Прикладная биохимия и микробиология, 2019, T. 55, № 6, стр. 542-552

МЕТОДИКА

Штаммы, использованные в работе. Использовали штаммы A. terreus: WT (ATCC 20542) − дикий тип, HY (№ 43–16) − высокоактивный продуцент LOV, полученный на основе штамма ATCC 20542 методам УФ-мутагенеза [18] и E6 (АТСС 20542/LovE₆) − экспрессируeт lovE из A. terreus под контролем промотора gpdA из A. nidulans [14].

Анализ последовательностей генов кластера биосинтеза LOV. Анализ lov-генов на присутствие сайтов связывания для GAL4-подобного Zn₂Cys₆ транскрипционного фактора [19] проводили в среде Vector NTI v.8.0 software (“Thermo Fisher Scientific”, США) [20]. Для анализа lovA, lovС, lovD, lovE, lovF, lovG, lovT и lovR использовали последовательность GenBank: CH476600.1; для анализа lovB использовали последовательность GenBank: AF151722.

Культивирование штаммов A. terreus с ПА на твердых питательных средах. Для выращивания гриба использовали агаризованную среду для A. terreus (АТ) (г/л): глюкоза – 100, соевая мука – 20, мальт-экстракт – 5, мясной пептон – 5, NaCl – 2, KH₂PO₄ – 0.5, MgSO₄ · 7H2O – 0.5, агар – 20, рН 6.1, и среду Чапека–Докса (ЧД) (г/л): сахароза – 30, NaNO₃ – 2, K₂HPO₄ – 1, MgSO₄ · 7H ₂O – 0.5, KCl – 0.5, FeSO₄ · 7H₂O – 0,01, агар – 20, рН 7.1, без добавок или с добавлением 1,3-диаминопропана (ДАП), или 5 мМ спермидина (СП) (“MP Biomedicals”, США).

Для определения влияния ПА на рост и морфологию колоний A. terreus использовали метод, описанный ранее, с некоторыми изменениями [21]. Клетки A. terreus собирали микробиологической петлей со скошенного АТ-агара, разводили в 0.9%-ном растворе NaCl до оптической плотности OП₆₀₀ = 0.5 и готовили последовательные 10-кратные разведения в 0.9%-ном NaCl. По 2 мкл полученных суспензий использовали для инокуляции агаризованной среды ЧД в чашках Петри, содержащей 5.0 мМ ДАП или 5 мМ СП и без добавления ПА (контрольные образцы). Инкубацию проводили при 26°С в течение 3–5 сут (штаммы WT, E6) или 6–8 сут (штамм HY). Влияние ПА оценивали по характеру роста инокулятов в серии последовательных разведений на агаризованных средах с 5 мМ ДАП или СП по сравнению с контролем без добавок.

Ферментация штаммов A. terreus с ПА. Штаммы предварительно выращивали в пробирках на скошенной среде AT в течение 7 сут при 25°С, переносили микробиологической петлей для инокуляции 30 мл жидкой среды АТ (ПAT, посевная среда). Штаммы на среде ПАТ культивировали 48 ч при 26°С. Одной десятой объема инокулировали ферментационную среду АТ (ФAT, г/л): глюкоза – 200, соевая мука – 40, мальт-экстракт – 5, мясной пептон – 10, NaCl – 2, KH₂PO₄ – 0.5, MgSO₄ · 7H₂O – 0.5, рН 6.1. В среду добавляли СП или ДАП, до конечной концентрации 5мМ, или культивировали без добавления ПА (контроль). Ферментацию проводили в течение 8 – 11 сут при 26°С. Все этапы глубинного культивирования (на средах ПAT и ФAT) проводили в 250 мл колбах Эрленмейера, на качалке CERTOMAT^®BS-1 (“Sartorius”, Германия) при 230 об./мин, как описано ранее [18].

Биомассу отобранных из растущей культуры образцов отделяли центрифугированием, промывали 10 об. Н₂О 2 раза, высушивали при 80°С, 96 ч до постоянного веса и взвешивали.

