1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Прикладная биохимия и микробиология
  4. T. 55, № 6, 2019

Прикладная биохимия и микробиология, 2019, T. 55, № 6, стр. 559-565

Биосинтез альгината и поли(3-оксибутирата) бактериальным штаммом Azotobacter agile 12

А. А. Дудун 1, *, Е. А. Акулина 1, 2, В. В. Воинова 2, Т. К. Махина 1, В. Л. Мышкина 1, В. А. Жуйков 1, А. П. Бонарцев 1, 2, Г. А. Бонарцева 1

1 Институт биохимии им. А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр “Фундаментальные основы биотехнологии” Российской академии наук
119071 Москва, Россия

2 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет
119234 Москва, Россия

* E-mail: dudunandrey@mail.ru

Поступила в редакцию 28.03.2019
После доработки 31.05.2019
Принята к публикации 20.06.2019

Полный текст (PDF)

Аннотация

В работе исследована способность бактерии Azotobacter agile 12 к биосинтезу полимеров: альгината (АЛГ) и поли(3-оксибутирата) (ПОБ), изучены их физико-химические свойства. Показано, что в условиях высокого уровня аэрации, штамм A. agile 12 синтезирует оба полимера одновременно, причем АЛГ в большем количестве по сравнению с ПОБ. Методом ИК-спектроскопии показано преобладание в полимерной цепи АЛГ маннуроновых кислот над гулуроновыми (M/G = 70/30) и наличие ацетильных групп в маннуроновых остатках. ПОБ при анализе методом ИК-спектроскопии имел полосу поглощения в области 1760 см–1. Методом ЯМР подтверждено, что ПОБ является гомополимером, состоящим из звеньев 3-гидроксимасляной кислоты. Термогравиметрический анализ (ТГА) показал, что АЛГ имел три стадии разложения – дегидратация, первое и второе разложение. В отличие от АЛГ, ПОБ имел только одну стадию разложения с предварительной очень малой потерей массы (1.25%) при дегидратации. Тест на водопоглощение показал, что бактериальный АЛГ обладает большей водопоглощающей способностью по сравнению с АЛГ из водорослей, тогда как ПОБ является гидрофобным полимером. Таким образом, синтезированные одновременно бактериальным штаммом A. agile 12 полимеры ПОБ и АЛГ различались по физико-химическим свойствам: ПОБ – гидрофобный, термопластичный, механически устойчивый полимер, АЛГ – гидрофильный, формирующий гидрогели, эластичный, термически и механически неустойчивый полимер.

Ключевые слова: биополимеры, биосинтез, альгинат, поли(3-оксибутират), ацетилирование

Альгинат (АЛГ) и поли(3-гидроксибутират) (ПОБ) – два основных полимера, продуцируемые бактериями рода Azotobacter. Эти полимеры могут быть использованы в различных областях биотехнологии, экспериментальной биологии и медицины [1]. Альгинат представляет собой линейный неразветвленный полисахарид, который состоит из двух мономеров – маннуроновой (М) и гулуроновой (G) кислот. Соотношение этих уроновых кислот и числа ацетильных групп в остатках маннуроновой кислоты влияет на гелирующие свойства полимера [2]. Биосинтез альгината Azotobacter, способствует сохранению жизнеспособности при высушивании, а также обеспечивает защиту от токсичного действия тяжелых металлов и диффузии кислорода, ингибирующего активность нитрогеназы [3]. ПОБ – полиэфир 3-гидроксимасляной кислоты семейства полиоксиалканоатов (ПОА), внутриклеточное запасное вещество, источник энергии и углерода для продуцента [4, 5]. Основным преимуществом биосинтеза биополимеров бактериями рода Azotobacter является возможность, изменяя условия выращивания, получать полимеры с заданными свойствами, различной молекулярной массой (ММ) для ПОБ и различным содержанием мономеров (соотношение гулуроновых к маннуроновым кислотам) и степенью ацетилирования для АЛГ [6, 7]. Полученные при биосинтезе полимеры с заданными свойствами могут быть использованы для культивирования различных культур тканей в биотехнологии, а также в модельных системах для экспериментальной биологии при разработке различных медицинских изделий и лекарственных форм [8].

