Прикладная биохимия и микробиология, 2019, T. 55, № 6, стр. 553-558

МЕТОДИКА.

Экспрессия целевого слитого белка в E. coli Аминокислотная последовательность белка на основе GroEL из Thermus thermophilus с введенной последовательностью пептида полифемузина-1 (SwissProt P14215.1), представлена на рис. 1 в виде выравнивания с диким типом GroEL.

Рис. 1.

Выравнивание последовательности целевого белка относительно дикого типа шаперона.

Ген целевого белка был химически синтезирован, секвенирован (“GenScript”, США) и клонирован в бицистронную плазмиду pETDuet™-1 (“Merck”, Германия) совместно с синтетическим геном GroES T. thermophilus. Gene ID:3168828 (“GenScript”, США) экспрессировали в штамме BL21(DE3) pLysE Escherichia coli (“ThermoFisher”, США).

Культивирование штамма Escherichia coli BL21(DE3) проводили согласно рекомендациям производителя в среде LB (250 мл) в конических стеклянных колбах объемом 1 л при 37°С и интенсивном перемешивании на шейкере-инкубаторе ES-20/60 (“Bio-San”, Латвия). В среду добавляли ампициллин, в концентрации рекомендованной производителем плазмиды. Для индукции белкового синтеза в питательную среду вносили ИПТГ в конечной концентрации 0.4 мМ после достижения оптической плотности 0.5 при длине волны 600 нм. Через 3 ч после начала индукции клетки отделяли центрифугированием при 4000 g в течение 17 мин при 4°С.

Лизис клеток E. coli экспрессионного штамма. Буфер для лизиса клеток имел следующий состав: PBS, (“Amresco”, США); 1 мM AEBSF. Лизис проводили в ледяной бане, разрушенные клетки ресуспендировали в буфере для лизиса (“AppliChem”, Германия) в соотношении 1 : 8 – масса кл. : масса буфера, обрабатывали ультразвуком 10 с при амплитуде 5 мкм с интервалом 60 с 6 раз в Soniprep 150 (“MSE”, Великобритания). Полученный гомогенат центрифугировали при 16 000 g 40 мин при 4°С.

Предварительная очистка лизата. Полученный супернатант разбавляли в 20 раз буфером для лизиса, прогревали на водяной бане в стеклянном стакане при температуре 62°С в течение 7 мин при интенсивном перемешивании. Затем стакан переносили в ледяную баню и продолжали перемешивание для охлаждения до 5°С. Полученный раствор центрифугировали при 16 000 g 40 мин при 4°С.

Очистка целевого белка GroEL из Thermus thermophilus с введенной последовательностью пептида полифемузина-1. К полученному в ходе предварительной очистки лизата супернатанту добавляли сухую мочевину (“Amresco”, США) до 6 М концентрации и 0.1%-ную трифторуксусную кислоту (ТФУ) для ВЭЖХ (“Merck”, Германия). полученный раствор фильтровали через мембранный фильтр Millex PVDF с размером пор 0.45 мкм (“Merck Millipore”, США). Колонку размером 150 × 4.6 мм с носителем Nucleosil C4 5 мкм, 300 Å (“Macherey-Nagel”, Германия) уравновешивали 6 М раствором мочевины с 0.1%-ным ТФУ и наносили образец. Колонку промывали от мочевины 0.1%-ным раствором ТФУ в 5%-ном растворе ацетонитрила для ВЭЖХ (“Panreac”, Испания) и проводили элюцию градиентом концентрации ацетонитрила с 0.1%-ной ТФУ до 95%-ного содержания ацетонитрила. Полученные фракции лиофилизовали, растворяли в 4-кратном буфере для нанесения образцов для электрофореза и проводили электрофорез белков по Лэммли. Гель окрашивали кумасси R250 (“Amresco”, США) по стандартному протоколу (рис. 2). Использовали маркеры молекулярной массы Unstained Protein MW Marker (“Thermo Fisher Scientific”, США).

Рис. 2.

