1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Прикладная биохимия и микробиология
  4. T. 55, № 5, 2019

Прикладная биохимия и микробиология, 2019, T. 55, № 5, стр. 471-480

Особенности хроматографической очистки и протективности изоформ LcrV Yersinia pestis

П. Х. Копылов 1, *, Т. Э. Светоч 1, С. А. Иванов 1, Т. И. Комбарова 1, О. Н. Перовская 1, Г. М. Титарева 1, А. П. Анисимов 1

1 Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
142279 Оболенск, Россия

* E-mail: pkopylov@obolensk.org

Поступила в редакцию 19.07.2018
После доработки 16.11.2018
Принята к публикации 22.04.2019

Полный текст (PDF)

Аннотация

В результате хроматографической очистки получены электрофоретически гомогенные высокоочищенные препараты различных изоформ иммунодоминантного антигена V (белка LcrV) Yersinia pestis. Отмечено существенное сходство хроматографичеких профилей изоформ антигена LcrV различных штаммов с остатками триптофана (W113) и глутаминовой кислоты (E113) в положении 113, которые отличались от профиля изоформы, содержавшей в этом положении остаток глицина LcrV(G113). Последняя характеризовалась наибольшей антигенной и протективной активностью по сравнению с другими изоформами белка. Эта изоформа практически полностью защищала иммунизированную группу животных и обладала наибольшей способностью индуцировать продукцию антител, титры которых достигали значения 1 : 250000.

Ключевые слова: Yersinia pestis, чумная вакцина, V антиген, LcrV, хроматографическая очистка, протективность

Антиген V (белок LcrV1, low calcium response virulence), который является одним из основных факторов патогенности Yersinia pestis, а также защитным компонентом чумных вакцин, представлен несколькими изоформами. Из них изучена классическая изоформа штаммов подвида pestis, обладающих универсальной вирулентностью для широкого круга теплокровных животных. У ряда филогенетических групп условно патогенных для человека штаммов подвида microti продуцируются антигены, которые отличаются от классической изоформы белка одним или несколькими аминокислотными остатками. Значительные защитные свойства антигена V (LcrV) обусловили его включение в виде индивидуального или слитого белка в состав практически всех экспериментальных чумных субъединичных (химических и молекулярных) вакцин [1–5]. В ранних работах свойства этого белка изучали с использованием очищенных препаратов LcrV, полученных из таких источников, как супернатант культуральной жидкости после роста чумного микроба или цитоплазмы лизированных клеток йерсиний [6, 7]. Протеолитическая деградация затрудняет выделение белка из клеток самих йерсиний [8]. Протеолиза удалось избежать при клонировании LcrV в протеазодефицитных штаммах кишечной палочки Escherichia сoli BL 21, однако его очистка была многоэтапной, и выход целевого белка составлял не более 0.5% [9]. Для получения очищенных антигенов в одну стадию были разработаны методы очистки, основанные на его избирательном сродстве к хроматографическому сорбенту, что потребовало обязательного введения аффинной метки в полипептидную цепь. Так, на основе кишечной палочки были сконструированы продуценты LcrV, синтезирующие гибридный белок, содержащий полигистидиновый якорь или глютатион S-трансферазу, которые позволяли выделять химерный белок с помощью аффинной хроматографии из культуральной жидкости клеток E. coli в один этап [10–12]. Аффинные метки, обладающие высоким сродством к сорбенту, способствовали избирательному извлечению целевого продукта из сложной смеси белков. Выход LcrV определялся количеством вновь синтезированного антигена, содержание которого в исходном материале часто превышало 30%, Так, из 10 г влажного осадка клеток получали десятки миллиграммов очищенного гибридного белка, при этом потери при хроматографии имели второстепенное значение. Однако рекомбинантные белки использовались после отщепления аффинных групп. Это требовало применения дополнительных стадий очистки от продуктов протеолиза. Разработка способов получения LcrV включало наработку клетками E. coli белка, не содержащего аффинных групп [10, 11], и последующее применение простых методов выделения, обеспечивающих необходимую чистоту и количество антигена [13–15].

Цель работы – оптимизировать метод препаративного выделения известных изоформ LcrV (K18, K72, E103, W113, S273 и S324–G325–K326), (N18, R72, E103, W113, S273 и R324), (N18, R72, G103, W113, S273 и R324), (N18, R72, E103, E113, S273 и S324–G325–K326) и (N18, R72, E103, G113, S273 и S324–G325–K326) и определить их защитную активность по отношению к штамму дикого типа основного подвида [16–18].

