Прикладная биохимия и микробиология, 2019, T. 55, № 6, стр. 594-601

МЕТОДИКА

Подбор условий ВЭЖХ-анализа. Ранее полученные нами образцы стагонолида А и гербарумина I [11] растворяли в метаноле (1 мг/мл) и использовали для приготовления стандартных растворов. Количественный анализ одновременно обоих фитотоксинов проводили с использованием хроматографической системы Acquity UPLC H-Class (“Waters”, США), снабженной диодно-матричным детектором (СВЭЖХ/ДМД). Для оптимизации условий разделения токсинов использовали колонку Acquity UPLC BEH (2.1 × 50 мм) с несколькими видами обращенно-фазных (ОФ) сорбентов (C18, RP18, Phenyl и C8) с размером частиц 1.7 мкм, а также различные температурные режимы хроматографирования: 30, 40 и 50°С при скорости подачи элюента 300, 250 и 200 мкл/мин соответственно. В качестве подвижной фазы (ПФ) использовали три системы растворителей: ПФ А – ацетонитрил – 5 мМ орто-фосфорная кислота (30 : 70), ПФ Б – ацетонитрил– вода (30 : 70) и ПФ В – метанол–вода (50 : 50). Объем вводимой пробы составлял 5 мкл, концентрация стагонолида А и гербарумина I − 1 мкг/мл. Детектирование гербарумина I и стагонолида А осуществляли при 200 и 234 нм соответственно, а также после сканирования в диапазоне 190–600 нм, используя функцию MaxPlot программы Empower 3 (“Waters”, США). Оценивали время удерживания (t_R) фитотоксинов, относительную селективность их разделения α = (t_R2 – t_RМ)/(t_R1 – t_RМ) и общее время анализа.

Твердофазную экстракцию фитотоксинов из фильтрата культуральной жидкости S. cirsii и их очистку проводили с помощью вакуумной установки (манифолда) на колонках с ОФ сорбентом Chromabond C18ес (масса сорбента 500 мг, объем резервуара 3 мл , “Macherey-Nagel”, Германия). Сорбент кондиционировали последовательным нанесением на колонку 3 мл метанола и 3 мл воды (не допуская пересыхания), а затем наносили 200 мкл фильтрата культуральной жидкости, промывали 3 мл воды и 3 мл 25%-ного метанола и подсушивали воздухом в течение 1 мин. Элюцию проводили метанолом (2 мл), элюат тщательно перемешивали и хранили при –20°С. Для количественного определения фитотоксинов отбирали 200 мкл элюата, добавляли к нему 300 мкл воды и тщательно перемешивали. Анализ фитотоксинов проводили с использованием колонки Acquity UPLC BEH C18 (50 × 2.1 мм). В качестве ПФ использовали систему ацетонитрил–вода в соотношении 30 : 70 (об./об.), скорость подачи ПФ 300 мкл/мин, температура термостата колонки 30°С. Объём наносимого образца 5 мкл. Время удерживания стагонолида А составляло 2.10 мин, гербарумина I – 1.63 мин. Погрешность t_R не превышала 2% по данным не менее 3 анализов.

Градуировочные характеристики, выражающие зависимость площадей пиков от концентрации стагонолида А и гербарумина I в пробах, устанавливали методом абсолютной калибровки по пяти концентрациями соединений в диапазоне от 0.125 до 20 нг в анализируемой пробе, соответствующих концентрации фитотоксинов от 0.625 до 100 мкг/мл. Для определения степени извлечения растворы гербарумина I и стагонолида вносили в стерильную питательную среду и 3-суточную культуральную жидкость на уровне 6.25 и 50 мкг/мл, после чего определяли фитотоксины по описанной выше методике. Эксперименты выполняли в 3 повторностях (каждая из которых включала две аналитических повторности).

Культивирование гриба. В работе был использован штамм S. cirsii S-47 из коллекции лаборатории фитотоксикологии и биотехнологии ВИЗР. Штамм хранили в пробирках на скошенном картофельно-глюкозном агаре (КГА) при 4°С, посевную культуру выращивали на этой же среде при 24°С.

