Прикладная биохимия и микробиология, 2020, T. 56, № 2, стр. 147-155

МЕТОДИКА

Выделение и идентификация штаммов. Объектами исследования служили 10 штаммов Н1, Н2, Н3, Н4, A-Ha-1, K-Ha-4, Hо-16K, Hp-8, Т-Ha и 45-2 грибов рода Heterobasidion из коллекции чистых культур лаборатории лесных культур, микологии и фитопатологии Института леса им. В.Н. Сукачева ФИЦ КНЦ СО РАН (Красноярск, Россия). Штаммы были выделены в 2014–2018 гг. из плодовых тел и базидиом Heterobasidion, произраставших на различных хвойных породах, либо (в единичном случае) из древесины поваленного дерева с характерными признаками поражения корневой губкой. Штаммы были изолированы в чистые культуры на селективных питательных средах: мальт-экстракт-агар (МЭА), содержащий 0.5% танина и Норкранс-агар (НРКА) [15, 16]. Хранение культур осуществляли на скошенном МЭА при 6°С.

Морфологические признаки изучали у грибов, выращенных на морковном агаре, МЭА и НРКА при 24 ± 1°С. Микроструктуры оценивали методами фазово-контрастной и светопольной микроскопии с использованием светового микроскопа Nikon Eclipse Сi с системой фотодокументации (“Nikon”, Япония) и электронного сканирующего микроскопа Hitachi SEM ТМ-1000 с 10 000 кратным увеличением и разрешением 30 нм (“Hitachi Ltd.”, Япония). Видовую идентификацию штаммов верифицировали молекулярно-генетическими методами. Секвенирование участков генетических маркеров ITS (internal transcribed spacer) и TEF-1alpha (transcription elongation factor 1-alpha) проводили на секвенаторе Illumina MySeq (“Illumina”, США) с использованием оборудования ЦКП “Инновационные технологии защиты растений” Всероссийского научно-исследовательского института защиты растений (Санкт-Петербург-Пушкин, Россия) и ЦКП “Геномика” (ИХБФМ СО РАН, Новосибирск, Россия). ДНК выделяли по методу фенол-хлороформной экстракции [17]. Таксономическое положение штаммов и эволюцию определяли с помощью программного обеспечения MEGA-X [18, 19]. Нуклеотидные последовательности сравнивали с последовательностями известных штаммов из базы NCBI (Information, U.S. National Library of Medicine).

Условия культивирования грибов, выделение, идентификация и количественное определение вторичных метаболитов. При изучении продукции вторичных метаболитов штаммы культивировали в глубинных условиях в колбах (750 мл) со 100 мл среды на шейкере (220 об./мин) в течение 11 сут при 24°С. При скрининге была использована синтетическая среда НРК [16]. Для сравнения биосинтетической способности продуктивных штаммов использовали две органно-минеральные среды. Среда 2 содержала (г/л дистиллированной воды): глюкозу – 5.0, мальт экстракт – 5.0, KH₂PO₄ – 0.5, MgSO₄ ⋅ 7H₂O – 0.5, рН 5.5 [20]. Среда 3, имела следующий состав (г/л дистиллированной воды): глюкоза – 4.0, дрожжевой экстракт – 4.0, мальт-экстракт – 10.0, рН 5.5 [21]. Среды засевали 7-суточным мицелием, выращенным глубинно в среде, содержавшей 3% мальт-экстракта.

Вторичные метаболиты экстрагировали из фильтрата культуральной жидкости хлороформом трехкратно при рН 3 и 8. Экстракты анализировали методом ТСХ на пластинках силикагеля (Silica gel F₂₅₄, “Merck”, Германия) в системах хлороформ–метанол–25%-ный аммиак (90 : 10 : 0.1) и хлороформ–ацетон (93 : 7). Метаболиты обнаруживали по поглощению и флуоресценции при 254 и 366 нм. Метаболиты выделяли с помощью препаративной ТСХ (ПТСХ) на пластинках силикагеля (Silica gel F₂₅₄, “Merck”, Германия) в системах растворителей. Идентификацию выделенных метаболитов осуществляли на основе сравнения данных УФ-спектроскопии и масс-спектрометрии с литературными источниками [11–13, 22, 23]. Подробную информацию о структуре соединений получали при анализе МС/МС спектров при энергии коллизии 20–40%.

УФ-спектры соединений в метаноле получали на спектрофотометре UV-160А (“Shimadzu”, Япония). Масс-спектры соединений регистрировали на квадрупольном масс-спектрометре LCQ Advantage MAX (“Thermo Finnigan”, Германия), используя одноканальный шприцевой насос для прямого ввода образца в камеру для химической ионизации.