МЕТОДИКА

Реактивы. Использовали реактивы для электрофореза, гель гидроокиси алюминия для иммунизации животных, желатину кожи арктических рыб (“Sigma-Aldrich”, США), белки-маркеры для электрофореза и питательную среду Луриа–Бертани (LB, “Thermo Fisher Scientific”, США), соли, HCl, H2SO4, органические компоненты буферных растворов (“Fluka”, Германия) и “Реахим” (Россия), хроматографические сорбенты Toyopearl HW-40F, Toyopearl DEAE-650M и фенил-сефароза “Tosoh Bioscience”, Германия и “GE Healthcare Biosciences”, США). Использовали также конъюгат антимышиных антител овцы с пероксидазой хрена (“GE Healthcare Biosciences”, США).

Штаммы микроорганизмов. Использованные в работе штаммы микроорганизмов получены в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов (ГНЦ ПМБ, Оболенск, Россия).

Культивирование микроорганизмов. Глубинное культивирование продуцентов изоформ LcrV проводили на платформе с амплитудой 55 мм и частотой оборотов 180 мин–1, что обеспечивало массообмен в области 200 ч–1. В качалочные колбы емкостью 0.75 л вносили 0.1–0.2 л питательной среды. Культивирование проводили также в лабораторном ферментере (“New Brunsweek Scientific Co.”, США) с рабочим объемом 2 л при 37°C, скорости подачи воздуха 2 л/мин, частоте вращения мешалки 600–800 об/мин и массообмене до 300 ч–1. Культуры E. coli выращивали в жидкой аэрируемой среде LB, содержащей соответствующие антибиотики: ампициллин (100 мг/л), хлорамфеникол (20 мг/л), тетрациклин (40 мг/л) и канамицин (40 мг/л) для роста клеток с рекомбинантными плазмидами.

Лизис микробных клеток. Микробные клетки отделяли центрифугированием при 7000 g в течение 10 мин при 4°С, осадок диспергировали в десятикратном (вес/объем) избытке 20 мМ трис-HCl буфера, рН 7.5. Для лизиса ультразвуком применяли дезинтегратор (“Bandelin”, Германия) с мощностью, ограниченной до 40% от максимальной. Дискретную обработку суспензии вели на льду импульсами ультразвука в течение 10 с с паузами 15 с до величины затраченной энергии 36–38 кдж, затем центрифугировали клеточный лизат при 15 000 g в течение 25 мин и надосадочную жидкость фильтровали через мембрану с порами 0.45 мкм.

Выделение и очистка антигенов V. Фильтрат пропускали через колонку XK50/40, наполненную 600 мл Toyopearl HW-40F, предварительно уравновешенный 20 мМ трис-HCl буфером, pH 8.0, содержащим 1 мМ ЭДТА, (ТЕ, буфер А). Фракции, элюирующиеся после свободного объема колонки, содержали изоформы LcrV. Эти фракции наносили на колонку XK50/20, наполненную 200 мл Toyopearl DEAE-650M. Не связавшиеся белки удаляли, промывая колонку буфером А, и элюировали фракции, содержащие LcrV, ступенчатым градиентом хлористого натрия в том же буфере. Фракции с наибольшим содержанием целевого белка смешивали с эквивалентными объемами 1 М сернокислого аммония и инкубировали в течение 18 ч при 10°С, после чего центрифугировали при 20°С. Фильтрат наносили на колонку XK26/20, наполненную 80 мл фенил-сефарозы, предварительно уравновешенной буфером А, содержащим 0.5 М сернокислый аммоний. Элюировали белки при комнатной температуре. Сначала балластные белки удаляли тем же буфером, а затем фракции LcrV элюировали нисходящим ступенчатым градиентом сернокислого аммония.

Определение антигенов V в хроматографических фракциях. В полученных хроматографических фракциях определяли концентрацию общего белка по методу Лоури, а белки в них анализировали электрофоретически в 12.5%-ном полиакриламидном геле в присутствии ДДС-Na по методу Лэммли с последующим окрашиванием гелей Кумасси G 250. Цифровые изображения гелей (8-бит по серой шкале, разрешение 300 dpi) получали в проходящем свете на устройстве для гель-документации (“Vilber-Lourmat”, Франция). Электрофоретические дорожки анализируемых образцов обрабатывали с использованием программных инструментов “GelAnalyzer-2010” (США), определяя площади пиков, соответствующие окрашенным белковым компонентам LcrV, примесям и белкам известной концентрации (БСА). Для построения профилей элюции использовали нормированные количества белка в различных элюатах при анионообменной или гидрофобной хроматографии по отношению к его содержанию в соответствующих исходных фракциях, нанесенных на сорбенты. В расчетах учитывали объемы фракций и результаты определения белка по методу Лоури.