Для глубинного культивирования S. cirsii использовали жидкую питательную среду Чапека с витаминами (ЧАВ) в следующего состава (г/л): глюкоза – 45, NaNО₃ – 3, К₂НРО₄ – 1, MgSО₄ ⋅ 7H₂О – 0.5, KCl – 0.5, FeSО₄ ⋅ 7H₂О – 0.01, тиамин – 100 мкг, биотин – 5 мкг, рН 6.0. В среду вносили от 0 до 4% (по объему) рафинированного подсолнечного масла. Оценку влияния концентрации масла на рост гриба и токсинообразование изучали при культивировании в конических колбах на 500-мл с 100 мл среды. Гриб выращивали на качалке при 180 об./мин в течение 14 сут при 24°С. На 7, 10 и 14-е сут культивирования отбирали 1 мл культуральной жидкости, который хранили при –20°С. Опыт выполняли в 4 повторностях.

Для оценки роста и токсинообразования использовали стеклянный ферментер с рабочим объемом 1.5 л (“Applikon Biotechnology”, Голландия) с системой управления процессами ez-Control и программным обеспечением BioXpert. Система оснащена датчиками рН и температуры, измерялись также концентрация растворенного кислорода и уровень пенообразования. Ферментационную среду (1.4 л) инокулировали 100 мл 7-суточной культуры, полученной на среде ЧАВ без масла по выше описанной методике. Параметры ферментации: 24°С, скорость подачи воздуха 1.5 л/мин, скорость перемешивания – 200 об./мин в течение 2 сут и 400 об./мин – до завершения процесса ферментации, уровень рН не поддерживали. Пеногаситель – рафинированное подсолнечное масло (1% от объема среды) вводили в среду до посева гриба. Культивирование проводили 7 сут, ежедневно отбирая образцы по 30 мл культуральной жидкости, которые хранили при –20°С. Эксперимент повторяли трижды.

Определение параметров роста гриба и биологической активности экстрактов. Значение водородного показателя в культуральной жидкости определяли потенциометрическим методом. Массу сухого мицелия определяли взвешиванием после промывки водой и высушивания при 50°С в течение 2 сут. Метаболиты гриба экстрагировали из культуральной жидкости хлористым метиленом в соотношении 2 : 1 (об./об.). Растворитель отгоняли на ротационном испарителе, определяли массу сухого остатка и рассчитывали выход экстрактивных веществ.

Для определения фитотоксической активности экстрактов использовали хорошо развитые листья осота полевого, из которых при помощи пробочного сверла вырезали диски диаметром 10 мм. Листовые диски помещали в прозрачные пластмассовые контейнеры на предварительно увлажненную дистиллированной водой фильтровальную бумагу, в их центре острой препаровальной иглой делали надколы, а затем поверх них наносили 10 мкл 0.5%-ного экстракта. Для приготовления такого экстракта сухой остаток после выпаривания хлористого метилена растворяли в небольшом количестве этанола и доводили его объем водой до конечной концентрации этанола 5%. В контрольном варианте на листовые высечки наносили 5%-ный раствор этанола. Обработанные листовые высечки инкубировали при температуре 24°С и переменном освещении (12 ч в сут). Диаметр некротического пятна на дисках осота измеряли через 48 ч. Фитотоксическую активность стагонолида А и гербарумина I определяли при их концентрации 2 мг/мл.

Для определения антимикробной активности экстрактов по отношению к Bacillus subtilis использовали метод бумажных дисков (500 мкг сухого остатка на 6 мм диск). После 24 ч инкубации измеряли зону лизиса. Антимикробную активность чистых токсинов – стагонолида A и гербарумина I определяли в концентрации 200 мкг/диск.