Электрофорез очищенного GroEL из Thermus thermophilus с введенной последовательностью пептида полифемузина-1. 1 – очищенный белок, 2 – стандарты молекулярной массы: 14, 18, 25, 35, 45, 67 и 116 кДа.

Триптический гидролиз белка в полиакриламидном геле. Триптический гидролиз белка в ПАГ с ДДС-Na, окрашенного кумаси R250, проводили следующим образом: кусочек геля размером 3–4 мм³ дважды промывали для удаления красителя 100 мкл 40%-ного раствора ацетонитрила в 0.1 М NH₄HCO₃ в течение 20 мин при 37°С. После удаления раствора, для дегидратации геля добавляли 100 мкл ацетонитрила. После удаления ацетонитрила и высушивания геля добавляли 3.5 мкл раствора модифицированного трипсина (“Promega”, США) в 0.05 М NH₄HCO₃ с концентрацией 15 мкг/мл. Гидролиз проводили в течение 3 ч при 37°С, затем к раствору добавляли 5.25 мкл 0.5%-ной ТФУ в 50%-ном растворе водного ацетонитрила и тщательно перемешивали. Раствор (супернатант) использовали для получения MALDI-масс-спектров.

Подготовка образцов для масс-спектрометрии. Для подготовки образцов на мишени смешивали по 1.5 мкл раствора супернатанта, полученного при триптическом гидролизе, и 0.5 мкл раствора 2,5-дигидроксибензойной кислоты (“Aldrich”, США) 10 мг/мл в 20%-ном водном ацетонитриле, 0.5% ТФУ. Смесь высушивали на воздухе.

MALDI-TOF/TOF-масс-спектрометрия. Масс-спектры образцов получали на MALDI-времяпролетно-времяпролетном масс-спектрометре Ultraflextreme (“Bruker”, Германия), оснащенном УФ лазером (Nd) в режиме положительных ионов с использованием рефлектрона. Точность измеренных моноизотопных масс после докалибровки по пикам автолиза трипсина составила 0.005% (50 ррм). Спектры получали в диапазоне масс 500–6500 m/z, выбирая мощность лазера оптимальную для достижения наилучшего разрешения. Для получения спектров фрагментации использовали тандемный режим прибора, погрешность измерения фрагментных ионов была не более 2.0 Да.

Идентификация белков. Белки идентифицировали при помощи программы Mascot (www.matrixscience.com). Масс-спектры были обработаны с помощью программного пакета FlexAnalysis 3.3 (“Bruker Daltonics”, Германия). При помощи программы Mascot (опция “пептидный фингерпринт”) проводили поиск в локальной базе данных и базе данных NCBI среди белков всех организмов с указанной выше точностью, с учетом возможного окисления метионинов кислородом воздуха, возможной модификации цистеинов акриламидом геля, аминоэтилбензолсульфонилирования тирозина и лизина. Кандидатные белки, имеющие параметр достоверности score >41 в локальной базе данных считали определенными надежно (p < 0.05). Также были получены спектры фрагментации отдельных пептидов. С использованием программного обеспечения Biotools 3.2 (“Bruker Daltonics”, Германия) проведен поиск по объединенным MS + + MS/MS результатам. По полученным спектрам фрагментации были построены предполагаемые аминокислотные последовательности.

Отбор пептидов для включения в расчет корреляции. Было проведено 6 экспериментов протеолиза из геля, результатом каждого являлся MS + MS/MS спектр и отчет о поиске в базе данных. Для дальнейшей работы были отобраны пептиды, соответствующие последовательности целевого белка и отмеченные в отчете Mascot, как максимально правдоподобные. Набор пептидов с данными о наличии модификации был выровнен относительно последовательности целевого белка, в которую были внесены отметки о количестве модифицированных (1) и интактных (0) пептидов, соответствующих каждой модифицируемой аминокислоте.

Расчет площади поверхности, доступной для растворителя. Файл, содержащий структуру GroEL T. thermophilus был загружен из Protein Data Bank по идентификатору 4V4O [8]. Для расчета использовали цепь A и стандартный скрипт (https://pymolwiki.org/index.php/Get_Area).