Лабораторные животные. Использовали мышей линии BALB/ 8–10 нед возраста и среднего веса (19 ± 2) г из вивария ГНЦ ПМБ. Работы с животными проводили в соответствии с законодательством Российской Федерации и Директивой европейского парламента и совета европейского союза по охране животных, используемых в научных целях [19]. Содержание и манипуляции с животными выполняли в виварии, соответствующем требованиям GAC (Good Animal Care) и протоколом комитета по биоэтике (разрешение № ВП-2016/1) ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии.

Препараты изоформ LcrV и иммунизация мышей. Мышей делили на группы по 5 особей случайным образом и иммунизировали различными монопрепаратами LcrV подкожно в объеме 0.2 мл в нулевое время и через 30 сут. Монопрепараты для иммунизации получали сорбцией индивидуальных белковых антигенов LcrV на геле гидроокиси алюминия. Компоненты подбирали таким образом, чтобы в одной иммунизирующей дозе суспензии объемом 0.2 мл гидроокись алюминия содержала 10 мкг сорбированного белка. Контрольной группе животных вводили только гель гидроокиси алюминия. Термостабильные составляющие препаратов, включающие гидроокись алюминия, деионизованную воду и фосфатно-солевой буфер, рН 7.2, предварительно стерилизовали автоклавированием, растворы LcrV фильтровали через стерильные мембраны с порами 0.22 мкм, а затем в асептических условиях готовили препараты различных LcrV. Кровь иммуннизированных и контрольных мышей в объеме 40–50 мкл забирали из ретроорбитального синуса на 62 сут.

Защитная активность изоформ LcrV. Группы иммунизированных мышей заражали на 64 сут подкожным введением в верхнюю треть левого бедра 0.2 мл 2-суточной бактериальной культуры вирулентного штамма Y. pestis 231 (от 10 до 107 КОЕ, выросших при высеве на плотную питательную среду, на одно животное), разведенной в 10 раз 0.9%-ным раствором NaCl. За зараженными животными наблюдали в течение 21 сут с ежедневной фиксацией погибших. Павших животных вскрывали для проведения микробиологического подтверждения причин гибели. Вычисление величин LD50 и доверительного интервала (для вероятности 95%) проводили по методу Кэрбер в модификации И.П. Ашмарина и А.А. Воробьева [20]. Для сравнения кривых выживания зараженных иммунных мышей использовали логарифмический ранговый критерий Мантела-Кокса, различия признавались достоверными при величине Р < 0.05 [21]. Напряженность иммунитета выражали отношением LD50 для животных, иммунизированных изоформами LcrV к LD50 для интактных животных. Статистический анализ результатов проводили программой “Prism”, версия 7.0.

