Прикладная биохимия и микробиология, 2019, T. 55, № 6, стр. 586-593

МЕТОДИКА

Штаммы и ферменты. В работе были использованы ФП, представляющие собой лиофильно высушенные культуральные жидкости (КЖ) штаммов гриба P. canescens с клонированными гомологичными пектинлиазой (штамм РСА-ПЛ), арабиноксилан-арабинофурангидролазой (РСА-АКГ), экзо-арабиназой (РСА-экзоА), гетерологичной эндо-арабиназой (РСА-эндоА), штаммов гриба P. verruculosum В1-Целл и Ф-10 – продуцентов целлюлаз и гетерологичной β-глюкозидазы соответственно, а также штамма гриба A. foetidus 70а – продуцента пектиназ и гемицеллюлаз.

Гомогенные ферменты были выделены из перечисленных выше ФП по методикам, описанным в работах [11, 13–19].

Реагенты. Для создания буферных смесей использовали реактивы фирм “Bio-Rad” (США), “Panreac” (Германия), “Helicon” и “Реахим” (Россия). В качестве стандартов при хроматографическом исследовании продуктов гидролиза использовали ксилозу, арабинозу, фруктозу, глюкозу, галактозу, сахарозу, целлобиозу (“Megazyme”, Австралия).

Коммерческий СЖ (содержание сухих веществ 96%) был измельчен до частиц 0.5–1.0 мм на мельнице MF10 basic (“IKA Werke”, Германия).

Субстраты для определения специфических активностей: арабинаны линейный и разветвленный из сахарной свеклы, арабиноксилан из пшеницы, галактан из картофеля – все “Megazyme” (Австралия); К-соль полигалактуроновой кислоты (ПГК), Na-соль карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ), ксилан из бука, цитрусовый пектин со степенью этерификации около 70%, п-нитрофенил-α-арабинофуранозид (пНФАФ), п-нитрофенил-β-глюкопиранозид (пНФГл), п-нитрофенил-β-ксилопиранозид (пНФК) – “Sigma” (США); гемоглобин и микрокристаллическая целлюлоза (МКЦ) – “Витек” (Россия).

Определение активности ферментов. За единицу активности принимали такое количество фермента, которое катализирует образование 1 мкмоль продукта за 1 мин.

Активности по отношению к полисахаридным субстратам (концентрация 5 г/л в реакционной смеси) определяли по начальным скоростям образования восстанавливающих сахаров (ВС) при рН 5.0 и 50°С методом Шомоди–Нельсона [20].

Активности по отношению к п-нитрофенильным производным сахаров (0.9 мМ в реакционной смеси) определяли по скорости образования п-нитрофенола при рН 5.0 и 40°С [20].

Общую протеолитическую активность ФП определяли по отношению к гемоглобину (1% раствор в реакционной смеси) при рН 4.7 и 30°С методом Ансона [21].

Лиазную активность определяли по изменению оптической плотности при 232 нм, регистрирующей накопление 4,5-ненасыщенного продукта трансэлиминирования пектина [22].

Концентрацию глюкозы в гидролизатах СЖ определяли с помощью набора “Фотоглюкоза” (“Импакт”, Россия) согласно инструкции.

Содержание белка в ФП определяли методом Лоури, используя БСА в качестве стандарта. Концентрацию гомогенных ферментов оценивали по оптической плотности при 280 нм, используя рассчитанные по аминокислотной последовательности коэффициенты экстинкции.

Электрофорез в 12%-ном ПААГ с Na-ДДС проводили на приборе MiniProtein (“Bio-Rad”, США) согласно руководству к прибору. Содержание индивидуальных белков в ФП оценивалось методом денситометрии.

Ферментативный гидролиз СЖ. Гидролиз СЖ проводили под действием гомогенных ферментов или их смесей, при сохранении общей суммарной дозировки по белку 2 мг/г субстрата или 0.2 мг/мл реакционной смеси (весовые доли индивидуальных ферментов в их смесях были равными, если не оговорено отдельно) в пробирках объемом 2 мл (объем реакционной смеси 1.5 мл) в термостатируемом шейкере. Гидролиз СЖ ФП проводили при концентрации ФП 10 мг белка/г субстрата или 1 мг/мл реакционной смеси в пластиковых ячейках объемом 60 мл (объем реакционной смеси 20 мл) в термостатируемом шейкере. Во всех случаях процесс гидролиза вели в присутствии 0.1 г/л антибиотика ампиокса и 0.001 М азида натрия при рН 5.0 и 40°С.