Количественное содержание фоманноксина определяли спектрофотометрически после ПТСХ на пластинках силикагеля (Silica gel F₂₅₄, “Merck”, Германия) в метаноле при 280 нм. Расчет проводили, используя калибровочную кривую для фоманноксина.

Исследование фитопатогенной активности штаммов. Фитопатогенность оценивали по модифицированному методу [24] с использованием для культивирования грибов полужидкой питательной среды НРК.

Поверхностно стерилизованные семена P. sylvestris проращивали в течение 8–10 сут на поверхности 5%-ного водного агара при 20°С. Проростки перед инфицированием выдерживали при 4°С в течение времени, необходимого для достижения длины корней 1.5–2.5 см, а затем помещали на поверхность 10-суточной культуры гриба так, чтобы их корни были погружены в полужидкую питательную среду НРК. Посевы инкубировали в климатокамере (“Jeio Tech”, Корея) с 12 ч фотопериодом в течение 18 сут при 22°С. По окончании эксперимента оценивали жизнеспособность растений (% от контроля), длину надземной части здоровых проростков (мм), агрессивность штамма грибов (% растений с некрозом от общего количества растений).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование морфолого-культуральных особенностей подтвердило принадлежность изучаемых культур к роду Heterobasidion, а изучение их микроструктур методами растровой электронной микроскопии не выявило значительных микроморфологических различий. На плотных питательных средах формировался хорошо развитый воздушный мицелий с полупрозрачными, тонкостенными генеративными гифами, имеющими септы. Гифы, ветвящиеся под острым, реже под прямым углом, были шириной 1.5–5.0 мкм. Анастомозы протяженностью от 2 до 40 мкм – умеренные. Редкие и простые пряжки размером 2.0–5.5 мкм располагались на прямой широкой гифе. Конидиофоры с апикальной конидиогенной везикулой – прямостоячие, простые или разветвленные, гиалиновые до 200 мкм в длину и 4–10 мкм в диаметре. Диаметр апикальной везикулы составлял 6–15 мкм, поверхность была с коническими зубцами, на которых располагались многочисленные конидии. Конидии размером 3.5–8.0 × × 2.5–6.5 мкм были одноклеточные, гладкие и гиалиновые, они имели форму от яйцевидной до почти шаровидной (рис. 1).

Рис. 1.

Растровая электронная микроскопия вегетативных (мицелий) и репродуктивных (апикальные везикулы с конидиями) структур H. annosum s. s. (а, увеличение ×2500) и H. abietinum (б, увеличение ×4000).

Видовую идентификацию проводили с использованием молекулярно-генетических методов, включающих секвенирование участков генетических маркеров ITS и TEF-1alpha с последующим биоинформатическим анализом. Филогенетическое дерево (рис. 2) построено по методу попарного внутригруппового невзвешенного среднего [18] и модели [25] с bootstrap тестом [26] в 10 000 репликаций. Всего было проанализировано 29 нуклеотидных последовательностей, при этом генетическое расстояние между видами составило не менее 0.015. Филогенетический анализ консервативных регионов ДНК изученных культур грибов позволил установить четыре устойчивых клада, характерных для видового разделения, и определить принадлежность штаммов H-2, A-Ha-1, K-Ha-4, Т‑Ha и 45-2 к виду H. annosum s. s. (Fr.) Bref., штаммов Hp-8, H-1, H-3 и H-4 к виду H. abietinum Niemelä & Korhonen и штамма Hе-16K к виду H. ecrustosum Tokuda, T. Hatt. & Y.C. Dai.

Рис. 2.

Филогенетическое дерево грибов Heterobasidion sp., составленное на основании сравнительного анализа региона ITS1-ITS2 (△ − обозначены исследуемые штаммы).

Вторичные метаболиты у Heterobasidion изучали после выращивания штаммов в среде НРК, которая обычно применяется при культивировании базидиомицетов [16]. У всех изученных штаммов видов H. annosum s. s. и H. abietinum был обнаружен метаболит 1, мигрирующий при ТСХ с Rf = 0.29 (II). УФ-спектр метаболита 1 имел значения полос поглощения (λ_макс 209, 232, 278, 294 нм), близкие фоманноксину, и положительный молекулярный ион 207(M + H)⁺. В МС/МС спектре также наблюдалось отщепление двух карбоксильных фрагментов и гидроксильной группы. На основании полученных данных метаболит был идентифицирован как 2-(2-гидроксипропан-2-ил)-2,3-дигидробензофуран-5-карбальдегид. У этих штаммов также был идентифицирован метаболит 2, который имел молекулярный ион 205(M + H)⁺, характер расщепления которого был аналогичен предыдущему с разницей в две единицы, что могло указывать на появление двойной связи в фурановом кольце, он представлял собой 2-(2-гидроксипропан-2-ил)-бензофуран-5-карбальдегид (табл. 1).