ВЭЖХ-анализ. Содержание LOV после экстракции этилацетатом из культуральной жидкости, полученной в процессе ферментации A. terreus, определяли методом ВЭЖХ на жидкостном хроматографе Agilent 1200 (“Agilent Technologies”, США), используя хроматографическую колонку Agilent-С18 (4.6 × 250 мм), с диаметром частиц 5 мкм, В подвижной фазе − метанол/0.1 М уксусная кислота (в % соотношении − 85/15) при расходе 1.0 мл/мин. Детекцию проводили при 238 нм.

Получение препаратов тРНК, кДНК, ПЦР-анализ в реальном времени (ПЦР–РВ). Получение суммарной РНК и синтез кДНК проводили в соответствии с протоколами, описанными ранее [15, 22]. На основании последовательностей lovT и lovR в среде Vector NTI v.8 software [20] сконструировали праймеры для оценки уровней экспрессии этих генов (табл. 1). Также использовали ранее подобранные пары праймеров для оценки уровней экспрессии других изучаемых lov-генов (lovA, lovB, lovС, lovD, lovE, lovF, lovG) и laeA, табл. 1 [14, 15]. Реакции и обработку полученных результатов проводили в соответствии с протоколом [22], при этом для нормализации данных об уровнях экспрессии использовали праймеры к ранее подобранным генам “домашнего хозяйства”, актина и убиквитин-конъюгирующего фермента E2_6 [14].

РEЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Уровни экспрессии генов устойчивости и транспорта, входящих в кластер генов биосинтеза LOV у A. terreus WT, HY и E6. В составе кластера биосинтеза LOV у A. terreus находятся гены, выполняющие различные задачи, связанные с функционированием этого ВМ [6]. Ранее был охарактеризован уровень экспрессии биосинтетических генов (lovС, lovD, lovF) и гена регулятора lovE в штаммах A. terreus WT, HY и E6 [14]. Для штаммов WT, HY также был определен уровень экспрессии еще трех биосинтетических генов lovA, lovB и lovG [15]. В настоящей работе на первом этапе изучили уровни экспрессии lov-генов других типов, связанных с активным транспортом LOV из клетки (lovT) и устойчивостью самого продуцента A. terreus к LOV (lovR) (рис. 1а, 1б). При ферментации штамма A. terreus HY наблюдали рост уровня экспрессии обоих этих генов по сравнению со штаммом WT. Для lovR это увеличение составляло 5–7 раз, для lovT – 10–15 раз, что отражало общую тенденцию, связанную с индукцией экспрессии lov-генов у HY штамма, которую ранее прослеживали для биосинтетических генов lovA, lovB, lovС, lovD, lovF и lovG [14, 15]. С физиологической точки зрения индукция экспрессии генов резистентности может быть важна как фактор устойчивости к повышенной продукции LOV у штамма HY. Наряду с этим, для штамма E6 обнаружили снижение уровня экспрессии lovR в 4–5 раз и lovT в 2–3 раза (рис. 1а, 1б), что противоречило ранее отмеченной тенденции повышения экспрессии биосинтетических генов (lovС, lovD, lovF) в штамме E6 по сравнению с WT-штаммом [14].

Рис. 1.

Экспрессия генов lovR (а), lovT (б), lovA (в), lovB (г), lovC (д), lovD (е), lovF (ж) и lovG (з) после культивирования в течение 8 сут (среда ФАТ, 26°С) у штаммов A. terreus WT (1), E6 (2) и HY (3).

Для получения полного профиля экспрессии lov-генов у A. terreus E6 изучили также биосинтетические гены lovA, lovB и lovG (рис. 1в, 1г, 1з). Наибольшее увеличение генной экспрессии наблюдали для lovA, кодирующего цитохром P450, ключевой фермент модификаций построенного нонакетидного звена, осуществляющий две последовательные реакции окислительного гидроксилорования [23]. Уровень экспрессии этого гена в штамме E6 по сравнению с WT-штаммом был повышен в 50–80 раз, что даже превышало экспрессию у штамма HY по сравнению с WT (рис. 1в). Для гена lovB, кодирующего нонакетидсинтазу (NKS), центральный фермент для биосинтеза LOV, наблюдаемая в штамме E6 “апрегуляция” по сравнению с WT-штаммом составляла 10–12 раз, а у HY-штамма по сравнению с WT штаммом − 25–30 раз (рис. 1г). Уровень экспрессии lovB в штамме E6 занимал промежуточное значение между WT и HY штаммами; подобное соотношение ранее наблюдали для биосинтетических генов lovС, lovD, lovF (рис. 1д, 1е, 1ж) и гена регулятора lovE при сравнении их экспрессии в штаммах A. terreus WT, HP и E6 [14].