Препаративное выделение стагонолида А и гербарумина I. Культуру гриба выращивали в ферментере 6 сут. Экстракцию метаболитов проводили хлористым метиленом. Грубое разделение экстракта (около 500 мг маслянистого остатка) проводили в стеклянной колонке (40 × 2.5 см) с силикагелем (50 г, диаметр частиц 70–200 мкм, “Merck”, Германия), в ступенчатом градиенте: гексан (элюент 1), гексан–этилацетат (8 : 2 об./об., элюент 2), гексан–этилацетат (6 : 4, элюент 3), гексан–этилацетат (4 : 6, элюент 4), этилацетат (элюент 5) и этилацетат–метанол (8 : 2, элюент 6). Объем элюата на каждой ступени составил 400 мл. Предварительный анализ состава фракций проводили методом ТСХ на пластинах Silica gel 60 (“Merck”, Германия) в системе гексан–этилацетат 8 : 2. Вещества визуализировали в УФ-свете (254 нм) и проявляли при обработке пластин стандартным реактивом на основе серной кислоты (10% об./об.) и анисового альдегида (10% об./об.) в этаноле с последующим нагревом при 105°С в течение 5 мин . Стагонолид А хорошо визуализировался при 254 нм и окрашивался реактивом в коричневый цвет (R_f 0.35). Гербарумин I при 254 нм не выявлялся, а реактивом окрашивался в синий цвет (R_f 0.15). По данным ТСХ и СВЭЖХ/ДМД фракция 3 (50 мг) содержала преимущественно стагонолид А и фракция 5 (150 мг) – гербарумин I с примесями.

Дальнейшую очистку гербарумина I проводили на обращенно-фазовой (ОФ) колонке Puriflash PF-15С18HP/20G (20 г, диаметр частиц сорбента 15 мкм, “Interchim”, Франция), используя систему препаративной хроматографии среднего давления Sepacore (“Büchi”, Швейцария) с УФ/ВИД-детектором. Фракцию 5 адсорбировали на 2 г ОФ сорбента (Silica gel 60 silanazied, диаметр частиц 63–200 мкм, “Merck”, Германия) и вносили в предколонку для сухой загрузки объемом 6 мл. Элюирование метаболитов осуществляли при комнатной температуре в системе растворителей 0.1%-ная муравьиная кислота – ацетонитрил по схеме: 15%-ный ацетонитрил в течение 1 мин, градиент от 15 до 100% ацетонитрила – 11 мин и ацетонитрил – 4 мин. Скорость потока элюента 24 мл/мин, детекция при 200 нм. Время удерживания гербарумина I составила 4.5 мин.

Финальную очистку фитотоксинов проводили методом препаративной ВЭЖХ на колонке XBridge Prep C18 (250 × 19 мм) с диаметром частиц 5 мкм (“Waters”, США). Состав частиц этой колонки аналогичен частицам сорбента аналитической колонки Acquity UPLC BEH C18. Хроматографирование проводили при комнатной температуре и скорости подачи элюента (вода–ацетонитрил 30 : 70) 24 мл/мин. Объем вводимой пробы − 1 мл: примерно 50 мг сухого образца растворяли в 300 мкл ацетонитрила и добавляли 700 мкл воды. Метаболиты детектировали на УФ-детекторе при 200 и 234 нм. В этих условиях t_R гербарумина I составило 9 мин, t_R стагонолида A – 12 мин. Контроль содержания этих фитотоксинов в хроматографических фракциях осуществляли описанным выше методом СВЭЖХ/ДМД.

Для подтверждения структуры выделенных соединений использовали ВЭЖХ-МС/МС и анализ протонных и углеродных спектров ЯМР. Для получения масс-спектров использовали хроматографическую систему TSQ Quantum Access™ (“Thermo Scientific”, США), снабженную диодно-матричным быстросканирующим и масс-спектрометрическим (тройной квадруполь) детекторами. Условия хроматографирования: колонка Zorbax CB-С18 (Agilent Tech., США), размеры колонки 2.1 × 150 мм, зернение 1.8 мкм, градиент 10–100% ацетонитрила в 0.1%-ной муравьиной кислоте, скорость потока элюента 250 мкл/мин, температура колонки 35°C, диапазон сканирования диодно-матричного детектора 200–800 нм, тип ионизации HESI, диапазон сканирования 50–1000 m/z. Для растворения соединений использовался метанол. Для записи спектров ЯМР – прибор Avance III Ultra-Shield Plus (“Bruker”, Германия). Анализируемые соединения растворяли в дейтерированном хлороформе. Протонные спектры записывали при частоте 400 МГц, углеродные – при 100 МГц.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Разработка методики хроматографического разделения фитотоксинов. На коротких (длиной 50 мм) СВЭЖХ-колонках оптимальная продолжительность анализа составляла около 3 мин при t_R аналитов в пределах 1.2–2.5 мин с учетом t_R не сорбируемых соединений около 0.5 мин. Подбор ОФ-сорбента и условий хроматографирования показал, что для быстрого одновременного анализа гербарумина I и стагонолида А колонки Acquity UPLC BEH С18 и Phenyl оказались оптимальными. При подобранных условиях хроматографирования, которые описаны ниже, они обеспечивали высокую селективность (α > 1.4) в пределах t_R аналитов от 1.2 до 2.5 мин. Независимо от использованных условий хроматографирования на колонке Acquity UPLC BEH RP18 селективность была низкой. На колонке с сорбентом С8 удерживание аналитов в условиях проведенного эксперимента было значительным (t_R от 2.2 до 4.1 мин), что неудобно для быстрого анализа.