В ходе процесса отбирали аликвоты, в которых определяли концентрацию ВС (методом Шомоди–Нельсона), глюкозы (с помощью набора “Фотоглюкоза”), белка (методом Лоури). Состав низкомолекулярных продуктов определяли с помощью ионообменной хроматографии на системе HPLC Agilent 1100 Series (“Agilent”, США) на колонке Диасфер-110-Амин 5 мкм 4.0 × 250 мм (элюент ацетонитрил : вода 77 : 23, скорость потока 1 мл/мин, объем анализируемого образца 10–100 мкл). Пробу для анализа готовили, добавляя к 0.2 мл гидролизата 0.8 мл ацетонитрила с последующим центрифугированием в течение 5 мин при 9000 g.

Глубину гидролиза СЖ рассчитывали исходя из содержания в нем полисахаридов, арабинозы и глюкозы [2–4].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Гидролиз СЖ гомогенными ферментами. Из ФП штаммов грибов P. verruculosum, P. canescens и A. foetidus были выделены 12 очищенных ферментов (гомогенных по данным электрофореза в ПААГ с Na-ДДС) и определены их удельные активности (табл. 1).

Ферменты целлюлазного комплекса: целлобиогидролаза 1 (ЦБГ1), эндо-глюканаза 2 (ЭГ2) и β-глюкозидаза (βГ) – обладали высокими активностями по отношению к МКЦ, КМЦ и пНФГл соответственно. Пектиназы – пектинлиаза (ПЛ) и полигалактуроназа (ПГ) были активны по отношению к пектину и ПГК соответственно. Эндо-арабиназа (эндоА) и экзо-арабиназа (экзоА) обладали высокой активностью по отношению к линейному арабинану, арабиноксилан-арабинофурангидролаза (АКГ) – к разветвленному арабинану (неспецифическому для нее субстрату) и арабиноксилану; эндо-ксиланаза (ЭК) и эндо-галактаназа (ЭГал) – к ксилану и галактану соответственно; β-ксилозидаза (βК) и α-арабинофуранозидаза (АФ) – к пНФК и пНФАФ соответственно.

Гидролиз СЖ индивидуальными гомогенными ферментами (исключение составляла ЦБГ1, которая находилась в смеси с избытком βГ в соотношении 9 : 1), как и ожидалось, привел к незначительному образованию сахаров (табл. 2). Наибольшая концентрация ВС (11–14 г/л) после 48-часового гидролиза при исходной концентрации СЖ 100 г/л наблюдалась при внесении ПЛ, АКГ и АФ; действии смеси ЦБГ1 с βГ, а индивидуальных ЭК, эндоА, экзоА, ЭГал и ПГ – 6–10 г/л ВС; индивидуальных ЭГ2 и βК – ~2 г/л ВС.

При выдерживании СЖ в условиях реакции гидролиза без ферментативной обработки в небольшом количестве определялись фруктоза и глюкоза (0.2 г/л). Действие ЭГ на СЖ приводило к накоплению небольшого количества целлобиозы (0.13 г/л), при воздействии смеси ЦБГ1 с βГ – 2.42 г/л глюкозы, ЭК – 2.07 г/л арабинозы и 0.23 г/л ксилобиозы, βК, АКГ, АФ, эндоА, экзоА – арабинозы как основного продукта (0.24–2.93 г/л), ЭГал – олигомерного продукта со степенью полимеризации (СП) 2 (6.27 г/л) и ПЛ – 4.20 г/л арабинозы.

Далее был проведен гидролиз СЖ различными по составу смесями (табл. 3). Смесь всех ферментов (№ 1) давала концентрацию ВС 33.6 г/л, что соответствовало конверсии полисахаридов СЖ 42%. Выход арабинозы составил 12.6 г/л (60% от максимально возможного), глюкозы – 9.1 г/л (43% от максимально возможного).