Уровень экспрессии гена lovG, кодирующего тиоэстеразу, необходимую для высвобождения дигидромонаколина L из комплекса с LovB [24], в штамме E6 оказался ниже на 15–20%, чем в исходном штамме WT. Отметим, что при этом уровни мРНК других биосинтетических генов (lovA, lovB, lovС, lovD, lovF), в штамме E6 занимают промежуточное положение между WT штаммом и HY штаммом. Однако наблюдаемое падение lovG в штамме E6 было незначительным, существенно отличалось от поведения генов lovR и lovT, уровень экспрессии которых падал в несколько раз по сравнению с WT (рис. 1а, 1б, 1з).

Уровни экспрессии регуляторных генов биосинтеза LOV у A. terreus WT, HY и E6. Для объяснения феномена угнетающей регуляции генов lovR и lovT у A. terreus E6 был проведен сравнительный анализ уровней экспрессии генов-регуляторов среди изучаемых штаммов. На первом этапе провели поиск потенциальных сайтов связывания фактора LovE в промоторах lov-генов. LovE – это GAL4-подобный транскрипционный фактор, способный распознавать участки сайт-специфического связывания с консенсусной последовательностью CGGN_(10–12)CCG [10, 19]. В результате проведенного компьютерного анализа обнаружены гипотетические сайты связывания для LovE в промоторных областях ряда lov-генов (рис. 2а). Такие сайты были обнаружены в областях двунаправленных промоторов генов lovA/lovB и lovG/lovC, а также, в промоторных зонах генов lovD и lovF. Для генов транспорта lovT, устойчивости lovR и самого регулятора lovE потенциальных сайтов связывания обнаружено не было.

Рис. 2.

Контроль экспрессии lov-генов у A. terreus. а – кластер lov-генов; стрелками показаны предполагаемые сайты связывания для LovE. Экспрессия генов регуляторов биосинтеза LOV: lovE (б) и laeA (в) после культивирования в течение 8 сут на среде ФАТ штаммов A. terreus WT (1), E6 (2) и HY (3).

Уровень экспрессии lovE последовательно возрастал в ряду штаммов A. terreus WT, E6 и HY (рис. 2б), что соответствовало тенденции для биосинтетических lov-генов (их уровень экспрессии возрастал при повышении в штамме продукции LOV) и полностью согласовывалось с данными предыдущих экспериментов [14]. Уровень экспрессии laeA, глобального регулятора ВМ грибов, у HY-штамма был выше в 5–10 раз по сравнению со штаммом WT, однако у штамма E6 он падал в 3–5 раз по сравнению с WT штаммом (рис. 2в). Подобное снижение уровня экспрессии гена положительного регулятора биосинтеза LOV на фоне значительного роста продукции этого ВМ у штамма Е6 оказалось неожиданным. Для объяснения этих результатов вместе с данными о дифференциальной экспрессии lov-генов у A. terreus Е6 была предложена модель регуляции биосинтеза LOV у штаммов A. terreus (рис. 3), основанная на взаимодействии двух основных регуляторов – LovE и LaeA. Согласно этой модели, LaeA апрегулирует все гены кластера, тогда как LovE апрегулирует большинство биосинтетических генов, но не гены, связанные с транспортом и устойчивостью (рис. 3а). Наряду с прочими lov-генами, LaeA также апрегулирует ген lovE, тогда как LovE является негативным регулятором для экспрессии laeA (рис. 3б–3г). Подобная отрицательная обратная связь между транскрипционным фактором AflR, регулирующим экспрессию генов биосинтеза стеригмацистина и laeA была выявлена ранее [13]. Из экспериментов следует, что баланс между LaeA и LovE у штамма WT может поддерживаться за счет их перекрестного регулирования (рис. 3б), что, в свою очередь, контролирует продукцию LOV, не позволяя апрегулировать lov-гены и значительно увеличивать выход этого ВМ у природного штамма.