Иммуноферментный анализ. В лунки микропланшетов (“Greiner Bio-One”, Австрия) вносили по 100 мкл (600 нг) растворов изоформ LcrV в 0.1 M карбонат-бикарбонатном буфере, pH 9.6, и сорбировали антигены в течение ночи при 4°C. Вероятное проявление неспецифического связывания подавляли 3–4%-ным раствором желатины кожи арктических рыб, не образующей гель при температуре около 0°С. Раствор готовили в 10 мМ фосфатно-солевом буфере, рН 7.2, содержащим 150 мМ NaCl и 0.05% твин-20 (ФСБТ), и использовали этот буфер на этапах промывания микропланшетов, а также для разведения иммунных сывороток и конъюгата. Серийные разведения мышиных сывороток с шагом 2.5 готовили в специальных полипропиленовых титр-пробирках (“SSI”, США) емкостью 1.2 мл. Антитела, специфически связавшиеся с изоформами LcrV, выявляли конъюгатом антимышиных антител овцы с пероксидазой хрена в разведении 1 : 6000. Непосредственно перед использованием готовили 50 мМ цитрат-фосфатный буфер, рН 5.0, содержащий 0.04%-ный раствор хромогена ортофенилендиамина и 0.012%-ный раствор пероксида водорода. Развитие окраски останавливали добавлением в лунки по 100 мкл 1 М серной кислоты. Проводку и фотометрию микропланшет при 450 нм осуществляли роботизированной системой “Evolis Twin Plus” (“Bio-Rad”, США). Продолжительность инкубации микропланшет на этапах сенсибилизации антигенами и с иммунными сыворотками составляла 16 ч при 4°C, блокировку проводили в течение 3 ч, обработку конъюгатом – 1.5 ч при 37°C. Титром антител считали величину наибольшего разведения иммунной сыворотки, которой соответствовала оптическая плотность раствора (ОП), превосходящая контрольное значение на 0.1 единицы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для экспрессии изоформ LcrV использовали штаммы микроорганизмов, приведенные в табл. 1. Изоформы LcrV, секретируемые клетками каждого из приведенных штаммов очищали не менее трех раз, начиная с этапа культивирования микроорганизмов, что позволило представить статистически обработанные результаты хроматографии, включающие 34 эксперимента. Хроматографию проводили по одинаковой схеме, состоявшей из трех этапов. На подготовительном этапе, который включал лизис микробных клеток и удаление нерастворимых компонентов, были получены бесклеточные фракции растворимых белков, содержащие вновь синтезированные клетками-продуцентами изоформы LcrV, которые можно было подвергнуть колоночной хроматографии. При лизисе клеточных суспензий ультразвуком выбирали такой режим обработки, при котором температура лизатов не превышала 12–15°С. При этом величина затраченной энергии составляла 36–38 кдж для объема клеточной суспензии около 115 ± 10 мл, приготовленного из 12–13 г влажной биомассы. Условия клеточного лизиса для каждого штамма предварительно контролировали под микроскопом и электрофорезом в ПААГ с Na-ДCC. Все суспензии микробных клеток готовили с таким избытком, чтобы после лизиса, удаления осадков центрифугированием и фильтрации надосадочного материала объем фильтрата для нанесения на колонку с Toyopearl HW-40F составлял примерно 100 мл (табл. 2). Выбор Toyopearl HW-40 для гель-проникающей хроматографии был обусловлен, в первую очередь, высокой скоростью потока элюента и низкой кратностью разбавления надосадочной жидкости после лизиса, а также величиной предела исключения сорбента для глобулярных белков (10 кДа). Это позволяло в течение 1 ч получать фракцию, которую можно было подвергнуть анионообменной хроматографии. Картина гель-проникающей хроматографии оказалась одинаковой для всех штаммов. В ней присутствовал основной пик, содержащий антиген V, который элюировался сразу после свободного объема колонки (200 мл). Присутствие изоформ LcrV предварительно подтверждали ДДС-ПААГ.

Таблица 1.  

Характеристика использованных в работе штаммов микроорганизмов

Штамм Характеристика
Escherichia coli
из коллекции ГКПМ “Оболенск”
BL21(DE3)/pETV EV Продуцент LcrV (K18, K72, E103, W113, S273 и S324–G325–K326)
BL21(DE3)/pETV A1728 Продуцент LcrV (N18, R72, E103, W113, S273 и R324)
BL21(DE3)/pETV C582 Продуцент LcrV (N18, R72, G103, W113, S273 и R324)
BL21(DE3)/pETV I2359 Продуцент LcrV (N18, R72, E103, E113, S273 и S324–G325–K326)
BL21(DE3)/pETV I3455 Продуцент LcrV (N18, R72, E103, G113, S273 и S324–G325–K326)
Y. pestis 231 pFra+ pCad+ pPst+, вирулентный
Таблица 2.  

Очистка изоформ рекомбинантных антигенов LcrV из клеток штаммов E. coli BL21(DE3)

Этап выделения Плазмида Объем фракции, мл Концентрация общего белка, мг/мл Количество общего белка, мг Количество LcrV, мг Выход, %
Исходный клеточный лизат pETV EV 116 ± 10 9.5 ± 0.7 1055 ± 46 380 ± 35 100
pETV A1728 115 ± 4 12.2 ± 0.6 1380 ± 40 450 ± 29 100
pETV C582 112 ± 4 10.5 ± 0.4 1170 ± 27 300 ± 15 100
pETV I2359 112 ± 9 13.1 ± 0.9 1440 ± 50 455 ± 34 100
pETV I3455 112 ± 8 13.4 ± 0.4 1450 ± 33 575 ± 28 100
Toyopearl HW-40F pETV EV 200 ± 51 4.2 ± 0.9 850 ± 113 254 ± 82 67
pETV A1728 165 ± 32 5.0 ± 0.4 820 ± 45 322 ± 48 71
pETV C582 185 ± 28 4.4 ± 0.6 810 ± 19 240 ± 25 80
pETV I2359 150 ± 35 5.3 ± 0.8 790 ± 96 306 ± 34 67
pETV I3455 160 ± 26 5.8 ± 0.8 960 ± 87 417 ± 59 72
Toyopearl DEAE-650M pETV EV 382 ± 33 0.69 ± 0.09 265 ± 34 203 ± 14 53
pETV A1728 352 ± 42 0.76 ± 0.08 265 ± 26 190 ± 19 42
pETV C582 397 ± 28 0.69 ± 0.08 276 ± 31 189 ± 18 63
pETV I2359 405 ± 53 0.72 ± 0.10 290 ± 35 208 ± 56 45
pETV I3455 162 ± 29 0.43 ± 0.04 70 ± 13 45 ± 6 8
Фенил-сефароза pETV EV 104 ± 12 0.41 ± 0.06 43 ± 4 41 ± 6 10
pETV A1728 95 ± 15 0.62 ± 0.05 59 ± 7 57 ± 6 13
pETV C582 88 ± 14 0.57 ± 0.06 50 ± 7 48 ± 7 16
pETV I2359 98 ± 18 0.53 ± 0.08 52 ± 10 51 ± 8 11
pETV I3455 73 ± 8 0.09 ± 0.03 6.5 ± 1.5 6.2 ± 1.4 1.1