Для выявления ключевых для конверсии СЖ ферментов и оптимизации состава ферментативной смеси далее из смеси № 1 исключали по одному ферменту, что в ряде случаев привело к сопоставимым с использованием смеси № 1 результатам по выходу ВС (данные не приводятся). Исключение составляли смеси ферментов без ЦБГ1 с βГ, без AКГ и без ПЛ, при исключении которых выход ВС составил 27.4, 30.5 и 28.8 г/л соответственно. Таким образом ферменты ЦБГ1 с βГ, AКГ и ПЛ были необходимыми для эффективного гидролиза СЖ. Однако при составлении смеси только этих ферментов (№ 2) получали 31.3 г/л ВС (11.5 г/л арабинозы, 7.8 г/л глюкозы, табл. 3) – меньше, чем при использовании смеси №1, что указывает на необходимость добавления других (вспомогательных) ферментов.

На следующем этапе из смеси № 1 исключали по два фермента кроме ключевых. Было отмечено, что при использовании смесей, в которых отсутствовали ЭГ2 и/или ПГ, образовывалось не более 39 г/л ВС, в то время как в остальных случаях (когда присутствовали ЭГ2 и ПГ, но исключались ЭК, βК, АФ, эндоА, экзоА и ЭГал) были смеси, приводящие к концентрации ВС >40 г/л. Таким образом, ЭГ2 и ПГ также были отнесены к ключевым для гидролиза СЖ. Смесь ферментов № 3, содержащая ЦБГ1, βГ, АКГ, ПЛ, ЭГ2 и ПГ приводила к образованию 35.7 г/л ВС (14.5 г/л арабинозы, 10.9 г/л глюкозы, табл. 3).

Далее на основе смеси № 3 путем добавления к ней в разном сочетании ЭК, βК, АФ, эндоА, э-кзоА и/или ЭГал (при добавлении от одного до пяти из этих ферментов) были отобраны четыре смеси (№ 4–7), использование которых позволяло получать наибольшие значения концентрации ВС и моносахаров. Этими смесями ферментов был проведен гидролиз СЖ в течение 72 ч: при этом концентрация ВС составила 49.1–54.5 г/л, что соответствовало конверсии полисахаридов СЖ 61–68%, арабинозы – 17.6–19.6 г/л (94% от максимально возможного), глюкозы – 13.2–16.7 г/л (63–79% от максимально возможного).

Гидролиз СЖ ферментными препаратами. Для конверсии СЖ были использованы лабораторные ФП (электрофореграммы ФП приведены на рис. 1) с преимущественным содержанием одного клонированного фермента: Ф-10 (содержание βГ от общего белка 70%), РСА-ПЛ (47% ПЛ), РСА-АКГ (29% АКГ), РСА-экзоА (20% экзоА, 12% ЭК), РСА-эндоА (22% эндоА, 11% ЭК), а также мультикомпонентные препараты: целлюлазы (В1-Целл) (общее содержание ЦБГ1 и ЦБГ2 50%, ЭГ1, ЭГ2 и ЭГ3 17%), A. foetidus (Af-70а) (содержание АФ 24%, ПГ 12%, βК и ЭГал – менее 1%). В табл. 4 представлены активности ФП по отношению к ряду субстратов. Следует отметить высокие активности по отношению к арабинану у ФП РСА-АКГ, РСА-эндоА и РСА-экзоА (23–42 ед./мг) и наличие активности к КМЦ как у целлюлаз В1-Целл и Ф-10 (7.8 ед./мг), так и у остальных ФП (1.2–1.4 ед./мг), что свидетельствовало о присутствии в этих ФП активности эндо-глюканазы.

Рис. 1.

Электрофорез в ПААГ с Na-ДДС сухих ФП: 1 – В1-Целл, 2 – Ф-10, 3 – РСА-ПЛ, 4 – РСА-АКГ, 5 – РСА-экзоА; 6 – РСА-эндоА, 7 – Af-70а. М –маркеры, указаны молекулярные массы стандартных белков.