Рис. 3.

Регуляция lov-генов у A. terreus. а – положительная регуляция кластера lov-генов LovE и LaeA. Стрелками отмечены гены-мишени апрегуляции, пунктирными стрелками показаны возможные гены-мишени для регуляции LovE. Маленькие стрелки − предполагаемые сайты связывания для LovE в локусе lov-генов. б – г – регуляция биосинтеза LOV белками LaeA, LovE и LovE^cn (полученный в результате конститутивной экспрессии lovE) у штаммов A. terreus WT (б), HY (в) и E6 (г).

Селекция HY штамма, по-видимому, сопровождалась выходом laeA из-под регуляции LovE, в результате значительно повысился уровень экспрессии обоих положительных регуляторов, что, в свою очередь, привело к апрегуляции всех lov-генов и увеличению биосинтеза LOV более, чем в 100 раз (рис. 3в).

Экспрессия дополнительной копии lovE у штамма E6, по всей видимости, оказалась laeA-независимой и происходила за пределами lov-кластера. В результате между уровнями экспрессии laeA и lovE нарушился баланс, возникающий при их взаимной регуляции (рис. 3г). Уровень lovE вырос, а laeA снизился по сравнению с исходным штаммом (рис. 2). В результате экспрессия lov-генов, положительно регулируемых белками LovE и LaeA, увеличилась, а lov-генов, контролируемых только LaeA – снизилась (рис. 2). Поскольку LovE контролирует биосинтетические lov-гены, уровень продукции LOV значительно повысился. Наряду с этим резкое снижение экспрессии гена lovR могло привести к потенциальной токсичности продукции LOV для данного штамма. В общем ряду увеличения экспрессии биосинтетических генов у штамма E6 (по сравнению с WT) несколько выпадает поведение гена lovG, уровень экспрессии которого оказался несколько снижен (рис. 1е). Возможно, это связано, с менее эффективной активацией lovG путь-специфическим регулятором LovE. Поскольку для штамма E6 наблюдалось значительное увеличение продукции LOV, тиоэстераза LovG, по-видимому, не являлась лимитирующим ферментом в пути биосинтеза этого поликетида.

Влияние ПА на продукцию LOV и уровень биомассы при ферментации A. terreus E6. У A. terreus E6 наряду с 10-кратным увеличением продукции LOV была снижена экспрессия гена положительного регулятора laeA. Экзогенные ПА способны повышать экспрессию laeA у высокоактивных грибных продуцентов [25, 26], в том числе, у A. terreus [15]. Повышенная экспрессия laeA у A. terreus коррелировала с увеличением выхода LOV (8 сут, 26°С), поэтому в дальнейшем проводили ферментацию трех исследуемых штаммов с добавлением ПА.

Предполагали, что такой прием увеличит продукцию LOV, однако добавление 5 мМ ДАП или 5 мМ СП при ферментации A. terreus E6 приводило к значительному снижению выхода LOV на протяжении всего периода культивирования. Наиболее значительные отличия для штаммов WT, HY E6 наблюдали после 8 сут ферментации на среде ФАТ с добавлением ПА (рис. 4). Добавление ДАП увеличивало выход LOV у штамма WT на 15%, у штамма HY – на 30% и снижало выход LOV у штамма E6 на 50%. Добавление СП сопровождалось еще большими различиями: выход LOV увеличивался у штамма WT на 20%, у штамма HY – на 45% и снижался у штамма E6 более, чем в 2 раза (рис. 4а).

Рис. 4.

Продукция LOV (мкг/мл, а), накопление биомассы (мг/мл, б) и удельная продукция LOV (мкг/мг биомассы, в) при ферментации штаммов A. terreus WT (1, контроль), E6 (2) и HY (3) с ДАП (5.0 мМ, II) и СП (5.0 мМ, III) 8 сут на среде ФАТ. На врезках − продукция и удельная продукция LOV для A. terreus WT (а, в, 1) (цена деления оси ординат увеличена в 400 раз и в 500 раз соответственно).

