Прикладная биохимия и микробиология, 2020, T. 56, № 5, стр. 452-464

МЕТОДИКА

Материалы. Образцы METzAA (чистота 98%, определена методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ВЭЖХ) и MMTD, (чистота 97%, ВЭЖХ) предоставлены Сычуаньским индустриальным институтом антибиотиков (Китай). Остальные использованные реагенты: 7-ACA (“Anhui BBCA Pharmaceutical”, Китай, чистота 97%, ВЭЖХ); натриевая соль CEZ (“Sigma-Aldrich”, США стандарт, чистота 98%, ВЭЖХ); TzAA (“Sigma-Aldrich” США стандарт, чистота 99.9%, ВЭЖХ). Образец S-p CEZ с ВЭЖХ чистотой 94.8%, использовавшийся в качестве стандарта при анализах методом ВЭЖХ, а также для изучения растворимости, был выделен осаждением при рН 2.0 из реакционной смеси, полученной путем биокаталитического синтеза с последующей очисткой методом перекристаллизации.

Получение биокатализатора IECASA. Использованный в работе образец IECASA был получен путем выделения CASA из биомассы клеток штамма E. coli VKPM B-12316 и иммобилизации фермента на макропористом эпокси-активированном носителе Seplite LX-1000EP (“Sunresin New Materials”, Китай) как это описано в работе [3]. Синтетазная активность IECASA, определенная по синтезу CEZ [3], составила 420 ME/г влажного биокатализатора при содержании сухих веществ 37.2%.

За 1 международную единицу ферментативной (синтетазной) активности образца в реакции синтеза цефазолина (1 МЕ) принимали количество фермента, катализирующее получение 1 мкмоль продукта за 1 мин в растворе, содержащем 60 мМ TDA и 240 мМ METzAA при рН 7.5 и 30°С.

Анализ методом ВЭЖХ. Анализы проб методом ВЭЖХ осуществляли в изократическом режиме с использованием хроматографа фирмы Gilson (США), оснащенного УФ-детектором, на колонке Spherisorb ODS, 250 × 4 мм с размером частиц 7.5 мкм, при температуре 30°С, скорости потока 1.0 мл/мин и детекции при 214 или 254 нм. В качестве мобильной фазы использовали смесь 50 мМ фосфатно-аммонийного буфера с метанолом. Условия анализа различных реакционных смесей методом ВЭЖХ и времена удерживания компонентов (RT) приведены в табл. 1.

Проведение биокаталитического синтеза S-p CEZ. Синтез S-p CEZ осуществляли в стеклянном реакторе, оснащенном механической лопастной мешалкой и системами контроля и поддержания рН и температуры, при начальном объеме реакционной смеси 75 мл. Исходный раствор субстратов (7-АСА и METzAA) с выбранными начальными концентрациями ($C_{{{\text{KA}}}}^{{\text{o}}}$ и $C_{{{\text{AA}}}}^{{\text{o}}}$) готовили при 30°С и постоянном перемешивании. Аликвоту 7-АСА суспрендировали в 0.3 М фосфатно-натриевом буфере (ФБ) с рН 8.3, суспензию перемешивали до прекращения снижения рН, затем при интенсивном перемешивании небольшими порциями добавляли 2 М NaOH вплоть до полного растворения 7-АСА при рН 6.8–7.2. В полученный раствор вносили аликвоту METzAA, перемешивали до растворения и доводили объем раствора до 75 мл 0.3 М ФБ с рН 7.0. При умеренном перемешивании при 30°С запускали процесс синтеза внесением IECASA в раствор субстратов в количестве 1.8 г влажного биокатилизатора (концентрация фермента в реакционной смеси C_E = 10 МЕ/мл). В ходе синтеза рН спонтанно снижался до 6.0, а затем его поддерживали на этом уровне путем добавления 2 М NaOH до завершения процесса. Процесс останавливали, отделяя биокатализатор от реакционной смеси фильтрованием на пористом стеклянном фильтре.