Установлено, что в исходных лизатах микробных клеток содержание изоформ LcrV в среднем составляло 33%. После гель-проникающей хроматографии бесклеточных фильтратов эта величина увеличивалась и достигала 36%, что, по-видимому, было обусловлено частичным удалением части нецелевых белков, молекулярная масса которых была ниже предела исключения сорбента (табл. 2). Высокая воспроизводимость результатов гель-проникающей хроматографии фильтратов различных штаммов обеспечила возможность использования второго этапа их очистки анионообменной хроматографией, в том числе тандемного характера. При этом объем наносимых на сорбенты фракций, содержащих целевые белки, находился в интервале от 1.15 до 1.25 от объема исходного фильтрата. Анионообменный сорбент промывали буфером А, а белки элюировали ступенчатым градиентом хлористого натрия в том же буфере, начиная с 40 мМ NaCl, с последующим удвоением его концентрации на каждой следующей ступени.

В препаративных масштабах использовали параметры этого ступенчатого градиента для выделения изоформ LcrV из клеток различных штаммов. Во фракции, которые элюировались 40 и 80 мМ NaCl, сразу добавляли при перемешивании эквивалентный объем 1.0 М сернокислого аммония в буфере А и инкубировали в течение ночи при 6°С. Фракцию с максимальным содержанием целевого белка определяли по результатам ДДС-ПААГ. На этом этапе выход изоформ LcrV (W113) и LcrV (E113) во фракциях, содержащих 40 мМ NaCl, составлял в среднем 51%, в то время как наибольшее относительное содержание изоформы LcrV (G113) во фракции элюата, содержащих 80 мМ NaCl, достигало только 8% (табл. 2). При хранении фракций на холоду даже в течение 3–4 сут не отмечали значительного уменьшения доли изоформ LcrV. Вместе с тем наблюдали осаждение некоторой части балластных белков. Результаты анионообменной хроматографии представлены на рис. 1а, 1в и 1г, гидрофобной хроматографии – на рис. 1б, 1г и 1е. Результаты показали существенное совпадение профилей элюции, а также распределения антигенов V во фракциях, полученных при использовании этих видов хроматографии. Это видно, в частности для белков, содержащих остаток триптофана (W113) или глютаминовой кислоты (E113) в положении 113 аминокислотной последовательности LcrV (рис. 1а и 1в, рис. 1б и 1г). Практически отсутствовали достоверные различия в содержании общего белка и антигенов V в полученных фракциях, а наибольшее количество целевого белка (превосходящее 60%) было обнаружено во фракциях, которые элюировались 40 мМ хлористым натрием. Эти фракции использовали для гидрофобной хроматографии LcrV (W113) и LcrV (E113). В отличие от белков, содержащих остаток триптофана (W113) или глютаминовой кислоты (E113), профиль элюции LcrV (G113), содержащего в этом положении остаток глицина, существенно отличался (рис. 1д и 1е). При анионообменной хроматографии наибольшее количество белка LcrV (G113) было обнаружено во фракции, которая элюировалась буфером с самой высокой ионной силой (500 мМ NaCl) и которая была значительно контаминирована нецелевыми белками E. coli. Поэтому, для следующего этапа очистки этой изоформы LcrV использовали фракцию, элюировавшуюся 80 мМ NaCl. При этом принимали во внимание то, что в этой фракции присутствовало наивысшее относительное содержание LcrV (G113).

Рис. 1.