Уровень сухой биомассы при культивировании на среде ФАТ без добавок практически не отличался у штаммов WT и E6 (рис. 4б). Это может свидетельствовать о том, что как апрегуляция lovE, так и даунрегуляция laeA, lovR и lovT не ингибируют рост для клеток штамма E6. Более низкий уровень биомассы у штамма HY типичен для высокоактивных грибных продуцентов, полученных в результате многораундового мутагенеза и селекции, что наблюдали и ранее на примере высокоактивного продуцента цефалоспорина С Acremonium chrysogenum RNCM F-4081D [22, 27, 28]. При добавлении ПА выявили разностные воздействия этих соединений на рост или биомассу штаммов (рис. 4б). Биомасса WT-штамма несколько возрастала (на 3–5%) при добавлении как ДАП, так и СП (рис. 4б, 2), что может отражать описанный ранее стимулирующий эффект ПА [29]. Для штаммов с повышенной продукцией LOV наблюдали снижение биомассы при добавлении ПА в ходе ферментации, как 5.0 мМ ДАП, так и 5.0 мМ СП. Для штамма HY это снижение составляло 10–12% при добавлении ДАП или 15–7% при добавлении СП. Для штамма E6 токсическое воздействие было выражено сильнее, уровень биомассы падал на 18–20% при добавлении ДАП и 20–25% при добавлении СП. Такое снижение биомассы было описано ранее для высокоактивного продуцента пенициллина G Penicillium chrysogenum; внесение в среду при выращивании 5.0 мМ ДАП приводило к 20–25%-ному падению биомассы [25].

Условия эксперимента были подобраны ранее для штамма HY [15], при этом стимулирующие действие ПА на продукцию LOV у этого штамма значительно превышало побочное токсичное воздействие. Удельный выход LOV после 8 сут ферментации с ПА увеличивался на 40–50% при добавлении ДАП и на 60–70% при добавлении СП (рис. 4в, 3). В этих же условиях у штамма E6 уменьшение биомассы, сопровождалось резким падением LOV, в результате удельный выход LOV уменьшался на 20–30% при добавлении ДАП и на 75–85% при добавлении СП (рис. 4в, 2).

Воздействие экзогенных ПА при культивировании штамма E6 в жидкой среде ФАТ также отличалось от ранее полученных данных при его культивировании на агаризованной среде ЧД. При добавлении ПА наибольшую стимуляцию роста для всех изучаемых штаммов (WT, HY и E6) наблюдали при концентрации 5 мМ (как ДАП, так и СП) [15]. Этот эффект коррелировал с повышением продукции LOV в процессе ферментации в глубинных условиях с 5 мМ ПА как для штамма WT, так и для HY. В данной работе показали, что для E6 штамма добавление ПА, стимулирующих рост на агаризованной среде, снижает уровень биомассы и значительно уменьшает продукцию LOV при ферментации в глубинных условиях.

Анализ уровней экспрессии генов кластера биосинтеза LOV и регулятора laeA у A. terreus E6 при внесении ПА в процессе ферментации. Сравнительный анализ уровней экспрессии lov-генов и laeA после ферментации штамма Е6 с 5.0 мМ СП (рис. 5) выявили угнетение регуляции многих генов биосинтеза, уровень экспрессии lovA, lovB, lovD и lovG падал 2–5 раз (рис. 5 II). С другой стороны, для экспрессии генов lovC и lovF наблюдали рост, не превышающий 20–30%. Уровень экспрессии генов устойчивости и транспорта падал в 2–3 раза. При этом практически не менялась экспрессия генов регуляторов lovE и laeA. Одно из объяснений полученных данных может быть связано с конститутивной, laeA-независимой экспрессией дополнительной копии lovE у штамма E6. Основной вклад в уровень экспрессии lovE у данного штамма вносит дополнительная копия, находящая под контролем gpdA-промотора, уровень экспрессии lovE у штамма E6 повышен более чем в 3 раза (рис. 2б) и не зависит от эффектов экзогенных ПА. С другой стороны, добавление ПА стимулирует экспрессию laeA у WT и HY штаммов, но не у E6 (рис. 5, 10). По-видимому, в штамме E6 на экспрессию laeA оказывают влияние два противоположных фактора: положительная регуляция со стороны ПА и негативная регуляция со стороны конститутивно-экспрессируемого Zn₂Cys_{6 −} фактора транскрипции LovE (рис. 3г). При этом уровень laeA не увеличивался, как и lovE. Отсутствие апрегуляции обоих положительных регуляторов на фоне токсичной для клетки концентрации ПА приводит к снижению продукции LOV, что может быть опосредовано и другими механизмами контроля биосинтеза ВМ грибов [30].