Для изучения динамики синтеза S-p CEZ в пробах, отбираемых из реакционной смеси по ходу процесса, методом ВЭЖХ определяли содержание четырех компонентов: S-p CEZ, 7-АСА, METzAA и TzAA. Процесс синтеза проводили до достижения стабильного плато на зависимости текущей концентрации S-p CEZ от времени. Максимальную степень трансформации 7-АСА в S-p CEZ (максимальный выход S-p CEZ ${{\eta }^{{{\text{max}}}}},$ %) рассчитывали по формуле ${{\eta }^{{{\text{max}}}}} = \frac{{C_{{{\text{prod}}}}^{{\max }}}}{{C_{{{\text{KA}}}}^{{\text{o}}}}} \times 100,$ где $C_{{{\text{prod}}}}^{{\max }}$ – максимальная концентрация целевого продукта (средние данные на плато); $C_{{{\text{KA}}}}^{{\text{o}}}$ – начальная концентрация КА.

Определение бимолекулярных констант реакций гидролиза CEZ и S-p CEZ. Процессы гидролиза CEZ или S-p CEZ, катализируемые IECASA, проводили в конических колбах, помещенных в водяной шейкер-инкубатор, при постоянном перемешивании при 30°С в 0.3 М ФБ, рН 6.5, варьируя начальные концентрации гидролизуемого β‑лактамного соединения (С ^o, мМ) в пределах от 5 до 30 мМ. Каждая реакционная смесь, объемом 10 мл содержала 30–40 мг влажного биокатализатора с известным содержанием сухих веществ. Текущую концентрацию образующейся аминокислоты (TDA или 7-ACA) в реакционной смеси определяли методом ВЭЖХ, отбирая пробы каждые 3–5 мин. По линейному участку кривой накопления продукта определяли начальную скорость гидролиза CEZ или S-p CEZ в пересчете на 1 г сухого биокатализатора (V, мМ мин^–1 г^–1). Результаты, согласно методу Лайнувера–Берка [25], представляли в виде зависимости 1/V от 1/C ^o, полученные прямые обрабатывали в программе Exсel и рассчитывали бимолекулярные константы гидролитического процесса, отнесенные к 1 г сухого биокатализатора (V_max/K_m, мин^–1 г^–1), где K_m (мМ) – константа Михаэлиса, V_max (мМ мин^–1 г^–1) – максимальная скорость ферментативной реакции.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Растворимость соединений, вовлеченных в процессы биокаталитического синтеза CEZ и S-p CEZ. В реакционной смеси, получаемой при биокаталитическом синтезе β‑лактамного антибиотика методом ацильного переноса, присутствуют четыре компонента: целевой продукт (CEZ или S-p CEZ), КА (TDA или 7-ACA), АА (METzAA) и побочный продукт (TzAA). Учет их растворимости является важным инструментом оптимизации процессов биокаталитической трансформации и последующего выделения целевого продукта. [3, 26]. Имеющиеся в литературе данные о растворимости указанных выше соединений, а также результаты изучения растворимости 7-ACA, S-p CEZ и CEZ, полученные в настоящей работе, приведены в табл. 2.

Ранее [3] в условиях, моделирующих процесс синтеза CEZ, были изучены растворимость неэлектролита METzAA, рН-зависимость растворимости аминокислоты TDA и продемонстрирован эффект перенасыщения раствора TDA при снижении рН. Полученные данные позволили разработать эффективный метод биокаталитического синтеза CEZ в ступенчатом градиенте рН с использованием исходной концентрации TDA ($C_{{{\text{KA}}}}^{{\text{o}}}$ = 150–200 мМ), многократно превосходящей ее растворимость при нейтральных рН, оптимальных для функционирования биокатализатора.

В настоящем исследовании были изучены рН-зависимости растворимости таких компонентов реакционной смеси синтеза S-p CEZ, как КА (7-ACA) и целевой продукт S-p CEZ, а также антибиотика CEZ, получаемого в той же реакционной смеси без выделения полупродукта путем замещения в нем 3-ацетокси-группы с помощью MMTD. Влияние pH на растворимость 7-АСА, S-p CEZ и CEZ изучали методом насыщения [26, 27] в условиях, подобранных ранее для биокаталитического синтеза CEZ (0.3 М ФБ, 30°С) [3]. Методика проведения эксперимента описана в работах [3, 26].