Процентное содержание изоформ LcrV (1) и примесных белков (2) во фракциях при их анионообменной (а, в, г) и гидрофобной (б, г, е) хроматографии: W113 (а, б), E113 (в, г), G113 (д, е).

Таким образом, все высокоочищенные белки были получены после завершающей гидрофобной хроматографии на фенил-сефарозе по трехэтапной схеме (рис. 2). При гидрофобной хроматографии нисходящим линейным градиентом сернокислого амммония удалось элюировать основную часть антигена V низкими концентрациями соли, в основном менее 100 мМ. Наиболее высокой степени отделения примесей от чистого целевого белка достигали в том случае, когда на каждой ступени градиента концентрацию сернокислого аммония уменьшали на один порядок, начиная со значения 100 мМ (рис. 1). В области его низких концентраций проявлялось такое преимущество ступенчатого градиента, как отсутствие ограничения по объему элюента, при этом достигались не только исчерпывающая промывка сорбента, но и снижение количества примесей. В этих условиях высокочистые белки LcrV (W113) и LcrV (E113) элюировали 10 мМ сернокислым аммонием, а для LcrV (G113) концентрация соли в элюенте должна быть в 10 раз меньше. Замещенные в положении 113 изоформы LcrV различными остатками вели себя при гидрофобной хроматографии не одинаково. Так, по мере снижения концентрации сернокислого аммония от 100 до 1.0 мМ относительное содержание изоформы LcrV (W113) во фракциях уменьшалось, а изоформы LcrV (E113) оставалось примерно на одном уровне, в то время как количество изоформы LcrV (G113) в этих же условиях достоверно возрастало и достигало наибольшей величины во фракции “ТЕ”, в которой отсутствовал сернокислый аммоний (рис. 1б, 1г и 1е).

Рис. 2.

ДДС-ПААГ электрофорез очищенных изоформ LcrV(W113)/pETV A1728 (2), LcrV(W113)/pETV C582 (3), LcrV(W113)/pETV EV (4), LcrV(E113)/pETV I2359 (5) и LcrV(G113)/pETV I3455LcrV (6), продуцируемых штаммами E. сoli; 1 – белки-маркеры молекулярных масс (“Bio-Rad”, США).

При гидрофобной хроматографии профили элюции белков LcrV (W113) и LcrV (E113) были подобны. Основное количество этих изоформ находилось во фракциях, в которых концентрация сернокислого аммония убывала от 100 до 1.0 мМ, в то время как для LcrV (G113) этот интервал лежал в области 0.1 мМ – ТЕ. Практически совпали профили анионообменной хроматографии LcrV (W113) и LcrV (E113), а основную часть этих изоформ обнаружили во фракциях, элюировашихся 40 мМ NaCl, причем содержание этих белков более чем в 3 раза превышало их содержание в смежных фракциях. Ранее было отмечено, что замена остатка триптофана на остаток глутаминовой кислоты увеличивала потенциал перестройки гидрофобных связей вокруг Е113 и, соответственно локальной структуры изоформы белка LcrV (E113). Однако поведение этой изоформы при анионообменной хроматографии свидетельствовало о том, что, в целом, возможная перестройка мало влияла на поверхностный заряд, несмотря на введение отрицательно заряженного аминокислотного остатка [15]. Этому соответствовало нахождению главных фракций изоформ LcrV (W113) и LcrV (E113) в одной области концентрации NaCl, равной 40 мМ, что, по-видимому, могло отражать сходство их поверхностных зарядов, определяющее условия связывания с анионообменником. Напротив, появление глицина в изоформе LcrV (G113) усиливало связывание целевого белка с анионообменником, поэтому половина его количества находилась во фракции, элюировавшейся 500 мМ NaCl. Остальная часть этой изоформы была монотонно распределена по хроматографическому профилю в интервале концентраций соли от 40 до 200 мМ. Отсутствие пика LcrV (G113) при элюции 40 мМ NaCl указывало на отличие его поверхностного заряда после перестройки структуры белка, у которого вместо остатка триптофана в положении 113 первичной последовательности оказался глицин. Таким образом, замена остатка триптофана (или глутаминовой кислоты) на глицин, не приносящий дополнительный заряд в молекулу белка, приводила к выраженным изменениям профиля элюции.

