ⁺-МЭ в цитоплазме.

Рис. 1.

Электрофорез в ПААГ НАДФ⁺‑МЭ из гомогената мезофилла листьев кукурузы (1), очищенного препарата НАДФ-МЭ, окрашенного нитратом серебра (2) и очищенного препарата НАДФ-МЭ, окрашенного тетразолиевым методом (3).

Для получения высокоочищенных препаратов НАДФ⁺-МЭ использовали многостадийную схему очистки, результаты которой представлены в табл. 1. При осаждении сульфатом аммония наблюдалось 8-кратное уменьшение содержания общего белка и значительное ингибирование активности фермента. Однако его удельная активность увеличилась до 3.2 Е/мг белка. При обессоливании на сефадексе G-25 удалялись низкомолекулярные примеси, а также сульфат аммония, оказывающий ингибирующее действие на активность фермента. Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-Sephacel, используемая на 4 стадии очистки, позволила отделить примеси других белков. Фермент, выделенный с выходом 15% и степенью очистки 109, имел удельную активность 93 E/мг белка (табл. 1).

Электрофоретический анализ полученного препарата НАДФ⁺-МЭ после проявления нитратом серебра показал присутствие только одного белкового компонента с Rf = 0.1, что свидетельствовало о его гомогенности (рис. 1). После специфического проявления активности НАДФ⁺-МЭ тетразолиевым методом было установлено, что этот белковый компонент обладал малатдегидрогеназной активностью (декарбоксилирующей).

Для изучения четвертичной структуры белковой молекулы исследуемого фермента использовали метод электрофореза в присутствии денатурирующего агента додецилсульфата натрия (ДДС-Na), который позволял выявить присутствие субъединиц белка [19]. Результаты электрофореза в денатурирующих условиях приведены на рис. 2. Молекулярная масса субъединицы равнялась 54 ± 3.2 кДа, молекулярная масса нативной молекулы НАДФ⁺-МЭ была определена методом гель-хроматографии на сефадексе G-200 и составила 225 ± 8.4 кДа. Таким образом, можно заключить, что исследуемый фермент (НАДФ⁺-МЭ) состоял из четырех одинаковых субъединиц, то есть являлся гомотетрамером.

Рис. 2.

Электрофорез в ПААГ в присутствии ДДС-Na НАДФ-МЭ (I) из мезофилла листьев кукурузы (8) и белки-маркеры (II) молекулярной массы: β-галактозидаза – 116 кДа (1), БСА– 66.2 кДа (2), овальбумин – 45 кДа (3), лактатдегидрогеназа – 35 кДа (4), рестриктаза Bsp98l – 25 кДа (5), β-лактоглобулин– 8.4 кДа (6), лизоцим – 14.4 кДа (7).

Были изучены каталитические свойства гомогенной НАДФ⁺-МЭ. Известно, что концентрация субстрата и его сродство с ферментом определяет скорость ферментативной реакции. Исследование процесса восстановления малата высокоочищенной НАДФ⁺-МЭ позволило доказать, что ферментативная реакция подчиняется закону Михаэлиса-Ментен [14]. Величины констант Михаэлиса для НАДФ⁺-МЭ, представленные на графиках, составили по малату – 5.5 мМ, НАДФ⁺ – 4.5 мМ, пирувату – 1.3 мМ и НАДФН – 0.9 мМ (рис. 3 и 4).

Рис. 3.

Определение значения K_м для НАДФ-МЭ в прямой реакции по малату (а) и c НАДФ⁺(б).

Рис. 4.

Определение значения K_м для НАДФ-МЭ в обратной реакции по пирувату (а) и НАДФН (б).

Изучение влияния рН среды на активность НАДФ⁺-МЭ показало, что оптимум действия фермента в прямой и обратной реакции – рН 8.0 (рис. 5). Следует отметить, что другие формы оксидоредуцирующих малатдегидрогеназ из хлоропластов, пероксисом, митохондрий и цитоплазмы характеризовались оптимальными значениями рН для прямой реакции 9.5, а обратной – 9.0 [20].

Рис. 5.

Зависимость активности НАДФ-МЭ от рН среды в прямой (а) и обратной (б) реакции.

Таким образом, использование многостадийной схемы очистки позволило получить электрофоретически гомогенные препараты цитоплазматической декарбоксилирующей малатдегидрогеназы из мезофилла листьев кукурузы. Были исследованы ее физико-химические и каталитические характеристики. Установлено, что фермент представлял собой гомотетрамер, состоящий из четырех одинаковых субъединиц. Обнаружено, что фермент проявлял максимальное сродство по отношению к пировиноградной кислоте. Различные кинетические и каталитические характеристики НАДФ⁺-МЭ из мезофилла листьев кукурузы свидетельствовали об его участии в катализе различных метаболических процессов.

Исследования выполнены при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 19-14-00150).