Зависимость от рН растворимости (S, М) монокарбоновых кислот S-p CEZ и CEZ, а также TzAA описывается уравнением (1):

Зависимость от рН растворимости (S, мМ) аминокислот (7-ACA и TDA), имеющих по две ионогенные группы, описывается уравнением (2):

В условиях полного протонирования карбоксильной группы аминокислоты, то есть при нейтральных и щелочных значениях рН, применимо уравнение (2.1):

В уравнениях (1), (2) и (2.1) использованы следующие обозначения:

[H⁺] – концентрация ионов водорода при заданном рН, мМ;

K₁ – константа ионизации карбоксильной группа монокарбоновой кислоты или аминокислоты, мM;

K₂ – константа ионизации аминогруппы аминокислоты, мM;

S ^o – растворимость индивидуальной незаряженной формы монокарбоновой кислоты (характеристическая растворимость электролита), мM;

S^± – растворимость индивидуальной электро-нейтральной цвиттерионной формы аминокислоты (характеристическая растворимость электролита), мM.

Использование приведенных выше уравнений позволяло рассчитывать константы, определяющие растворимость электролитов [26].

На рис. 2а показана линеаризация в координатах уравнения (2.1) (S vs. 1/[H⁺]) экспериментальных данных, полученных при изучении влияния рН на растворимость аминокислоты 7-ACA в области рН, близкой к значению pK₂, известному из литературных данных (табл. 2) [28]. Линеаризация экспериментальных данных, полученных при изучении влияния рН на растворимость монокарбоновых кислот S-p CEZ и CEZ в кислой области рН, представлена на рис. 2б и 2в соответственно. Рассчитанные значения характеристической растворимости (S^± или S^o) и констант ионизации аминогруппы аминокислоты (pK₂) или карбоксильной группы монокарбоновых кислот (pK₁) сопоставлены с опубликованными ранее данными в табл. 2. Величины pK₂ и S^± для 7-ACA, определенные нами в 0.3 М ФБ при 30°С, практически совпадали с константами, определенными в 0.1 М NaCl при 20°С [28]. Сопоставление констант, определенных для 7-ACA и TDA в одинаковых условиях (0.3 М ФБ, 30°С), показало, что замена 3‑ацетокси-группы на MMTD приводило к смещению величины рK₂, характеризующей ионизацию аминогруппы в С7 положении β-лактама, на 0.5 единиц в щелочную область и к 10-кратному уменьшению S^±. Это влечет за собой существенное снижение растворимости аминокислоты в диапазоне рН 6.0–8.0, используемом для осуществления биокаталитического синтеза. В случае монокарбоновых кислот S-p CEZ и CEZ замена 3-ацетокси-группы на MMTD также снижала характеристическую растворимость в 10 раз. При этом величина рK₁, характеризующая ионизацию карбоксильной группы в С4 положении β-лактама, незначительно смещалась в щелочную область (на 0.17).

Сопоставление констант, определенных для CEZ в воде при 20°С [15] и в 0.3 М ФБ при 30°С, свидетельствовало о том, что увеличение ионной силы среды и повышение температуры не влияло на величину pK₁, но почти вдвое снижало характеристическую растворимость S ^o.

На рис. 3 показаны рассчитанные с использованием констант, представленных в табл. 2, теоретические кривые зависимости растворимости компонентов реакционных смесей, получаемых при биокаталитическом синтезе CEZ и S-p CEZ, от рН.

Растворимость METzAA, не являющегося электролитом, не зависела от рН. Ранее было установлено [3], что в 0.3 М ФБ при 30°С она составляла 1440 мМ (табл. 2), что позволяло использовать METzAA в высоких концентрациях как АА при биокаталитическом синтезе. В случае TzAA низкое значение рK₁ и высокое значение S^o (табл. 2) уже при рН 2.7 обеспечивали высокую растворимость S = 2560 мМ (рис. 3, 5). В области рН 6.0–8.0, где протекают реакции, катализируемые IECASA [3], растворимость этого побочного продукта процессов синтеза с ацильным переносом столь высока, что его выпадение в осадок не может осложнять процесс при доступных исходных концентрациях субстратов.