У штаммов H. annosum Т-Ha, 45-2 и H-2 и H. abietinum Hp-8, H-1, H-3 и H-4 основным метаболитом было соединение 3, мигрирующее при ТСХ с Rf = 0.52 (II). УФ-спектр выделенного метаболита имел максимальные значения полос поглощения при 209, 228, 280 (пл.) и 293 нм. Масс-спектр метаболита 3 показал положительный молекулярный ион 189 (M + H)⁺. В МС/МС спектре метаболита наблюдали последовательное отщепление двух карбоксильных и пропенильной групп (табл. 2). На основании литературных данных этот метаболит был идентифицирован как фоманноксин.

У изучаемых штаммов при ТСХ также был также обнаружен метаболит 4 с Rf = 0.18 (II), который имел УФ-спектр с максимальными значениями полос поглощения при 209, 230 и 290 нм и масс-спектр с положительным молекулярным ионом 217 (M + H)⁺. МС/МС спектр метаболита 4 указывал на наличие двух гидроксильных групп. Метаболит 4 был идентифицирован как 1-(2-(проп-1-ен-2-ил)-2,3-дигидробензофуран-5-ил)пропан-1,2-диол.

Штамм Н. annosum 45-2 синтезировал метаболит 5, мигрирующий с Rf = 0.47 при ТСХ (II), который имел УФ-спектр с λ_макс = 256 нм, характерный для сесквитерпена фоманнозина. Масс-спектр метаболита 5 характеризовался положительным молекулярным ионом 247(M + H)⁺ и наличием гидроксильной и карбонильной групп. На основании полученных данных этот метаболит был идентифицирован как иллудолактон А. У данного штамма также был обнаружен метаболит 6, мигрирующий с Rf = 0.25 (II) при ТСХ, который имел УФ-спектр с λ_макс = 259 нм и молекулярный ион 261 (M + H)⁺, отличающейся от предыдущего метаболита метильной группой. Этот метаболит не был идентифицирован, но УФ-спектр и фрагментация молекулярного иона, схожие с иллудолактоном А, позволяли предположить, что этот метаболит являлся метильным производным иллудолактона А. В органо-минеральной среде 3 H. annosum 45-2 помимо указанных выше метаболитов синтезировал метаболит 7, который имел УФ-спектр с λ_макс = 256 нм и масс-спектр с положительным молекулярным ионом 263 (M + H)⁺. Этот метаболит был идентифицирован как фоманнозин. У штамма H. ecrustosum Не-16 К вышеуказанные вторичные метаболиты не были идентифицированы.

Установлено, что изопреноидный блок фоманноксина образуется из фарнезилдифосфата, предшественником которого является мевалоновая кислота [11]. Ароматическое кольцо соединения синтезируется по шикиматному пути при последовательном элиминировании пирувата из хоризмовой кислоты с образованием гидроксибензойной кислоты с последующим восстановлением до альдегида (рис. 3). Далее в биосинтетическом пути наступает ключевая реакция, ведущая к образованию фоманноксина, а именно алкилирование ароматического кольца изопреноидной единицей, которое осуществляется пренилтрансферазой. Дальнейшая окислительная циклизация приводит к образованию бензогидрофуранового скелета и 2-(2-гидроксипропан-2-ил)-2,3-дигидробензофуран-5-карбальдегида, из которого путем элиминирования воды образуется либо фоманноксин, либо в результате окисления 2-(2-гидроксипропан-2-ил)-бензофуран-5-карбальдегид. Из фоманноксина под действием пируватдекарбоксилазы и последующего восстановления образуется 1-(2-(проп-1-ен-2-ил)-2,3-дигидробензофуран-5-ил)пропан-1,2-диол. Биосинтез фоманнозина начинается с циклизации универсального предшественника сесквитерпенов фарнезилпирофосфата с образованием Δ⁶-протоиллудена предположительно под действием терпенциклазы [12]. Окисление протоиллудена монооксигеназами и дегидрогеназами с образованием иллудола, иллудолактона А и других промежуточных соединений приводит к образованию фоманнозина.

Рис. 3.

Предполагаемый биосинтез фоманноксина и соединений, близких ему по структуре [13]: 1 – 2-(2-гидроксипропан-2-ил)-2,3-дигидробензофуран-5-карбальдегид; 2 – 2-(2-гидроксипропан-2-ил)-бензофуран-5-карбальдегид; 3 – фоманноксин; 4 – 1-(2-(проп-1-ен-2-ил)-2,3-дигидробензофуран-5-ил)-пропан-1,2-диол.