В работе Хименеса с соавт. [9] было показано, что различный синтез АЛГ или ПОБ связан с определенными условиями культивирования бактерий. В работе других исследователей установлено, что при культивировании A. vinelandii с высоким уровнем аэрации увеличивался синтез АЛГ и ингибировался синтез ПОБ [10].

Некоторые виды бактерии рода Azotobacter являются уникальными организмами, которые могут активно синтезировать оба полимера одновременно, например A. agile 12.

Цель работы – исследование способности бактерий A. agile 12 к одновременному синтезу АЛГ и ПОБ, а также изучение физико-химических свойств выделенных биополимеров.

МЕТОДИКА

Материалы. В работе использовали следующие реагенты: ЭДТА, NaOH, компоненты культуральной среды: K2HPO4 · 3H2O, MgSO4 · 7H2O, N-aCl, Na2MoO4 · 2H2O, CaCO3, FeSO4 · 7H2O, цитрат натрия, CaCl2, KH2PO4, сахароза, агар, натрий-фосфатный физиологический раствор (PBS), альгинат натрия из бурых водорослей. Все реагенты были приобретены в фирме “Sigma Aldrich” (Германия).

Объект исследования. Работу проводили со штаммом A. agile 12, выделенным из дерново-подзолистых почв Московской области (Россия) и любезно предоставленным сотрудниками кафедры микробиологии РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева. A. agile 12 поддерживается в лаборатории биохимии азотфиксации и метаболизма азота Института биохимии им. А.Н. Баха ФИЦ Биотехнологии РАН [11].

Бактерии представляет собой клетки продолговатой формы, грамотрицательные, строгие аэробы, подвижные, образующие слизистые колонии темно-оранжевого цвета.

Условия культивирования A. agile 12. A. agile 12 выращивали на модифицированной жидкой среде Берка с сахарозой – 30 г/л, KH2PO4 – 0.008 г/л и K2HPO4 – 0.032 г/л в качалочных колбах объемом 800 мл с содержанием 100 мл среды в течение 48 ч при 250 об./мин, 28°С, pH среды – 7.2 [11, 12].

Выделение и очистка АЛГ и ПОБ из культуральный среды и клеточной биомассы. Биомассу после окончания выращивания отделяли центрифугированием при 11 000 g в течение 30 мин. Супернатант смешивали с 3 об. охлажденного до –20°С этанола; полученный осадок АЛГ собирали и высушивали методом лиофилизации (лиофильная сушка Martin Christ Alpha 1–2 LD plus, Германия). Для очистки АЛГ высушенный осадок полимера растворяли в 45 мл 1 М NaCl с 5 мл 100 мМ ЭДТА и инкубировали в течение 1 ч при 60°С с перемешиванием на орбитальном шейкере (PSU-20i, “Biosan”, Латвия) для полной гомогенизации раствора. Осадок отделяли центрифугированием при 11 000 g в течение 30 мин. К супернатанту добавляли 3 об. охлажденного этанола, осадок собирали и лиофильно высушивали. На конечной стадии сухой осадок растворяли в 1 М NaCl, раствор диализовали против 1 л 0.1 М NaCl в течение 30 ч. Для получения АЛГ диализованный раствор снова осаждали 3 об. ледяного этанола и лиофилизировали.

Выделение ПОБ из клеточной биомассы осуществляли экстракцией хлороформом в течение 12 ч при 37°С. Полученный экстракт отделяли от клеточных остатков фильтрацией, затем ПОБ выделяли из хлороформного экстракта осаждением изопропиловым спиртом. Стадию растворения в хлороформе и осаждения ПОБ изопропиловым спиртом повторяли не менее 3 раз. ПОБ сушили при 60°С.

Качественная реакция на определение АЛГ. Качественное определение АЛГ в культуральной среде выполняли, как описано в работе [13]. Для определения 10 мл 10%-ного раствора CaCl2 добавляли к 1 мл культуральной среды. Реакция сопровождалась образованием нерастворимых в воде хлопьевидных частиц альгината кальция.