При биокаталитическом синтезе CEZ низкая растворимость TDA в рабочем диапазоне рН 6.0–8.0 (рис. 3, кривая 1) являлась основным осложняющим фактором для приготовления исходной реакционной смеси и осуществления процесса при высокой исходной концентрации КА ($C_{{{\text{KA}}}}^{{\text{o}}}$) без выпадения осадка в ходе синтеза [3]. В диапазоне рН 6.0–8.0 растворимость 7-ACA примерно в 32 раза превосходила растворимость TDA (рис. 3, кривые 1, 2), что обеспечивало существенные преимущества процесса биокаталитического синтеза S-p CEZ по сравнению с синтезом CEZ, как на стадии приготовления исходной реакционной смеси, так и при проведении биокаталитической трансформации.

Кривая, описывающая зависимость растворимости S-p CEZ от рН, сдвинута в сторону низких значений рН по сравнению с соответствующей кривой для CEZ (рис. 3, кривые 3 и 4), а уровень значений S для полупродукта более чем в 130 раз превосходит растворимость CEZ при том же рН. Например, при рН 4.0 растворимость S-p CEZ и CEZ составляла 2300 мМ и 17 мМ соответственно. В рабочем диапазоне рН 6.0–8.0 оба продукта прекрасно растворимы, что обеспечивало их сохранение в растворе в процессе биокаталитической трансформации. Растворимость продуктов в области низких рН важна для разработки метода выделения их из конечной реакционной смеси путем осаждения. Относительно высокая растворимость S-p CEZ при рН около 2.0 была негативным фактором, так как влекла за собой потери продукта при осаждении. В этой связи целесообразна разработка процесса химической трансформации S-p CEZ в CEZ непосредственно в конечной реакционной смеси после биокаталитической трансформации без выделения полупродукта.

Биокаталитический синтез полупродукта CEZ, катализируемый IECASA. Биокаталитическую трансформацию 7-ACA в S-p CEZ осуществляли в 0.3 М ФБ при 30°С, C_E = 10 МЕ/мл, варьируя $C_{{{\text{KA}}}}^{{\text{o}}}$ в диапазоне 55–320 мМ и ${{X}^{{\text{o}}}}$ в диапазоне 1.5–3.5 М/М при $C_{{{\text{AA}}}}^{{\text{o}}}$ не более 830 мМ, что не превышало растворимость METzAA в условиях опыта (табл. 2, рис. 3, кривая 6). Высокая растворимость 7-ACA при рН близких к нейтральному (рис. 3, кривая 2), позволила во всем использованном диапазоне $C_{{{\text{KA}}}}^{{\text{o}}}$ растворять ее при рН ~ 7.0. Это являлось существенным преимуществом перед процедурой приготовления раствора КА для синтеза CEZ [3], когда из-за низкой растворимости TDA ее необходимо растворять при высоком рН (вплоть до 8.5), неблагоприятном для стабильности β-лактама, при этом удавалось достичь $C_{{{\text{KA}}}}^{{\text{o}}}$ не более 200 мМ. Начинать синтез CEZ приходилось также при рН 8.2–8.3, неблагоприятном для активности и стабильности IECASA [3].

Синтез S-p CEZ начинали при рН 6.8–7.2 после последовательного внесения METzAA и биокатализатора в раствор 7-ACA и проводили при спонтанно снижающемся рН с 7.0 до 6.0, т.е. в условиях, оптимальных для функционирования и стабильности IECASA. Далее поддерживали рН 6.0 до завершения трансформации. Снижение рН по ходу процесса синтеза β-лактама обусловлено образованием свободной TzAA – продукта побочных гидролитических реакций, в первую очередь METzAA (рис. 1). Снижение рН может сопровождаться выпадением в осадок неацилированной КА, если ее остаточная концентрация, превысит растворимость данного соединения при текущем рН, как это наблюдалось при трансформации слабо растворимой TDA в CEZ в спонтанном градиенте рН от 8.2–8.3 до 6.0 [3]. Критическое значение рН, при котором происходило выпадение КА, зависит от констант ионизации аминокислоты, определяющих рН-зависимость ее растворимости (табл. 2), а также от операционных параметров $C_{{{\text{KA}}}}^{{\text{o}}}$ и ${{X}^{{\text{o}}}},$ определяющих при заданных температуре и C_E степень трансформации КА в целевой β-лактам к моменту достижения критического рН. Для осуществления процесса синтеза CEZ был разработан ступенчатый градиент рН, при котором на фоне самопроизвольного снижения рН реакционной смеси от начального значения 8.2–8.3 последовательно проводили его искусственное поддержание на уровнях 6.8 и 6.0, что обеспечивало сохранение TDA в растворе [3].