Расчет корреляции площади поверхности аминокислотного остатка, доступной для растворителя и вероятности его модификации. Для расчета использовали два подхода. При первом подходе рассчитывали процент модификации каждого аминокислотного остатка тирозина и лизина, затем процент модификации и соответствующая ему площадь поверхности были переданы на вход функции statsmodels.stats.weightstats.DescrStatsW.corrcoef статистического программного модуля Statmodels 0.10.0 для Python (https://www.statsmodels.org/dev/generated/statsmodels.stats.weightstats.DescrStatsW.corrcoef. html) Дополнительно были переданы количества обнаруженных пептидов для каждой аминокислоты в качестве фактора значимости. Расчет проводился для лизина и тирозина вместе и по отдельности.

Второй подход состоял в использовании функции scipy.stats.pointbiserialr программного модуля Scipy 1.3.0 для Python [9]. В этом случае на вход функции передавался случай успеха (1) или неудачи (0) модификации и соответствующая ему доступная для растворителя поверхность аминокислоты.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В работе использовали ингибитор сериновых протеиназ AEBSF, как растворимую и стабильную альтернативу другому ингибитору PMSF, добавляя 1 мМ в буфер для лизиса на основе PBS. Нагревание является стандартным этапом предварительной очистки многих белков, тем не менее, при подтверждении подлинности полученных белков методом MALDI-TOF-TOF ранее не были обнаружены модификации AEBSF (данные не представлены).

Уровень экспрессии целевого белка на основе GroEL из Thermus thermophilus с введенной последовательностью пептида полифемузина-1 согласно данным денситометрии геля ПАГ с Na ДДС составлял 150–200 мг/л среды.

В работе было использовали пятиминутное прогревание, что могло значительно ускорить модификацию, однако стандартной рекомендацией производителей является использование ингибиторов протеаз (“The Complete Guide for Protease Inhibition”, “Roche”) на протяжении всего процесса выделения и очистки, что, в случае длительных процедур очистки, может быть сопоставимым по воздействию на белок процедуры прогрева. Полученные в ходе работ по подтверждению подлинности масс-спектры (рис. 3) показали высокий уровень модификации целевого белка по лизину – 13.5% и тирозину – 38.3%. На точность определения степени модификации могла повлиять разница в ионизируемости модифицированных и немодифицированных пептидов.

Рис. 3.

Масс-спектр продуктов трипсинолиза белка. Нецелевые пептиды отмечены черной точкой, модифицированные пептиды отмечены символом модифицированной аминокислоты.

При подсчете доступной для растворителя поверхности [10] был получен профиль для всей молекулы (рис. 4). После выравнивания, подсчета модификаций и расчета корреляции первым методом было обнаружено, что корреляция модификаций лизина составляла 0.03 (отсутствие связи с доступной для растворителя поверхностью аминокислоты), модификаций тирозина 0.7 (значительный уровень корреляции). При использовании первой методологии расчетов было трудно определить статистическую значимость полученных результатов. Именно по этой причине была найдена и использована вторая методология.

Рис. 4.

Диаграмма площади поверхности аминокислотных остатков белка GroEL, доступной для растворителя.

Результаты второй методологии расчетов – отсутствие связи для лизина и низкий уровень корреляции – 0.25 – для тирозина. Тем не менее, статистическая значимость p = 0.049 позволяла предположить высокую вероятность наличия такой зависимости.

На рис. 5 показаны остатки тирозина, имеющие различную доступность для растворителя. Полученные данные позволяют утверждать, что доступность для растворителя не влияла на вероятность модификации аминокислотного остатка. Разница в результатах для лизина и тирозина может быть обусловлена наличием заряда или подвижностью боковой цепи аминокислотного остатка лизина.

Рис. 5.

Поверхность белка GroEL доступная для растворителя с отмеченными аминокислотными остатками тирозина: 1 – 202 (100% модифицировано), 2 – 198 (17%), 3 – 359 (47%).

Работа была выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, уникальный идентификатор проекта RFMEFI57517X0151