При гидролизе СЖ (100 г/л) индивидуальными ФП (за исключением смеси В1-Целл с Ф-10 в соотношении 9 : 1, табл. 5) накопление арабинозы (6–8 г/л за 48 ч) наблюдали для всех ФП. Концентрация глюкозы для смеси В1-Целл и Ф-10 составила 11.2 г/л, для остальных ФП – 3–8 г/л. Для всех ФП концентрация галактозы составила 0.5–1.8 г/л. Следует отметить, что для всех использованных ФП наблюдалось накопление фруктозы до 1.5–3.4 г/л. Используемые ФП обладали относительно низкой протеолитической активностью (табл. 4), однако при конверсии СЖ наблюдали относительно высокий выход растворимого белка – 4.7–6.7 г/л (что составляло 50–65% от общего содержания белка в СЖ). Это происходило, вероятно, благодаря разрушению полисахаридной сетки жома и высвобождению связанного белка.

В дальнейшем моделировали гидролиз СЖ смесями различных ФП. Ранее нами было установлено [15], что гомогенные экзоА и эндоА не проявляли синергизма при совместном гидролизе арабинанов. Действие этих ферментов на разветвленный арабинан существенно усиливалось в присутствии ферментов, активных по отношению к боковым арабинозным остаткам субстрата – АКГ и АФ. Предварительные эксперименты на СЖ (данные не приводятся) подтвердили отсутствие синергетического эффекта ФП РСА-экзоА и РСА-эндоА, вследствие этого при составлении оптимальной смеси ФП в нее были включены либо РСА-экзоА, либо РСА-эндоА. Кроме того, было установлено (данные не приводятся), что доля целлюлазного ФП должна составлять не менее половины от общего количества белка – в этом случае скорость накопления глюкозы становится соизмеримой со скоростью накопления арабинозы.

Были составлены две смеси ФП № 8 и № 9, отличающиеся присутствием РСА-экзоА (смесь ФП № 8) или РСА-эндоА (смесь ФП № 9), следующего состава: В1-Целл + Ф-10 (считали как один ФП): РСА-АКГ : РСА-ПЛ : Af-70а : РСА-экзоА/или РСА-эндоА = 10 : 2 : 2 : 5 : 1. Смесь составляли так, чтобы общая дозировка белка в реакционной смеси была 10 мг/г СЖ (концентрация СЖ 100 г/л). Удаление какого-либо компонента из составленных смесей приводило к снижению выхода продуктов (данные не приводятся). В результате за 48 ч гидролиза СЖ смесями ФП № 8 и № 9 была достигнута концентрация ВС 56.5 и 58.6 г/л (что соответствовало конверсии полисахаридов 71–73%), арабинозы – 18.5 и 19.9 г/л (97% от максимально возможного), глюкозы – 24.7 и 25.5 г/л (до 100% от максимально возможного), галактозы – 4.6 и 3.4 г/л (70–90% от максимально возможного [4]), белка – 9.5 и 9.7 г/л (95–97%) (табл. 5).

Далее проводили гидролиз СЖ (100 г/л) смесями ФП № 8 и № 9, используя различные концентрации ФП по белку 1, 2, 5, 10, 20 мг белка/г СЖ (на рис. 2 представлены результаты только для смеси ФП № 9, поскольку для смеси № 8 были получены близкие к этим данные). После 48 ч гидролиза смесью ФП № 9 при 5–20 мг белка/г СЖ выход основных продуктов был одинаковый и не зависел от концентрации ФП; дальнейшее же ее снижение приводило к существенному уменьшению выхода сахаров.

Рис. 2.

Содержание арабинозы (1), глюкозы (2), галактозы (3) и белка (4) после 48 ч гидролиза СЖ (100 г/л) в зависимости от концентрации смеси № 9.