В настоящем исследовании трансформацию 7‑ACA в S-p CEZ в диапазоне рН от 7.0 до 6.0 осуществляли в спонтанном градиенте, и при этом процесс не был осложнен выпадением КА даже при высоком избытке METzAA (${{X}^{{\text{o}}}}$ = 3.0 М/М), способствующем интенсивному выделению TzAA, в сочетании с $C_{{{\text{KA}}}}^{{\text{o}}}$ вплоть до 275 мМ. Растворимость 7-ACA закономерно падала при снижении рН (рис. 3, кривая 2) до S = 60 мМ при рН 6.0, однако в выбранных операционных условиях ее уровень во всем рабочем диапазоне рН был достаточно высок для сохранения нетрансформированной КА в растворе. Снижение избытка АА до ${{X}^{{\text{o}}}}$ = 2.5 М/М позволяло осуществить синтез S-p CEZ в спонтанном градиенте рН и при более высокой начальной концентрации 7-ACA $C_{{{\text{KA}}}}^{{\text{o}}}$ = 320 мМ.

На рис. 4 показана зависимость от времени состава реакционной смеси, образующейся при кинетически-контролируемом синтезе S-p CEZ, катализируемом IECASA, а именно, динамика расхода КА 7-ACA и АА METzAA, а также динамика накопления целевого β-лактама S-p CEZ и побочного продукта TzAA. При этом динамика относительной концентрации S-p CEZ отражает зависимость выхода целевого продукта синтеза от времени по отношению к содержащему β-лактам субстрату (7-ACA). Важной особенностью процесса является наличие продолжительного плато на кривой накопления S-p CEZ, когда достигается максимальный выход продукта (${{\eta }^{{{\text{max}}}}}$). Как и в случае синтеза CEZ, катализируемого IECASA [3], наличие плато объясняется установлением продолжительного кинетического равновесия между процессами синтеза и гидролиза β-лактамного продукта. Сохранение 100%-ного баланса как по β-лактам-, так и по тетразолил-содержащим компонентам (рис. 4) свидетельствовало об отсутствии в системе неконтролируемых побочных процессов, в том числе связанных с разрушением β-лактама.

С целью оптимизации процесса синтеза S-p CEZ, катализируемого IECASA, была осуществлена серия экспериментов при различных $C_{{{\text{KA}}}}^{{\text{o}}}$ (55–320 мМ) и ${{X}^{{\text{o}}}}$ (1.5–3.5 М/М) в стандартных условиях, выбранных ранее [3] для синтеза CEZ (30°С, C_E = 10–12 МЕ/мл, 0.3 М ФБ). Был использован спонтанный градиент рН от рН 7.0 ± 0.2 до рН 6.0, с последующим поддержанием рН 6.0 ± 0.1 с помощью добавления 2 М раствора NaOH до завершения процесса. Эффективность процесса характеризовали величиной максимального выхода S-p CEZ (${{\eta }^{{{\text{max}}}}},$ %), рассчитанного как среднее значение на плато накопления целевого продукта. Время достижения максимальной концентрации S-p CEZ в реакционной смеси составляло 25–50 мин, в зависимости от операционных условий.

Полученные результаты по синтезу S-p CEZ, катализируемому IECASA, обобщены в виде зависимостей максимального выхода продукта от $C_{{{\text{KA}}}}^{{\text{o}}}$ (рис. 5, кривые 1, 1а) и от ${{X}^{{\text{o}}}}$ (рис. 6, кривая 1), а также сопоставлены с полученными ранее результатами по биокаталитическому синтезу CEZ [3] (рис. 5, кривые 2, 3; рис. 6, кривые 2, 3). Осуществление синтеза CEZ в спонтанном градиенте рН (рис. 5, кривая 3; рис. 6, кривая 3) позволило достичь $\eta _{{{\text{CEZ}}}}^{{{\text{max}}}}$ = (92 ± 2)%, но только при $C_{{{\text{KA}}}}^{{\text{o}}}$ = = 100–140 мМ и ${{X}^{{\text{o}}}}$ = 3.1–3.5 М/М (рис. 5, кривая 3). Повышение исходной концентрации TDA до $C_{{{\text{KA}}}}^{{\text{o}}}$ ≥ 145 мМ приводило к падению выхода CEZ до 85% и ниже (рис. 6, кривая 3) из-за выпадения осадка TDA при снижении рН в ходе процесса. Выпадение TDA в осадок удавалось предотвратить при осуществлении синтеза CEZ в ступенчатом градиенте рН (рис. 5, кривая 2; рис. 6, кривая 2). При этом в диапазоне концентраций TDA $C_{{{\text{KA}}}}^{{\text{o}}}$ = 150–200 мМ при ${{X}^{{\text{o}}}}$ = 3.1–3.5 М/М достигался выход ${{\eta }^{{{\text{max}}}}}$ = (93.5 ± 1.5)%. Эти условия могут быть приняты как оптимальные для синтеза CEZ, катализируемого IECASA.