Определение ММ АЛГ и ПОБ. ММ биополимеров определяли методом вискозиметрии. Удельную вязкость рассчитывали по формуле:

${{\eta }_{{{\text{sp}}}}} = {{(t--{{t}_{0}})} \mathord{\left/ {\vphantom {{(t--{{t}_{0}})} {{{t}_{0}}}}} \right. \kern-0em} {{{t}_{0}}}},$
где t0 – время истечения растворителя, а t – время истечения раствора полимера. ММ рассчитывали по уравнению Марка–Хоувинка: [η] = K(M)a с коэффициентами для АЛГ [14, 15]:

$K = 7.3 \times {{10}^{{--5}}};\,\,\,\,a = 0.92;$
$\left[ \eta \right] = 7.3{\text{ }} \times {{10}^{{--5}}} \times {{({\text{M}})}^{{0.92}}}.$

Для ПОБ:

$K = 7.7{\text{ }} \times {\text{ }}{{10}^{{--5}}};\,\,\,\,a = {\text{ }}0.82;$
$\left[ \eta \right] = 7.7 \times {{10}^{{--5}}} \times {{({\text{M}})}^{{0.82}}},$
где М – молекулярная масса, [η] – вязкость, K и а – константы, величина которых зависит от природы полимера (АЛГ и ПОБ).

ИК-спектроскопия. ИК-спектры биополимеров регистрировали в режиме отражения в ИК-микроскопе Hyperion-2000, связанном с ИК-спектрометром IFS-66 v/s FTIR (Gecrystal, разрешение 2 см – 1, диапазон 4000–600 см – 1, сканирование – 50, “Bruker”, США). Для сравнения этот метод был также применен для исследования коммерческого образца АЛГ, выделенного из водорослей (“Sigma-Аldrich”, Германия).

1H-ЯМР анализ ПОБ. Протонные (1Н) ЯМР-спектры растворов ПОБ в дейтерированном хлороформе регистрировали на спектрометре MSL-300 (“Bruker”, Германия) при рабочей частоте 400 МГц. Химические сдвиги в частях на миллион (м.д.) измеряли от 0 ч/млн к сигналу остаточных протонов хлороформа-d (CDCl3), 7.27 ч/млн. Параметры эксперимента были следующими: 1% (вес/об.) полимера в хлороформе-d, 313 К, время сбора 2.5 с и ширина спектра 4000 Гц [16].

Подготовка ПОБ пленок. Для анализа физико-химических свойств были получены полимерные пленки из ПОБ. Образцы ПОБ растворяли в хлороформе (3% вес/об.) и разливали в чистые, сухие, стерильные стеклянные чашки Петри. Толщину пленки измеряли с помощью цифрового микрометра (796XFL-1, Starrett, США). Толщина полимерных пленок составляла 50 ± 4 мкм.

Термогравиметрический анализ (ТГА). Термогравиметрические ТГА измерения АЛГ и ПОБ выполняли на термовесах (TG 209 F1, NETZSCH, Германия). Устройство было откалибровано по точкам плавления стандартных веществ. Эксперимент проводили в открытом алундовом тигле с использованием образца массой 7 мг в потоке (20 мл/мин) воздуха при температуре от 30 до 600°С со скоростью нагрева 10°С/мин. Температуры разложения были взяты на пике максимума первой производной оставшегося веса (%) по отношению к кривой температуры (°C).

Тест на водопоглощение АЛГ и ПОБ. Образцы выдерживали при температуре 50°С до постоянного значения массы (m1) в течение 2–3 дней. После этого их погружали в деионизированную воду (25°C) на 3 ч. После удаления капель воды образцы снова взвешивали. Водопоглощение АЛГ кальция и полимерных пленок ПОБ рассчитывали по уравнению:

$A = {\text{ }}{{({{m}_{2}}--{{m}_{1}})} \mathord{\left/ {\vphantom {{({{m}_{2}}--{{m}_{1}})} {{{m}_{1}}}}} \right. \kern-0em} {{{m}_{1}}}} \times 100$
где m1 и m2 – массы сухого и насыщенного водой АЛГ кальция и пленок ПОБ соответственно.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Биосинтез АЛГ и ПОБ бактериальным штаммом A. agile 12. Бактерии штамма A. agile 12 были способны продуцировать АЛГ и ПОБ одновременно. Штамм выращивали на среде, которая была подобрана ранее A. chroococcum 12B для стимулирования синтеза АЛГ [11]. Для выращивания A. agile 12 использовали ту же среду Берка с низкой концентрацией фосфатов при высоком уровне аэрации, что также способствовало преимущественному синтезу АЛГ. Выход АЛГ после 48 ч выращивания составил 0.7 г/л, ПОБ 0.38 г/л, что составило в расчете на г биомассы 0.37 и 0.20 г соответственно.