Таким образом, в спектре всех исследованных штаммов вида H. аbietinum и трех штаммов H. annosum присутствовало 4 метаболита фоманноксинового ряда с преобладанием фоманноксина. Это предполагает функционирование у них двух энзиматических путей, преобразующих 2-(2-гидроксипропан-2-ил)-2,3-дигидробензофуран-5-карбальдегид. Однако у двух штаммов H. annosum наблюдался только процесс окисления этого соединения. В то время как у штамма H. annosum 45-2 активно функционировали пренилтрансферазы и терпенциклазы, ключевые ферменты, ведущие к образованию метаболитов фоманноксиного и фоманнозиного ряда.

Известно, что филогенетически близкие виды могут синтезировать сходный профиль вторичных метаболитов [13]. Проведенные исследования по установлению связи между видами грибов комплекса H. annosum s. l. и спектром вторичных метаболитов показало, что образование фоманноксина явилось определяющим фактором для видов Н. annosum s. s. и Н. irregulare. Вид Н. irregulare отличался биосинтезом сесквитерпена-дезоксифоманнозина А, а характерной особенностью видов H. abietinum, H. occidentale была продукция эпоксидрименола и его производных. У изученных штаммов фоманноксин преобладал у трех штаммов H. annosum, а у двух других были обнаружены метаболиты, близкие ему по структуре. Эти результаты соответствовали предложенным хемотаксономическим критериям для вида H. annosum s. s. У фоманноксин-синтезирующего штамма H. annosum 45-2 был идентифицирован фоманнозин и его биосинтетические предшественники, ранее обнаруженные у видов H. irregulare и H. occidentale [11, 12]. У всех изученных штаммов вида H. аbietinum был найден фоманноксин и близкие ему соединения, в то время как отсутствовал эпоксидрименол, характерный для этого вида по данным [13]. Можно предположить, что образование фоманноксина у грибов этого комплекса определяется регуляцией генов его биосинтетического пути в зависимости от применяемых условий культивирования.

Изучение фитопатогенности сибирских штаммов Heterobasidion, проведенное в условиях in vitro, показало, что все штаммы видов H. annosum и H. abietinum проявляли фитопатогенное действие на сеянцы P. sylvestris, вызывая некротическое поражение стеблей и гибель растений. Было обнаружено, что показатели вирулентности штаммов вида H. annosum оказались выше, чем у штаммов вида H. abietinum (табл. 3). Максимальную вирулентность проявлял Н. annosum 45-2, выделенный из плодового тела, произраставшего на A. sibirica (Красноярский край, Россия) и синтезирующий наиболее широкий спектр вторичных метаболитов. Жизнеспособность сеянцев на 6 сут составила 37% на фоне замедления развития стебля по сравнению с контролем в 3.5 раза и массовых некротических поражений (до 70% от общего количества растений). На 12 сут инкубации была отмечена 100%-ная гибель P. sylvestris. На момент завершения эксперимента (18 сут) 100%-ную гибель сеянцев наблюдали при воздействии H. annosum А-На-1 и К-На-4, выделенных с плодовых тел, произраставших на P. sylvestris (Красноярский край и Алтай соответственно, Россия) (табл. 2). Показатели вирулентности H. annosum Т-На и Н2, выделенных с плодового тела, произраставшего на P. sylvestris, и пораженной древесины A. sibirica (Красноярский край, Россия) были несколько ниже. Жизнеспособность сеянцев на 18 сут составила около 30% на фоне замедления в 2 раза развития стебля по сравнению с контролем и некротических поражений до 93% от общего количества растений.

Вирулентность штаммов вида H. abietinum оказалась ниже по сравнению со штаммами H. annosum (табл. 3). На 18 сут эксперимента жизнеспособность растений варьировала от 47 до 59% на фоне замедления в 1.6–1.8 раза развития стебля по сравнению с контролем и некротических поражений от 70 до 92% от общего количества растений. Эти штаммы были выделены в Красноярском крае (Россия) с плодовых тел, произраставших на A. sibirica, P. koraiensis и P. obovata соответственно. К высоковирулентному штамму можно было отнести H. abietinum Нр-8, изолированный из плодового тела с L. sibirica в Красноярском крае. Корейский штамм H. ecrustosum Не-16К, выделенный из плодового тела на P. thunbergii, характеризовался отсутствием выраженной вирулентности. Так, на 18 сут эксперимента жизнеспособность растений и распространение некроза мало отличалось от контроля (табл. 3).