S-p CEZ удавалось синтезировать с более высоким выходом ${{\eta }^{{{\text{max}}}}}$ = (96.5 ± 1.5)% в спонтанном градиенте рН в пределах концентраций 7-ACA $C_{{{\text{KA}}}}^{{\text{o}}}$ = 175–275 мМ при ${{X}^{{\text{o}}}}$ = 3.0 М/М ( рис. 5, кривая 1; рис. 6, кривая 1). Существенно, что при высоких концентрациях 7-ACA кривая зависимости ${{\eta }^{{{\text{max}}}}}$ от ${{X}^{{\text{o}}}}$ (рис. 6, кривая 1) выходила на плато при ${{X}^{{\text{o}}}}$ = 3.0 М/М, а снижение мольного избытка до ${{X}^{{\text{o}}}}$ = 2.5 М/М сопровождалось незначительным падением выхода до ${{\eta }^{{{\text{max}}}}}$ = (95.0 ± 1.5)% (рис. 5, кривая 1а).

Увеличение выхода в процессе кинетически-контролируемого синтеза, катализируемого IECAS-A, при замене TDA на 7-ACA являлось, в частности, результатом меньшей специфичности фермента к побочной реакции гидролиза целевого β-лактама (S-p CEZ по сравнению CEZ). Специфичность IECASA к гидролизу CEZ и S-p CEZ оценивали по бимолекулярным константам соответствующих процессов, определенным по методу Лайнувера–Берка (рис. 7). Бимолекулярные константы гидролитических процессов (V_max/K_m, мин^–1 г^–1), рассчитанные по представленным прямым, составляли 0.24 ± 0.01 мин^–1 г^–1 и 0.18 ± 0.01 мин^–1 г^–1 для CEZ и S-p CEZ соответственно, т.е. целевой продукт кинетически-контролируемого синтеза S-p CEZ гидролизовался IECASA на 30% менее эффективно, чем продукт синтеза CEZ.

Оптимизация процесса синтеза β-лактама, катализируемого IECASA, была направлена на достижение максимального выхода целевого продукта при максимальной допустимой величине $C_{{{\text{KA}}}}^{{\text{o}}}$ и минимальной допустимой величине ${{X}^{{\text{o}}}},$ что обеспечивало высокую концентрацию целевого продукта в реакционной смеси после трансформации при минимизации содержания примесей (остаточная КА и TzAA – продукт побочных гидролитических процессов). В табл. 3 результаты ряда экспериментов по синтезу CEZ и S-p CEZ в различных условиях сопоставлены по параметрам эффективности процесса, таким как максимальный выход продукта по отношению к β-лактамному субстрату (${{\eta }^{{{\text{max}}}}},$ %) и состав конечной реакционной смеси после трансформации. В конечной реакционной смеси определяли концентрации целевого продукта (CEZ или S-p CEZ) – С_prod (мМ), КА (TDA или 7-ACA) – С_КА (мМ) и суммарную концентрацию АА и побочного продукта (METzAA и TzAA) – С_{ME + TzAA} (мМ). Последние два компонента учитываются суммарно, так как перед выделением целевого продукта остаточный METzAA легко может быть гидролизован до TzAA.