Для стандартного разделения фитотоксинов S. cirsii (время анализа 3 мин при α > 1.4) оптимальными оказались следующие условия: колонки Acquity UPLC BEH С18 (ПФ Б) и Acquity UPLC BEH С8 (ПФ В) при температуре колонки 30°С, при скорости подачи ПФ 300 мкл/мин; колонки Acquity UPLC BEH С18 (ПФ В) и Acquity UPLC BEH Phenyl (ПФ А или Б) при температуре колонки 40°С и скорости подачи ПФ 250 мкл/мин.

Сверхбыстрый (2 мин) анализ гербарумина I и стагонолида А при высокой для данного эксперимента селективности обеспечивали колонки Acquity UPLC BEH С18 (α 1.66) и Phenyl (α 1.45) при использовании ПФ В и ПФ А соответственно при температуре колонки 30°С и скорости подачи элюента 300 мкл/мин. Такие условия удобно использовать для скрининга этих соединений в хроматографических фракциях.

При использовании ацетонитрила в качестве модификатора элюирующей системы (ПФ А и ПФ Б) первым из всех используемых типов колонок элюировался гербарумин I (табл. 1). При использовании ПФ В с метанолом в качестве модификатора стагонолид А элюировался с сорбента раньше гербарумина I. При этом, высокую селективность обеспечивала колонка с сорбентом С18, при использовании которой время удерживания стагонолида А составило 1.4 мин, гербарумина I – 1.9 мин.

Методика анализа фитотоксинов. Аналитические характеристики гербарумина I и стагонолида А, полученные методом СВЭЖХ, представлены в табл. 1.

При внесении фитотоксинов в стерильную жидкую питательную среду на уровне 50 мг/л средний уровень извлечения гербарумина I составил 99%, стагонолида А – 96%; при их внесении на уровне 6.25 мг/л было обнаружено 93% гербарумина I и 95% стагонолида А. Во всех вариантах погрешность опыта была низкой (S_r < 0.01).

При внесении гербарумина I в 3-суточный фильтрат КЖ, в котором оба соединения не детектировались, в ходе его количественного определения на выходе из колонки его не обнаруживали, но при этом появлялся пик стагонолида A, площадь которого соответствовала концентрации внесенного гербарумина I. При одновременном внесении обоих соединений в одинаковой концентрации детектировали в 2 раза больше стагонолида A, чем было внесено, а гербарумин I не обнаруживался. Это позволило предположить присутствие в КЖ ферментов, окисляющих гербарумин I до стагонолида A. При внесении стагонолида А в фильтрат КЖ степень его извлечения составила более 90%.

Влияние концентрации масла и продолжительности глубинного культивирования на выход гербарумина I и стагонолида А. При культивировании в колбах на качалке колонии S. cirsii S-47 росли в виде пеллет. Внесение различных концентраций растительного масла не влияло на морфологию колоний. Двухнедельная КЖ гриба, выращенного на среде без масла, имела темно-оливковый оттенок. С увеличением доли масла в среде интенсивность ее пигментации снижалась. Следует отметить, что при содержании масла ≥1% оно оставалось в виде пленки на поверхности жидкой питательной среды.