При гидрофобной хроматографии по мере уменьшения концентрации сернокислого аммония увеличивалось количество только изоформы LcrV (G113). Различные гидрофобные свойства изоформ LcrV и обусловили характер их профилей элюции при гидрофобной хроматографии. Совпадающие “гидрофобные” профили элюции LcrV (W113) и (E113) свидетельствовали в пользу того, что замена остатка триптофана на остаток глутаминовой кислоты не вызывала существенных изменений гидрофобной поверхности этих изоформ LcrV. В то же время появление в этом положении аминокислотной последовательности белка остатка глицина привело к переменам, которые проявились при гидрофобной хроматографии в идентичных условиях. Практически совпадающие профили элюции LcrV (W113) и LcrV (E113) с фенил-сефарозы показали, что большая часть этих целевых белков освобождалась с сорбента при концентрации сернокислого аммония от 100 до 1 мМ. Изоформа LcrV (G113) накапливалась во фракциях со следовыми концентрациями (менее 1.0 мМ) соли, что указывало на определенное усиление ее гидрофобности по сравнению с другими изоформами. Можно предположить, что это было следствием проявления различий гидрофобных областей изоформ LcrV, которые лежали в основе взаимодействия (удержания) молекул белка с гидрофобной матрицей при хроматографии и которые, в свою очередь, являлись следствием предполагаемой структурной перестройки. Введение остатка глицина, заменившего остаток триптофана или глутаминовой кислоты в положении 113 первичной аминокислотной последовательности, значительно снижало выход очищенной изоформы белка LcrV (G113) при использовании трехэтапной схемы колоночной хроматографии (табл. 2). Если выход изоформ LcrV (W113) и LcrV (E113) составил в среднем 12.5%, то для LcrV (G113) только 1.1%, при этом содержание целевых белков во всех полученных препаратах находилось в пределах 95–97% (рис. 2).

В предыдущей работе [22] было показано, что основные полиморфные типы аминокислотных последовательностей содержали “горячие точки” замен аминокислотных остатков, которые, как было обнаружено при моделировании трехмерной структуры белка LcrV, локализовались в составе “альфа” домена N-концевого участка (аминокислотные остатки 1-146). В настоящей работе были использованы представители пяти основных изоформ LcrV, у которых присутствовали замены в этой области, а в некоторых из них – замены остатков серина на остатки аргинина в положении 324, и представляли собой несколько укороченные последовательности, утратившие С-концевые аминокислотные остатки G325–K326 (табл. 1). Принимая во внимание высокую степень подобия представленных хроматографических свойств изоформ LcrV (W113) и LcrV (E113), можно заключить, что замены различных аминокислотных остатков в положениях 18, 72, 103 и 324 и удаление остатков G325–K326 не оказывали влияния на характер их хроматографии. Существенное изменение хроматографических свойств изоформ антигена V было обнаружено после введения остатка глицина в положение 113 первичной аминокислотной последовательности LcrV.

Известно, что классическая изоформа LcrV (W113), используемая в качестве компонента прототипа субъединичной вакцины, вызывала развитие гуморального иммунитета к экспериментальной чумной инфекции, включающего выработку специфических антител [23]. Титры специфических IgG сывороток крови мышей, иммунизированных разными изоформами LcrV, найденные по результатам иммуноферментного анализа, показали, что самое высокое значение 1 : 250 000 вызывала изоформа белка LcrV (G113). В то же время титры изоформ LcrV (W113) и LcrV (E113) находились в интервале 1 : 16 000–1 : 25 000. Таким образом, эти изоформы обладали существенно меньшей способностью индуцировать продукцию антител. Структурные перестройки антигена, вызванные появлением глицина в положении 113 и обнаруженные при хроматографии изоформ LcrV, оказались значительными для развития существенного ответа и коррелировали с показателями защитных свойств изоформ (табл. 3). Подкожное введение и бустерная иммунизация препаратом V(G113)/I3455 обеспечивали полную защиту животных от заражения вирулентным штаммом Y. pestis 231 в дозах от 1 до 107 КОЕ. По сравнению с ним препараты LcrV (W113)/EV, LcrV (W113)/А1728, LcrV (W113)/С582 и LcrV (E113)/I2359 обладали значительно меньшей защищающей активностью. Показатели LD50 и напряженности иммунитета против вирулентного штамма Y. pestis 231 у мышей, иммунизированных последними препаратами, не превосходили соответствующие значения контрольной группы в отличие от тех, которые были вычислены для препарата LcrV (G113)/I3455 (табл. 3). Однако, анализ динамики гибели мышей в группах, иммунизированных препаратами изоформ LcrV, показал особенности защитного действия разнозамещенных антигенов. Гибель животных контрольной группы, иммунизированных гелем гидроокиси алюминия, наступала в зависимости от дозы заражающего агента в интервале от 3 до 6 сут. Препарат, содержащий LcrV (G113)/I3455 практически полностью защищал соответствующую группу животных, а эффект от других изоформ распределялся в области между контролем и последней группой и имел выраженную зависимость от доз Y. pestis 231 введенных подкожно (рис. 3). Использование логарифмического рангового теста Мантела-Кокса для анализа защитных свойств препаратов показало, что кривые смертности всех групп иммунизированных мышей достоверно отличались от контрольной группы, которая получала только гидроокись алюминия. Показатель Р характеризовался довольно монотонными значениями, которые свидетельствовали о достоверных отличиях от контроля для всех групп, и находился в интервале 0.0035–0.0050 (детальные данные не приводятся). Однако анализ данных о времени гибели мышей в группе иммунизированных LcrV (G113)/I3455, проведенный этим же методом, продемонстрировал подобие защитного действия классической формы LcrV(W113)/pETV EV и LcrV (G113)/I3455 при заражении дозами от 10 до 104 микробных клеток по сравнению с другими группами (табл. 4). Логично было отнести к совпадению пограничное значение показателя Р (0.0494*) при заражении групп мышей 102 и 103 КОЕ. Интересно, что при наименьшей заражающей дозе показатель Р для группы мышей иммунизированных LcrV(E113)/pETV I2359 превосходил величину 0.05, что свидетельствовало о защитном, хотя и незначительном действии этой изоформы LcrV. Изоформы LcrV(W113)/pETV A1728 и LcrV(W113)/pETV С582, несущие соответствующие замены аминокислотных остатков в положении 113 полипептидной цепи показали самые низкие защитные свойства по сравнению с LcrV (G113)/I3455 (табл. 4).