Молекулярная масса АЛГ составила ~112 кДа. Такая величина характерна для внеклеточного полимера, в отличие от входящего в состав капсул бактериальных клеток высокомолекулярного АЛГ. Молекулярная масса ПОБ в A. agile 12, напротив, была такой же высокой (1472 кДа), как и у ПОБ A. chroococcum и A. vinelandii, изученных в предыдущих работах [5, 11, 17].

ИК-спектроскопия. Бактериальный АЛГ исследовали методом ИК-спектроскопии с целью определения мономерного состава полимера и уровня ацетилирования. Полученные ИК-спектры бактериального АЛГ показаны на рис. 1, а ИК-показатели приведены в табл. 1. Спектры альгината имели полосы поглощения различной интенсивности при 1600 см–1 (СОО–), 1720 см–1 (СОСН3), 1030 см–1 (СО), 1254 см–1 (COOR), 816 см–1 (М-блоки) и 785 см–1 (G-блоки). Необходимо отметить, что на представленных ИК-спектрах АЛГ полос поглощения, характерных для компонентов бактериальных клеток, таких как белки и нуклеиновые кислоты, не обнаружено, что говорит о высокой степени чистоты полученных АЛГ.

Рис. 1.

ИК-спектр АЛГ, полученного при культивировании A. agile 12 в среде Берка (1), и АЛГ из водорослей (2) в диапазоне 2000–600 см–1.

Таблица 1.  

Состав маннуроновых и гулуроновых кислот, уровень ацетилирования бактериального АЛГ и АЛГ из водорослей, по полосам поглощения в ИК-спектрах

АЛГ образцы D1600/D1720 D1030/D1254 D816/D785 Степень ацетилирования, % M/G
Бактериальный АЛГ 8.69 2.30 2.34 11.5 70/30
Водорослевый АЛГ 90.10 – 4.10 – 80/20

Присутствие маннуроновой кислоты в полимерной цепи определялось по наличию в ИК-спектре полосы валентных колебаний пиранозного кольца маннуроновой кислоты (М) – 816 см–1; присутствие гулуроновой кислоты (G) подтверждали полосы поглощения при 785 см–1 [18]. Относительные интенсивности этих полос и их процентные соотношения показаны в табл. 1.

Уровень ацетилирования определяли по соотношению полос 1600 к 1720 см–1. Известно, что полосы 1030 и 1254 см–1 также показывают сигналы полос поглощения ацетильных групп [13].

Таким образом, ИК-анализ показал соотношение M/G – 70/30, а уровень ацетилирования – 11.5% (табл. 1). Сравнение спектров показало присутствие полос при 1720 и 1254 см–1 у АЛГ бактерий, которые отсутствовали у АЛГ из водорослей, а также увеличение поглощения при 1030 см–1 только в бактериальном АЛГ. Полученные результаты указывают на наличие ацетильных групп на маннуроновых остатках бактериального АЛГ.

Наличие ацетильных групп и большее количество гулуроновых остатков, которые могут селективно связывать ионы Ca2+, позволяют получать более плотные гидрогели, что делает бактериальный АЛГ более перспективным биоматериалом для медицины и биотехнологии по сравнению с АЛГ водорослей [19].

При проведении ИК-спектроскопии ПОБ на спектрах получена полоса поглощения в области 1760 см–1, указывающая на наличие карбонильной группы (C = O) в полимере и являющаяся характерной для ПОБ.

1H-ЯМР анализ ПОБ. Химическая структура ПОБ была подтверждена методом 1Н-ЯМР. Анализ спектров 1H-ЯМР показал, что боковую метильную группу отображает только выраженный пик при 1.27 ppm. Полимер является гомополимером, который состоит только из мономеров 3-гидроксимасляной кислоты (рис. 2).

Рис. 2.

1Н-ЯМР спектр бактериального ПОБ A. agile 12: 1 – CH3-группа, 2 – CH-группа и 3 – CH2-группа.

Термогравиметрический (ТГ) анализ. Термогравиметрия – это метод, который позволяет быстро и просто получать информацию о влажности и зольности полимеров. Скорость нагрева оказывает серьезное влияние на разрешение кривой ТГ. Этот параметр является фундаментальным для термогравиметрического исследования [20, 21]. Данное исследование проведено при стабильной скорости нагрева 10°С/мин.