Рис. 5.

Относительная экспрессия [(A. terreus + СП)/A. terreus] генов кластера биосинтеза LOV lovA (1), lovB (2), lovC (3), lovD (4), lovF (5), lovG (6), lovR (7), lovT (8), lovE (9) и регулятора laeA (10) в штаммах A. terreus (I – WT, II – E6, III – HY) после 8 сут ферментации c 5.0 мМ СП. Пунктирная линия − уровень экспрессии генов при ферментации штаммов без добавления СП.

Токсичность ПА для штамма Е6, внутриклеточные уровни ацетил-КоА и экспрессия lov-генов. ПА – жизненно-важные соединения для всех клеток, необходимые для нормального функционирования множества клеточных процессов [31]. Внутриклеточное содержание ПА строго регулируется на уровнях биосинтеза и катаболизма этих соединений [32]. При избытке ПА их баланс восстанавливается за счет активации путей катаболизма и экспорта, с участием, в частности, таких ферментов как спермидин N-ацетил трансфераза (SSAT), различных полиаминоксидаз (PAO) и специфических мембранных транспортеров [33]. Реакционноспособные соединения, такие как акролеин и перекись водорода, образуемые в процессе катаболизма ПА, могут оказывать существенное токсическое воздействие на клетки, повреждая белки, ДНК, другие клеточные компоненты [34]. ПА в используемых концентрациях (5.0 мМ) не токсичны для штамма WT, однако их эффект становится значимым на фоне резко увеличенного биосинтеза LOV у штамма A. terreus E6. При этом также заметно падает уровень экспрессии lov-генов и продукция LOV. Повышенная чувствительность штамма A. terreus E6 к экзогенным ПА может возникать вследствие истощения внутриклеточного содержания ацетил-КоА, который расходуется на биосинтез LOV. Эти эффекты могут проявляться на поздних стадиях ферментации, когда резко возрастает продукция LOV и, напротив, не проявляться в условиях роста на твердой среде. Истощение пула ацетил-КоА снижает эффективность катаболизма ПА [35] и может проводить к его избыточному внутриклеточному накоплению, токсичному для клетки [34]. Истощение пула ацетил-КоА под воздействием экзогенных ПА также может негативно отражаться на транскрипции lov-генов вследствие снижения уровня ацетилирования гистонов и повышения степени компактизации хроматина [36]. У A. terreus HY внутриклеточное содержание ацетил-КоА должно быть достаточно высоким для обеспечения концентрации субстратов (ацетил-КоА, малонил-КоА), необходимой для повышенной продукции LOV. В связи с этим, токсические эффекты ПА для штамма менее значимы и не приводят к снижению экспрессии lov-генов. Для проверки этих предположений требуются дополнительные эксперименты, в том числе, по определению внутриклеточных уровней ПА, ацетил-КоА, а также, уровней экспрессии генов метаболизма ПА у изучаемых штаммов A. terreus.

В работе на подобранной системе было продемонстрировано, что LovE, всесторонне-изученный Zn₂Cys₆ фактор транскрипции, являющийся путь-специфическим регулятором биосинтеза LOV у A. terreus, способен в определенных условиях негативно регулировать LaeA. Эти данные важны для понимания молекулярных основ регуляции ВМ у грибных продуцентов, что является необходимой базой для конструирования штаммов-суперпродуцентов биотехнологически-значимых соединений.

Рис. 6.

Влияние экзогенного СП на продукцию LOV в штаммах A. terreus E6 и HY после 8 сут ферментации.

Авторы выражают благодарность В.Г. Джавахия, Т.М. Войновой (Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии), В.В. Джавахия (ФИЦ Биотехнологии РАН) за предоставленный для изучения молекулярно-биологических свойств штамм А. terreus HY, М.А. Думиной (ФИЦ Биотехнологии РАН) и Н.А. Вытновой (кафедра биотехнологии Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова) за получение штамма Е6.

Работа выполнена при частичной поддержке гранта РФФИ 19-04-01173.