Осуществление синтеза CEZ в оптимальных условиях с использованием ступенчатого градиента рН позволило при ${{X}^{{\text{o}}}}$ = 3.4 М/М, исходя из максимально допустимой $C_{{{\text{KA}}}}^{{\text{o}}}$ = 200 мМ (табл. 3), осуществить трансформацию с выходом ${{\eta }^{{{\text{max}}}}}$ = 93.9% и достичь в реакционной смеси концентрации антибиотика С_prod = 190 мМ при С_КА = 12 мМ и С_{ME + TzAA} = 490 мМ. Процесс синтеза S-p CEZ при практически такой же $C_{{{\text{KA}}}}^{{\text{o}}}$ = 204 мМ был осуществлен в более простом спонтанном градиенте рН с существенно более высоким выходом ${{\eta }^{{{\text{max}}}}}$ = 97.7%, несмотря на использование меньшего избытка ацилирующего агента ${{X}^{{\text{o}}}}$ = 3.0 М/М (табл. 3). Это обеспечило повышение концентрации целевого β-лактама в реакционной смеси до С_prod = 200 мМ при соответствующем снижении С_КА и С_{ME + TzAA} до 5 и 415 мМ соответственно. Использование более высоких исходных концентраций 7-ACA $C_{{{\text{KA}}}}^{{\text{o}}}$ = 276 мМ и $C_{{{\text{KA}}}}^{{\text{o}}}$ = 322 мМ (табл. 3) позволило достичь высокого выхода S-p CEZ около 95% и увеличить концентрацию целевого продукта в реакционной смеси в 1.3–1.5 раза по сравнению с оптимальным процессом синтеза CEZ практически без увеличения остаточного содержания КА. При этом по сравнению с оптимальным процессом синтеза CEZ величина С_{ME + TzAA} возросла на 15% при ${{X}^{{\text{o}}}}$ = 3.0 М/М и лишь на 2% при ${{X}^{{\text{o}}}}$ = 2.5 М/М.

S-p CEZ может быть трансформирован в CEZ непосредственно в реакционной смеси, полученной при биокаталитическом синтезе, после отделения биокатализатора. Инкубация с MMTD, взятом в трехкратном мольном избытке по отношению к S-p CEZ, позволяла при 65°С и рН 6.0–6.5 достичь степени трансформации полупродукта в CEZ, равной 96.5%. Оптимизация процесса трансформации будет осуществлена в ходе дальнейших исследований, связанных с разработкой процесса выделения и очистки CEZ.

Сопоставление биокаталитического синтеза CEZ, исходя из TDA, и S-p CEZ, исходя из 7-ACA, (рис. 1, стадии 2 и 3) свидетельствовало о ряде важных преимуществ второго процесса:

− приготовление исходного раствора 7-ACA при нейтральном рН (вместо рН 8.2–8.5 для раствора TDA) с достижением более высокой $C_{{{\text{KA}}}}^{{\text{o}}};$

− осуществление процесса синтеза S-p CEZ в простом спонтанном градиенте рН 7.0–6.0, благоприятном для активности и стабильности фермента, вместо ступенчатого градиента рН от 8.3 до 6.0, используемого при синтезе CEZ;

− повышение выхода целевого β-лактама в оптимизированных для каждого процесса условиях с (93.5 ± 1.5)% до (96.5 ± 1.5)%;

− повышение концентрации целевого β-лактама в конечной реакционной смеси в 1.3–1.5 раза;

− возможность использования продукта биокаталитического ацилирования 7-ACA метиловым эфиром TzAA в качестве полупродукта для получения не только CEZ, но и цефалоспоринового антибиотика цефтезола.

Получение CEZ через трансформации 3 и 4 (рис. 1) может быть осуществлено как единый процесс без выделения S-p CEZ из реакционной смеси. Следует отметить также, что процесс химической трансформации S-p CEZ в CEZ (рис. 1, трансформация 4), протекающий при 30°С в водной среде, с экологической точки зрения предпочтительнее получения TDA из 7-ACA (рис. 1, трансформация 1), осуществляемого при низкой температуре (–40°С) в среде токсичных реагентов (BF₃, CH₃CN). Можно заключить, что химико-биокаталитический синтез CEZ по пути прямого биокаталитического ацилирования 7-ACA представляется перспективной заменой традиционному пути, использующему биокаталитическое ацилирование TDA.

Работа выполнена в рамках Государственного задания № 593-00003-19 ПР “Фундаментальные и прикладные научные работы в области биотехнологии”.