Содержание масла существенно влияло на выход биомассы двухнедельных культур S. cirsii S-47, увеличивая уровень накопления сухой биомассы гриба по сравнению со средой без масла. Так, выход биомассы на среде ЧАВ, с 2% масла оказался примерно на 40% выше (табл. 2). Присутствие этого компонента изменяло конечный pH КЖ, при более высоких концентрациях (1–4%) значение рН было ниже. Продолжительность культивирования и внесение подсолнечного масла оказали существенное влияние на образование фитотоксинов в КЖ S. cirsii S-47. Максимум накопления стагонолида А (от 3 до 4.7 мг/л) наблюдался на 7 сут культивирования, исключение составил вариант с 1%-ным содержанием масла в среде, при котором максимальный выход стагонолида А (11 мг/мл) приходился на 10 сут культивирования. На 14 сут культивирования гриба концентрация стагонолида А резко снижалась (табл. 2).

Максимальное накопление гербарумина I в КЖ на среде без масла (5.7 мг/л) наблюдали на 10 сут (табл. 2), добавление масла в жидкую питательную среду негативно влияло на образование этого метаболита.

Особенности роста и образования токсинов S. cirsii S-47 при культивировании в лабораторном ферментере. При выращивании в ферментере на среде ЧАВ с добавлением 1% масла колонии S. cirsii S-47 также как и в колбах имели вид пеллет. По мере роста гриба наблюдалось изменение пигментации КЖ от светло-бежевой опалесцирующей до коричнево-черной.

Максимум накопления сухой биомассы гриба наблюдали на 3 сут ферментации (12 г/л), максимальный выход соединений, экстрагируемых из фильтрата КЖ (около 800 мг/л), – на 6 сут ферментации. В процессе роста гриба наблюдали подкисление культуральной жидкости до рН 5.0 на 4 сут, а затем ее подщелачивание до рН 9 на 7 сут (рис. 2). Уровень растворенного кислорода (DO) в КЖ коррелировал с выходом биомассы. Так, его резкое снижение совпадало с максимальным накоплением биомассы: уже через 24 ч ферментации начиналось резкое снижение уровня DO, через 2 сут до 10%, а на 3 сут до нуля (рис. 2), что говорит об окончании фазы экспоненциального роста гриба.

Рис. 2.

Динамика роста Stagonospora cirsii S-47 при глубинном культивировании S. cirsii: 1 – рН; 2 – экстрактивные вещества в КЖ, г/л; 3 –сухая биомасса, г/л; 4 – растворенный кислород, %.

В различные сроки культивирования экстракты КЖ проявляли фитотоксическую активность (средний диаметр некротического пятна изменялся в пределах от 0.7 мм до 4.8 мм). Максимальное поражение листовых высечек осота вызывали экстракты, полученные из КЖ на 4, 5 и 7 сут ферментации S. cirsii S-47, при этом диаметр некротического пятна варьировал в пределах 4.5–5 мм (табл. 3). Антимикробная активность экстрактов обнаруживалась, начиная со 2 сут ферментации гриба (зона лизиса бактериальных колоний от 7 до 14 мм). Наибольшую активность по отношению к B. subtilis проявляли экстракты из 4 и 5-суточных проб КЖ S. cirsii S-47 (табл. 3).

Стагонолид А был обнаружен в культуральной жидкости на 4 сут ферментации – в начале стационарной фазы роста, максимальная его концентрация (116.7 мг/л) выявлена на 5 сут; на 7 сут ферментации стагонолид А в культуральной жидкости не обнаруживался. Гербарумин был выявлен в фазе отмирания – в 6- и 7-сут КЖ в концентрации 38 и 116.5 мг/л соответственно (табл. 3).

Идентификация и биологическая активность фитотоксинов. При выделении и очистке стагонолида А и гербарумина I из фильтрата КЖ S. cirsii использовали разработанные методики их анализа с помощью ТСХ и СВЭЖХ/ДМД Выход стагонолида А составил около 30 мг/л, гербарумина I – 50 мг/л.