В табл. 2 представлены результаты термогравиметрического анализа биополимеров: потеря массы при разложении и температурные интервалы бактериальных ПОБ, АЛГ и АЛГ водорослей для сравнения, на рис. 3 – кривые ТГ. Кривые ТГ в воздушной атмосфере для АЛГ имели три стадии потери массы: первая связана с дегидратацией, а следующие две – с разложением органического вещества до образования углеродистого остатка, соответственно. Первая стадия характеризовала дегидратацию (потеря массы в диапазоне от 6 до 8%) при температуре нагревания от 20 до 200°С. Вторая стадия показывала наибольшую потерю массы (от 30 до 35%) при температуре от 200 до 300°С. Последняя стадия сопровождалась вторым разложением с низкой потерей массы (от 4 до 7%) в диапазоне температур от 325 до 450°С.

Таблица 2.  

Результаты термического разложения АЛГ и ПОБ при атмосфере воздуха

Биополимеры Стадия Температура, °С Потеря массы, %
Бактериальный альгинат Дегидратация 2 –195.6 6.19
Первое разложение 195.6–330 29.38
Второе разложение 330–490 3.88
Водорослевый альгинат Дегидратация 10–175.4 7.93
Первое разложение 175.4–348.4 33.92
Второе разложение 348–490 6.78
Бактериальный ПОБ Дегидратация 25–218.3 1.25
Разложение 218.3–330 98.53
Рис. 3.

Кривые ТГА АЛГ A. agile 12 (a), АЛГ из водорослей (б) и ПОБ из A. agile 12 (в).

У АЛГ из водорослей большая потеря массы наблюдалась при всех стадиях разложения в отличие от бактериального полимера. Полученные результаты можно объяснить различной величиной молекулярной массы полимерных образцов: АЛГ A. agile 12 – 112 кДа, из водорослей (“Sigma Aldrich”, Германия) – 595 кДа.

ПОБ имел только одну стадию разложения при температурах от 220 до 330°С с низкой потерей массы (1.25%) на стадии дегидратации. Температуры разложения АЛГ и ПОБ приведены в табл. 2 и 3.

Таблица 3.  

Физико-химические свойства ПОБ и АЛГ

Биополимеры Tразложения, °C Водопоглощение, %
Бактериальный ПОБ 218–330 1.2
Бактериальный АЛГ 195–330 первое разложение 341
330–490 второе разложение
Водорослевый АЛГ 175–348 первое разложение 230
348–490 второе разложение

Тест на водопоглощение. Испытания препаратов АЛГ и ПОБ на водопоглощение показало, что полимеры значительно различались по своим характеристикам (табл. 3). Бактериальный АЛГ при погружении в деионизованную воду увеличивал свою массу в три раза, в то время как АЛГ из водорослей только в два. Таким образом, бактериальный АЛГ имел преимущество по сравнению с АЛГ морских водорослей, обладая большей водоудерживающей способностью. Это свойство может быть очень полезно для применения бактериального АЛГ в биотехнологии и медицине.

ПОБ является гидрофобным полимером, а его водопоглощение составило всего 1.2% (табл. 3) [22].

Таким образом, штамм A. agile 12 обладал способностью синтезировать одновременно два биополимера АЛГ и ПОБ с различными физико-химическими свойствами. Внутриклеточный ПОБ, как показано в работе, – гидрофобный, термопластичный, термически стабильный, механически прочный полиэфир, в то время как АЛГ гидрофильный, образующий гидрогели, термически нестабильный, эластичный и механически легко разрушаемый полисахарид. ПОБ в большей степени подходит для использования в качестве биоматериала для костной и хрящевой инженерии, тогда как АЛГ для инженерии мягких тканей. В дальнейшем планируется получение АЛГ и ПОБ с различными физико-химическими характеристиками и использование их при создании композитных конструкций для тканевой инженерии.

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке Российского научного фонда в части исследования физико-химических свойств АЛГ и ПОБ, проект № 17-74-20104.

Список литературы

  1. Yoneyama F., Yamamoto M., Hashimoto W., Murata K. // Bioengineered. 2015. V. 6. № 4. P. 209–217.

  2. Urtuvia V., Maturana N., Acevedo F., Peña C., Díaz Barrera A. // World J. Microbiol. Biotechnol. 2017. V. 33. № 11:198. P. 1–10.