Известно, что фоманноксин является фактором вирулентности грибов Heterobasidion [23, 27]. Было показано, что обработка сеянцев Picea sitchensis 150 мкг/мл фоманноксина через 3 нед. инкубации приводила к быстрому отмиранию корней, хлорозу и опаданию игл. Была установлена in vitro прямая зависимость между концентрацией этого метаболита в среде и прорастанием семян Sitka spruce. Фоманноксин оказался единственным вторичным метаболитом Heterobasidion, который был выделен в концентрации 0.3 мкг/г древесины из зараженной части дерева перед грибными гифами [27]. Эти результаты позволили сделать вывод, что токсин секретируется в растительную ткань перед началом грибной инфекции. Наличие в тканях токсина приводило к гибели клеток растений и способствовало дальнейшему распространению гиф гриба и разрушению древесины.

Для фоманнозина и иллудолактона А также показана фитотоксичная активность [12]. Эти соединения вызывали локальный некроз, приводящий к системной гибели сосны Pinus taeda. Было показано также, что фоманнозин ингибировал рост суспензии клеток ели, Picea abies и Nicotiana tabacum.

Было обнаружено, что сибирские штаммы корневой губки существенно различались по продукции фоманноксина. В среде НРК наиболее активным продуцентом оказался H. abietinum H-1, синтезирующий 55 мкг/мл фоманноксина. Его продукция у H. abietinum Hp-8, H-3 и H-4 была ниже и составила 11, 4 и 5 мкг/мл соответственно. H. annosum 45-2, H-2 и Т-Ha синтезировали 16. 7 и 3 мкг/мл фоманноксина соответственно. У H. annosum K-Ha-4 и A-Ha-1 продукция фоманноксина отсутствовала, но они синтезировали метаболиты фоманноксинового ряда: 2-(2-гидроксипропан-2-ил)-2,3-дигидробензофуран-5-карбальдегид и 2-(2-гидроксипропан-2-ил)-бензофуран-5-карбальдегид.

На трех штаммах было изучено влияние двух других по составу питательных сред на продукцию фоманноксина. Обнаружено, что у H. abietinum H-1 концентрация фоманноксина в органоминеральных средах 2 и 3 была в 2.2 и 4.2 раза ниже по сравнению со средой НРК. Наиболее благоприятной для биосинтеза фоманноксина H. annosum 45-2 была среда 3, поскольку содержание фоманноксина в ней было в 2 раза выше по сравнению со средой НРК, при этом наблюдался также биосинтез фоманнозина. В средах 2 и 3 H. abietinum Hp-8 не синтезировал фоманноксин, но в них были идентифицированы другие метаболиты фоманноксинового ряда: (2-(2-гидроксипропан-2-ил)-2,3-дигидробензофуран-5-карбальдегид и 2-(2-гидроксипропан-2-ил)-бензофуран-5-карбальдегид.

Таким образом, биосинтез фоманноксина определялся физиолого-биохимическими особенностями исследуемых штаммов, при этом состав среды культивирования оказывал регуляторное влияние на биосинтез вторичных метаболитов фоманноксинового ряда. Отсутствие биосинтеза фоманноксина у H. abietinum Hp-8 в органоминеральных средах подтверждало, что его биосинтез определялся регуляцией генов биосинтетического пути в зависимости от условий культивирования.

Сравнение данных фитопатогенности и продукции фоманноксина штаммами показало, что высоко патогенный H. annosum 45-2 характеризовался высокой продукцией фоманноксина (16–32 мкг/мл) и широким спектром синтезированных метаболитов, обладающих фитотоксичными свойствами. У всех штаммов, проявляющих фитопатогенные свойства, были обнаружены вторичные метаболиты фоманоксинового ряда. Различия в степени патогенности и содержания фоманноксина связаны с совокупностью различных факторов, влияющих на эти процессы, например, с отличиями в условиях роста грибов in vivo и in vitro. Недавно было показано, что в процесс грибной инфекции Heterobasidion могут быть также вовлечены небольшие секретируемые белки [28]. Можно предположить, что фитопатогенностью обладают метаболиты, близкие по структуре к фоманноксину, что было показано для штаммов H. annosum K-Ha-4 и A-Ha-1. Эти метаболиты, так же, как и фоманноксин, содержат в структуре ароматическую карбонильную группу, которая, отвечает в основном за повреждающее действие на растительные клетки [29]. Отсутствие биосинтеза фоманноксина и других соединений этой группы у корейского штамма H. ecrustosum He-16K согласовывалось c наблюдениями в работе [30], что этот вид не проявляет патогенные свойства и является сапрофитом.