В масс-спектре полученного стагонолида А присутствовали пики m/z 227.11 ([М + Н]⁺, 100%) и 209.12 ([M + Н–H₂O]⁺, 25%), в масс-спектре гербарумина I – m/z 229.11 ([М + Н]⁺, 10%) и 211.12 ([M + Н–H₂O]⁺, 100%), 193.15 ([M + Н–2H₂O]⁺, 25%). Масс-спектры демонстрировали наличие одной гидроксильной группы у стагонолида А и двух – у гербарумина I. Протонный и углеродный спектры ЯМР обоих соединений были идентичны опубликованным [10, 11]. В дополнительно полученных углеродных спектрах DEPT этих веществ присутствовали сигналы пяти СН₂-групп (3 сигнала лактонного кольца и 2 сигнала n-пропильной группы).

Стагонолид А и гербарумин I (2 мг/мл) проявляли примерно одинаковую фитотоксическую активность на листовых дисках осота полевого (диаметр некротических пятен около 6 мм). Однако антимикробная активность гербарумина I (зона лизиса около 4 мм) по отношению к B. subtilis была в 2.5 раза ниже, чем у стагонолида А (зона лизиса около 10 мм). Подходы к количественному определению остаточных количеств ксенобиотиков и биологически активных веществ (БАВ) в ходе многофакторной оптимизации их получения различаются: в первом случае важна высокая чувствительность метода, во втором – скорость определения. Поэтому метод ВЭЖХ/УФ часто используется для мониторинга мажорных БАВ в культурах микроорганизмов [14, 15]. Использование оборудования для СВЭЖХ позволяет в несколько раз ускорить процесс анализа, а диодно-матричный детектор (ДМД) – вести контроль за содержанием примесей и аналитов. Разработанная в данной работе методика анализа гербарумина I и стагонолида А позволяет в течение 30–60 мин подготовить несколько проб из КЖ S. cirsii методом твердофазной экстракции и провести их количественное определение при помощи СВЭЖХ/ДМД. Более того, при использовании картриджей для одновременной очистки 96 образцов она может быть адаптирована для высокопроизводительного скрининга продуцентов стагонолида А и гербарумина I, использование которого в последнее время расширяется и автоматизируется [16–18]. При необходимости чувствительность методики анализа фитотоксинов S. cirsii можно повысить, увеличив объем наносимого на колонку культурального фильтрата.

Методика анализа фитотоксинов была апробирована для определения влияния содержания растительного масла на рост и динамику образования токсинов при глубинном культивировании в колбах и лабораторном биореакторе. Растительные масла добавляются в питательные среды в качестве пеногасителя, источника углерода и стимулятора биосинтеза. Например, показано, что они стимулируют рост глубинного мицелия Cordyceps sp. и образование бета-лактамных антибиотиков рядом продуцентов [19, 20]. Для некоторых микроорганизмов они являются источником углерода в питательной среде [21, 22]. Потенциально растительное масло может быть использовано как пеногаситель при ферментации S. cirsii. Полученные результаты показали, что оно стимулировало рост гриба при глубинном культивировании на орбитальной качалке, повышая при этом образование стагонолида А (выход до 11 мг/л), но ингибируя образование гербарумина I (табл. 3). Максимальный выход гербарумина I при культивировании на среде ЧАВ составил около 5 мг/мл, что на порядок выше, чем у другого продуцента – гриба Phoma herbarum [10]. В дальнейшем использование предложенной методики позволит оптимизировать состав среды и провести селекцию продуцентов [23, 24].

Количественный анализ метаболитов позволил изучить динамику их накопления в КЖ S. cirsii S-47 при культивировании в лабораторном ферментере, а также оценить фитотоксическую и антимикробную активности в процессе роста. Показано, что стагонолид А накапливался на 4–5 сут ферментации (выход 48–116 мг/л), а затем продуцент, по-видимому, переводил его в менее токсичное соединение – гербарумин I (выход 37–116 мг/л). Для препаративного выделения фитотоксинов, образуемых S. cirsii, необходим мониторинг их содержания в КЖ методом ВЭЖХ, поскольку трансформация соединений происходила быстро – в течение 1–2 сут.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 16-16-00085).

Авторы благодарят сотрудников лаборатории молекулярного моделирования НИИ гигиены, профпатологии и экологии человека ФМБА России Д.М. Кочуру, Л.С. Чистого за спектральный анализ веществ, а также М.Ю. Белозерову (ВИЗР) за помощь на начальных этапах исследования.