  3. Clementi F., Mancini M., Moresi M. // Engineering and Food at ICEF7. /R. Jowitt. Part I. Scheffield: Academic Press, 1997. P. 25–28.

  4. Galindo E., Peña C., Núñez C., Segura D., Espin D. // Microbial. Cell Factories. 2007. V. 6. P. 1–16.

  5. Millán M., Salazar M., Segura D., Castillo T., Díaz-Barrera A., Peña C. // Journal of Biotechnology. 2017. V. 259. P. 50–55.

  6. Rehm B.H., Valla S. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997. V. 48. № 3. P. 281–288.

  7. Ertesvåg H., Sletta H., Senneset M., Sun Y., Klinkenberg G., Konradsen T.A., Ellingsen T.E., Valla S. // BMC Genomics. 2017. V. 18. P. 11–13.

  8. Bonartsev A.P., Yakovlev S.G., Filatova E.V., Soboleva G.M., Makhina T.K., Bonartseva G.A., Shaĭtan K.V., Popov V.O., Kirpichnikov M.P. // Biochemistry, Supplemental Series B. 2012. V. 6. P. 42–47.

  9. Jiménez L., Castillo T., Flores C., Segura D., Galindo E., Peña C. // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2016. V. 43. № 8. P. 1167–1174.

  10. Peña C., Galindo E., Büchs J. // Process Biochemistry. 2011. V. 46. P. 290–297.

  11. Bonartseva G.A., Akulina E.A., Myshkina V.L., Voinova V.V., Makhina T.K., Bonartsev A.P. // Appl. Biochem. Microbiol. 2017. V. 53. № 1. P. 52–59.

  12. Kennedy C., Gamal R., Hummprey R., Ramos J., Brigle K., Dean D. // Mol. Gen. Genet. 1986. V. 205. P. 318–325.

  13. Usov A.I. // Usp. Khim. 1999. V. 68. P. 1051–1061.

  14. Martinsen A., Skjak-Braek G., Smidsrod O., Zanetti F., Paoletti S. // Carbohydr. Polym. 1991. V. 15. P. 171–193.

  15. Akita S., Einaga Y., Miyaki Y., Fujita H. // Macromolecules. 1976. V. 9 № 5. P. 774–780.

  16. Bonartsev A.P., Yakovlev S.G., Zharkova I.I., Boskhomdzhiev A.P., Bagrov D.V., Myshkina V.L., Makhina T.K., Kharitonova E.P., Samsonova O.V., Feofanov A.V., Voinova V.V., Zernov A.L., Efremov Y.M., Bonartseva G.A., Shaitan K.V., Kirpichnikov M.P. // BMC Biochemistry. 2013. V. 14:12. P. 1–13.

  17. Bonartsev A.P., Zharkova I.I., Yakovlev S.G., Myshkina V.L., Mahina T.K., Voinova V.V., Zernov A.L., Zhuikov V.A., Akoulina E.A., Ivanova E.V., Kuznetsova E.S., Shaitan K.V., Bonartseva G.A. // Prep. Biochem. and Biotech. 2017. V. 47. № 2. P. 173–184.

  18. Jensen H.M., Larsen F.H., Engelsen S.B. // Methods Mol. Biol. 2015. V. 1308. P. 347–363.

  19. Ertesvåg H. // Front. Microbiol. 2015. V. 6. № 523. P. 2–8.

  20. Cavalheiro E.T.G., Ionashiro M., Brevigliere S.T., Marino G., Chierice G.O. // Quim. Nova. 1995. V. 18. № 3. P. 305–308.

  21. Soares J.P., Santos J.E., Chierice G.O. // Cavalheiro E.T.G., Eclética Química. 2004. V. 29. № 2. P. 57–63.

  22. Bonartsev A.P., Boskhomodgiev A.P., Iordanskii A.L., Bonartseva G.A., Rebrov A.V., Makhina T.K., Myshkina V.L., Yakovlev S.A., Filatova E.A., Ivanov E.A., Bagrov D.V., Zaikov G.E. // Molecular Crystals and Liquid Crystals. 2012. V. 556. P. 288–300.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Прикладная биохимия и микробиология

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал