Прикладная биохимия и микробиология, 2019, T. 55, № 6, стр. 578-585

МЕТОДИКА

Конструирование вектора для экспрессии ФЛА2. Для получения штамма-продуцента использовали ген фосфолипазы А2 Streptomyces violaceoruber, зарегистированный в GenBank (Sequence ID AY359866.1). В качестве штамма-реципиента были выбраны метилотрофные дрожжи P. pastoris. Экспрессионная система P. pastoris обладала рядом преимуществ: непатогенность, способность к быстрому росту клеток и получению высокой плотности биомассы при культивировании, наличие одного из самых сильных и регулируемых промоторов гена алкогольоксидазы (AOX1-промотор), способность к оптимальному гликозилированию многих белков и ферментов, наличие механизмов эффективной секреции продуцируемых белков в культуральную среду, низкая секреция протеаз и других собственных белков в культуральную среду и др. В качестве экспрессионного вектора для P. pastoris использовали pPICZalphaA (“Thermo Fisher Scientific”, США). Фрагмент ДНК, соответствующий гену ФЛА2 длиной 363 пар оснований, встраивали в pPICZalphaA по сайтам рестрикции EcoRI/SalI.

Трансформация гена ФЛА2 в P. pastoris. Для генетической трансформации P. pastoris использовали штамм X-33 (“Thermo Fisher Scientific”, США). Культивирование дрожжей проводили на жидкой питательной среде YPD (пептон – 2%, глюкоза – 2%, дрожжевой экстракт – 1%) до OП₆₀₀ 1.4. Трансформацию P. pastoris проводили вектором pPICZα-ФЛА2, предварительно линеаризованным по сайту рестрикции BstXI методом электропорации (Micropulser, “Bio-Rad”, кюветы 0.2 см). Трансформация была проведена по описанной в работе [8] методике.

Культивирование трансформантов. Культивирование трансформантов проводили в ферментере Biostat B+ (“Sartorius”, Германия) общий объем 6.6 л, рабочий объем 0.4-5.0 л при 30°С и скорости подачи воздуха – 6 л/мин до достижения концентрации биомассы 220 г/л; далее температуру снижали до 20°С и культивировали клетки в течении 100 ч.

Выделение и очистка ФЛА2. По окончании культивирования клетки осаждали центрифугированием при 16 000 g в течение 10 мин при охлаждении до 4°С. Культуральную жидкость концентрировали с использованием мембраны тангенциальной фильтрации Midikros 10 кДa (“VWR”, США).

На следующем этапе для оптимизации очистки рекомбинантной ФЛА2 тестировали различные методы ионнообменной хроматографии. Катион-обменную хроматографию проводили на колонке с Sepharose SP Fast Flow (“GE Healthcare”, США) объемом 5 мл при скорости потока 1 мл/мин. Элюцию осуществляли 0.01 M раствором цитрата натрия в градиенте NaCl от 0 до 1.0 М. Для оптимизации условий разделения при использовании катион-обменной хроматографии pH варьировали в пределах 4.0–5.2. Анион-обменную хроматографию проводили на колонке HiTrap Q XL (“GE Healthcare”, США) объемом 5 мл при скорости потока 1 мл/мин. В качестве элюента использовали 0.05 M трис-HCl буфер pH 8.0 в градиенте NaCl от 0 до 1.0 М.

На последнем этапе очистки и для концентрирования рекомбинантной ФЛА2 использовали гидрофобную хроматографию на колонке с Butyl-Sepharose Fast Flow (Flow (“GE Healthcare”, США) объемом 5 мл. ФЛА2 элюировали 50 мМ трис-HCl буфером, pH-8.0 в градиенте NaCl от 3.0 до 0 М при скорости потока 1 мл/мин.

Определение фосфолипазной активности. Фосфолипазную активность определяли согласно [11] с использованием флуоресцентного субстрата 1‑пальминтоил-2-(10-пиренилдеканоил)-sn-глицеро-3-фосфорилхолина (10-pyrene PC, “Molecular Рrobes”, Голландия). Для измерения флуоресценции к 1 мл 50 мМ трис-HCl буфера, pH–7.5, содержащего 100 мМ NaCl и 1.0 мМ ЭДТА, добавляли 10 мкл субстрата (конечная концентрация 2 мкМ), 10 мкл 10%-ного раствора БСА (конечная концентрация 0.1%), и 6 мкл 1 M CaCl₂ (конечная концентрация 6 мМ). Реакцию инициировали добавлением 5 мкл раствора ФЛА2 с концентрацией 0.5 мг/мл. В качестве положительного контроля использовали кислую ФЛА2 СM2 из яда кобры (Naja kaouthia). Флуоресценцию измеряли на флуоресцентном спектрофотометре Fluoromax-4 (“Horiba Scientfic”, Великобритания) (λex_макс = 345 нм, λeм_мaкс = 395 нм).

Активность фосфолипазы А2 рассчитывали по формуле A = 2 × 10^–4 (S – S₀)V/F_макс и приводили в мг белка, где S – увеличение интенсивности флуоресценции за 1 мин в присутствии фосфолипазы; S₀ – увеличение интенсивности флуоресценции в минуту в контроле; V – объем добавляемого 0.2 мМ 10-pyrene PC, мкл; F_макс – максимальная интенсивность флуоресценции при добавлении 5 мкг кислой ФЛА2 СM2 из яда кобры (N. kaouthia). За единицу стандартной активности принимали количество фермента, которое катализирует превращение одного микромоля субстрата в минуту при стандартных условиях (оптимум рН, избыток субстрата, температура 25°С). Чувствительность определения позволяет измерять пикомоли фосфолипидов, гидролизованных за 1 мин. При данном способе измерения активность фосфолипазы остается пропорциональной концентрации фермента в течение трех порядков. Данный способ может быть использован для количественной оценки активности фосфолипазы в неочищенных экстрактах с низкой удельной активностью.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Полученный вектор pPICZα-ФЛА2 линеаризовали по сайту BstXI и проводили трансформацию компетентных клеток P. pastoris. В результате было отобрано 30 клонов с вектором pPICZalphaA-ФЛА2. Полученные клоны переносили на чашки YPD с зеоцином (200 мкг/мл). Отобранные клоны X-33 P. pastoris проверяли на наличие вставки методом ПЦР.

Для промышленного получения штамма-продуцента были подобраны оптимальные условия культивирования P. pastoris pPICZα-ФЛА2, что позволило получить высокие выходы фермента (20% по суммарному клеточному белку). Условия культивирования описаны в разделе “Методика”. Уровень удельной активности рекомбинантной ФЛА2 в культуральной жидкости составлял 1200 ед./мг.

Чрезвычайно важным параметром при проведении тангенциальной фильтрации является степень концентрирования. При превышении определенного уровня по степени концентрирования увеличивалось количество выпавшего целевого белка в осадок на фильтре. С целью установления оптимальной степени концентрирования была проведена серия экспериментов. Было найдено, что оптимальная степень концентрирования 4.5–5 раз.

В результате использования анионообменной хроматографии удалось достигнуть более высокой очистки, по сравнению с очисткой на катионитах. В процессе проведения двух стадий (анионной и гидрофобной) хроматографии удалось добиться значительной степени очистки ФЛA2 (90%).

После концентрирования при помощи тангенциальной фильтрации был получен раствор белка. Состав полученного белкового раствора был протестирован методом электрофореза в ПААГ по Лемли, использовали маркеры PageRuler™ Unstained Broad Range Protein Ladder (“Thermo Fisher Scientific”, США, рис. 1). По денситометрическому анализу данный препарат содержал большое количество белковых примесей (примерно 40–50% от тотального белка в растворе), а удельная активность ФЛА2 составляла 3000 ед./мг.

Рис. 1.

Электрофореграмма ФЛА2 после тангенциальной фильтрации. 1 – маркеры молекулярного веса, кДа; 2 – препарат фосфолипазы А2 после тангенциальной фильтрации. Полоса фосфолипазы А2 соответствует молекулярной массе в 14 кДа.

Для выделения целевого продукта ФЛA2 были протестированы два вида ионообменной хроматографии.

Первоначально для очистки ФЛА2 использовали катионообменную хроматографию (рис. 2). Для этого был проведен поиск оптимальных условий хроматографического разделения на катионном носителе Sepharose SP Fast Flow. Для оптимального разделения рассматривались элюирующие буферы 0.01 М цитрата натрия с pH в диапазоне от 4.0 до 5.2. На рис. 2а приведены хроматограмма в цитратном буфере при pH 5.2, а на рис. 2б –электрофореграмма профиля катионообменной хроматографии ФЛА2. Перед нанесением на хроматографическую колонку раствор ФЛА2, полученный после тангенсальной фильтрации, для снижения концентрации солей разбавляли в 50 раз 0.01 М буфером цитрата натрия рН 5.2 и фильтровали через фильтр Chromafil с порами 0.45 мкм (“Macherey-Nagel”, Германия). Оптимальные условия для разделения были достигнуты при уравновешивании колонки 0.01 M цитратом натрия, рН 5.2. Пробоподготовка ФЛА2 перед нанесением на хроматографическую колонку позволила получить незначительную очистку препарата (дорожки 1 и 2 на рис. 2б). Однако, проведенная хроматография оказалась не эффективной. Часть белка при разделении не адсорбировалась на колонке (дорожка 4 на рис. 2б), а другая часть распределялась по профилю элюции (дорожки 5–10 на рис. 2б).

Рис. 2.

Хроматографическая очистка ФЛА2 на сорбенте Sepharose SP Fast Flow (а) и электрофореграмма фракций по ходу очистки (б). 1 – препарат ФЛА2 после тангенциальной фильтрации, 2 – препарат ФЛА2 перед нанесением на колонку с Sepharose SP Fast Flow, 3 – маркеры молекулярного веса, кДа; 4 – не адсорбировавшаяся фракция, сошедшая с колонки с 3 по 12 мл; 5–10 – фракции, сошедшие с колонки в 15, 17, 19, 21, 23, 25 мл хроматографии соответственно. Полоса фосфолипазы А2 соответствует молекулярной массе в 14 кДа. Стрелки 1 и 2 указывают на профиль хроматографии и градиент NaCl соответственно.

Анионообменную хроматографию проводили на сорбенте Sepharose Q Fast Flow (рис. 3). Полученный после тангенциальной фильтрации раствор ФЛА2 для снижения концентрации солей разбавляли 50-кратным объемом буфера 20 мМ Tрис-HCl pH 8.0, фильтровали через фильтр Chromafil с порами 0.45 мкм и наносили на хроматографическую колонку Sepharose Q Fast Flow. Элюцию проводили 20 мМ Tрис-HCl, pH 8.0, в градиенте 0-1 М NaCl (рис. 3а). Хроматографические фракции были анализировали методом электрофореза в ПААГ по Лемли. Электрофоретический анализ показал, что целевой продукт ФЛА2 выходил с колонки в не адсорбировавшихся фракциях, при этом другие белковые примеси адсорбировались на колонке. С целью оптимизации протокола очистки на анионообменной смоле были протестированы варианты с уменьшением кратности разведения раствора ФЛА2 после тангенциальной фильтрации. Показано, что при 10-кратном разбавлении раствора фосфолипазы А2 целевой продукт по-прежнему не адсорбировался на сорбенте Sepharose Q Fast Flow, а другие белковые примеси сорбировались на нем. В отличии от пробоподготовки перед катионообменной хроматографией пробоподготовка в данном случае не дала дополнительной очистки (дорожки 2 и 3 на рис. 3б). Чистота фракции после анионообменной хроматографии была ~80% по белку ФЛА2 (рис. 3), а удельная активность составила 4400 ед./мг.

Рис. 3.

Хроматографическая очистка ФЛА2 на колонке с Sepharose Q Fast Flow (а) и электрофореграммы фракций (б, в). 1, 5 – маркеры молекулярного веса, кДа; 2 – препарат ФЛА2 после тангенциальной фильтрации; 3 – препарат ФЛА2 перед нанесением на колонку Sepharose Q Fast Flow, 4 – не адсорбировавшаяся фракция с 20 по 70 мл; 6–8 – фракции, вышедшие в 100, 110 и 115 мл. Полоса фосфолипазы А2 соответствует молекулярной массе в 14 кДа. 1, 2 – профиль элюции белка и градиент NaCl соответственно.

С помощью анионообменной хроматографии фермент ФЛА2 удалось отделить от большинства белковых примесей. Однако, оставалась белковая примесь с молекулярной массой 27 кДа. Присутствующая примесь в области 27 кДа могла быть димером фосфолипазы А2 [12]. Для концентрирования и дополнительной очистки препарата ФЛА2 проводили хроматографию гидрофобных взаимодействий. В качестве сорбента была использована хроматографическая смола Butyl-Sepharose Fast Flow. К не адсорбировавшейся фракции после анионообменной хроматографии добавляли сухой хлорид натрия до концентрации 3.0 M и наносили на хроматографическую колонку при скорости потока 1 мл/мин. Элюцию проводили 20 мМ Tрис-HCl, pH 8.0, понижая содержание NaCl (рис. 4а). Собранные фракции анализировали методом электрофореза в ПААГ по Лемли (рис. 4б, 4в). Фракции, выходившие с колонки в объеме 65–75 мл, содержали высокоочищенный препарат ФЛА2 (рис. 4, табл. 1).

Рис. 4.

Хроматографическая очистка препарата ФЛА2 на сорбенте Butyl-Sepharose Fast Flow (а) электрофореграммы фракций после гидрофобной хроматографии (б и в). 1 – препарат ФЛА2 перед нанесением на колонку с Butyl-Sepharose Fast Flow; 2,4 маркеры молекулярного веса, кДа; 3 – не адсорбировавшаяся фракция – 10–32 мл; 5, 6 – фракции с колонки в 65 и 70 мл соответственно. Полоса фосфолипазы А2 соответствует молекулярной массе в 14 кДа. 1, 2 – профиль элюции белка и градиент NaCl соответственно.

Гидрофобная хроматография позволила избавиться от подавляющего большинства белковых примесей, добиться высокой (~90% по данным денситометрического анализа) степени очистки, а также сконцентрировать образец. После проведения очистки удельная активность раствора содержащего фосфолипазу А2 составила 4900 ед./мг. В табл. 1 представлены этапы очистки ФЛА2 и активности препарата фосолипазы А2 на различных этапах выделения.

Для оценки стабильности разработанных протоколов выделения ФЛА2 была проведена проверка воспроизводимости методов хроматографического разделения ФЛА2 (рис. 5а и 5б). Полученные данные свидетельствуют о высокой стабильности результатов.

Рис. 5.

Воспроизводимость анионообменной хроматографии при очистке ФЛА2 на сорбенте HiTrap Q XL (а) и хроматографии гидрофобных взаимодействий на Butyl-Sepharose FF (б). 1, 2 – профиль элюции белка и градиент NaCl соответственно.

Раствор очищенного препарата фосфолипазы А2 обладал активностью не менее 14 тыс. ед./мл при чистоте по белку более 90%. По этим показателям наш препарат ФЛА2 превосходит все имеющиеся коммерческие препараты, а также аналитические препараты, полученные другими авторами, в том числе в P. Pastoris. Это дает основания полагать рациональным масштабирование данного метода получения фермента.

В работе представлен метод очистки рекомбинантной ФЛА2, включающий в себя концентрирование при тангенциальном фильтровании, отделение от большинства белковых примесей на сорбенте Sepharose Q Fast Flow и финальную доочистку, и концентрирование на сорбенте Butyl-Sepharose Fast Flow, позволяющий получать высокоочищенный фермент (~90%) с концентрацией не менее 2.5 мг/мл и удельной активностью 4900 ед./мг белка.

Полученные результаты воспроизводимости методов хроматографического разделения ФЛА2 дают основание считать разработанный протокол получения высокоочищенной ФЛА2 приемлемым для масштабирования.

Определение ферментативной активности ФЛА2 и культивирование P. pastoris были проведены при содействии сотрудников Центра коллективного пользования " ФИЦ Биотехнологии" РАН.

Результаты получены при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации в рамках выполнения работ по соглашению от 31.05.2018 г. № 14.607.21.0207 (УИН RFMEFI60718X0207), ФЦП “Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 – 2020 годы”.