Был проведен гидролиз СЖ при исходных концентрациях субстрата 100, 150, 200 и 250 г/л с использованием смесей ФП № 8 и № 9 (на рис. 3 представлены данные для смеси ФП № 9). Увеличение концентрации СЖ до 250 г/л приводило к незначительному уменьшению концентрации продуктов за 48 ч гидролиза. Конверсия полисахаридов субстрата по ВС снизилась с 74% (для 100 г/л) до 71% (для 250 г/л), выход арабинозы от максимально возможного составил – от 96 до 84%, глюкозы – от 100 до 90%, белка – от 100 до 88%. Итоговый выход продуктов при исходной концентрации СЖ 250 г/л составил: 142.4 г/л ВС, 44.2 г/л арабинозы, 49.1 г/л глюкозы, 9.3 г/л галактозы, 22.1 г/л белка.

Рис. 3.

Степень гидролиза СЖ (250, 200, 150 и 100 г/л) после 48 ч гидролиза смесью № 9 (10 мг/г): 1 – конверсия полисахаров, %; 2 – арабинозы; 3 – глюкозы; 4 – белка.

На рис. 4 представлена динамика накопления основных продуктов гидролиза СЖ (250 г/л) под действием смеси ФП № 9 в концентрациях 10 и 5 мг/г в течение 72 ч. За 24 ч выход продуктов гидролиза СЖ составил 3/4 от максимального, достигнутого за 72 ч, даже при концентрации ФП 5 мг/г. При этом скорости накопления арабинозы и глюкозы были соизмеримы. Общий выход продуктов за 72 ч составил: 155.2 г/л по ВС (конверсия полисахаридов 78%), 45.8 г/л арабинозы (89% от максимально возможного), 52.3 г/л глюкозы (99%), 11.2 г/л галактозы (88%), 22.9 г/л белка (92%).

Рис. 4.

Изменение концентрации ВС (I-II) и моносахаров (1–6) (г/л) при гидролизе СЖ (250 г/л) в течение 72 ч смесью №9 в концентрации 10 (I, 1, 3, 5) и 5 мг/г (II, 2, 4, 6): 1, 2 – концентрация глюкозы; 3, 4 – арабинозы; 5, 6 – галактозы.

***

Таким образом, в ходе исследований были найдены необходимые для глубокой конверсии СЖ до моносахаридов ферменты: ЦБГ1, βГ, ЭГ2, АКГ, ПЛ, ПГ. Добавление к основным ферментам дополнительно гемицеллюлаз эндоА, экзоА, ЭГал, βК, ЭК и/или АФ позволило получить наиболее эффективную композицию из индивидуальных ферментов, обеспечивающую в 1.2–1.4 раза больший выход ВС и моносахаридов.

Подобрана оптимальная смесь из ФП, состоящая из целлюлаз (24% ЦБГ1, 8% ЭГ2, 4% βГ), пектиназ (5% ПЛ, 3% ПГ), гемицеллюлаз (4% АКГ, 1% эндоА или экзоА, 6% АФ, 3% ЭК, менее 1% βК и ЭГал), которая позволила при концентрации 5–10 мг белка/г субстрата достичь степени конверсии СЖ по арабинозе, глюкозе и белку близкой к 100% за 24–48 ч гидролиза при концентрации субстрата до 250 г/л. При этом скорости накопления арабинозы и глюкозы были соизмеримы, что свидетельствовало об оптимальном соотношении целлюлаз (ответственных за накопление глюкозы), гемицеллюлаз (арабинозы) и пектиназ (обеспечивающих доступ к целлюлозным волокнам за счет разрушения поверхностного пектина).

В научной литературе не было найдено работ, посвященных успешной конверсии СЖ при такой высокой исходной концентрации субстрата как использованная нами (250 г/л). Как правило, использовали концентрацию СЖ 50–100 г/л и достигали при этом степени конверсии до моносахаридов 70–100% [3, 4, 6].

В работе [4] также была отмечена роль пектиназ в конверсии СЖ. В настоящей работе также было показано, что ПЛ в небольшом количестве (около 0.24 мг/г СЖ) эффективно разжижала СЖ за 12–15 ч до текучего состояния даже при его концентрации 250 г/л, при которой СЖ представлял набухшую массу без жидкой фракции. Участие ПГ в этом процессе было незначительно.

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке РФФИ (грант № 18-54-80027). В работе использовалось научное оборудование ЦКП “Промышленные биотехнологии” и АЦКП “Биоинженерия” ФИЦ Биотехнологии РАН.