Таблица 3.  

Защитная активность изоформ рекомбинантного LcrV из клеток штаммов E. coli BL21(DE3)

Изоформы антигена LcrV/штамм E. coli BL21(DE3) LD50Y. pestis 231
для мышей, иммунизированных LcrV, КОЕ/мышь, среднее (интервал) 		Напряженность (индекс) иммунитета
LcrV(W113)/pETV EV 7 (1–20) 2.3
LcrV(W113)/pETV A1728 5 (1–19) 1.6
LcrV(W113)/pETV C582 15 (4–59) 5.0
LcrV(E113)/pETV I2359 15 (4–59) 5.0
LcrV(G113)/pETV I3455 1.7 × 106
(1.0 × 106–3.2 × 106) 		5.7 × 105
Контроль, Al(OH)3 3 (1–12) 1.0
Рис. 3.

Выживание мышей, иммунизированных очищенными белками изоформ LcrV(W113)/pETV A1728 (2), LcrV(W113)/pETV C582 (3), LcrV(W113)/pETV EV (4), LcrV(E113)/pETV I2359 (5) и LcrV(G113)/pETV I3455LcrV (6) из штаммов E. сoli после заражения дозами 10 (а), 102 (б), 103 (в), 104 (г), 105 (д) и 106 (е) КОЕ; Al(OH)3 (1 – контроль).

Таблица 4.  

Сравнительная оценка при помощи логарифмического рангового теста Мантела-Кокса*выживаемости зараженных мышей, иммунизированных различными изоформами LcrV, по сравнению с LcrV(G113)/pETV I3455

Заражающая доза вирулентного штамма Y. pestis 231, KOE Изоформы LcrV
(W113)/pETV EV (W113)/pETV A1728 (W113)/pETV C582 (E113)/pETV I2359
10 0.1343* 0.0013 0.0075 0.0786*
102 0.0494* 0.0014 0.0088 0.0012
103 0.0494* 0.0016 0.0086 0.0018
104 0.0511* 0.0012 0.0013 0.0014
105 0.0128 0.0075 0.0097 0.0089
106 0.0017 0.0023 0.0012 0.0011

* Кривые выживания совпадали, вычисленное значение р превышало величину 0.05.

Таким образом, немонотонное поведение изоформ LcrV, впервые обнаруженное при хроматографической очистке и обусловленное различиями первичных аминокислотных последовательностей белков природного классического белка штаммов подвидов pestis и microti, позволило обнаружить изоформу, проявляющую в качестве компонента субъединичных чумных вакцин очень высокую защищающую активность с высоким потенциалом [24].

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 14-15-00599).

Список литературы

  1. Williamson E.D., Flick-Smith H.C., LeButt C., Rowland C.A., Jones S.M., Waters E.L., Gwyther R.J., Miller J., Packer P.J., Irving M. // Infect. Immun. 2005. V. 73. № 6. P. 3598–3608.

  2. Cornelius C., Schneewind O., Anderson D., Quenee L. The Genus Yersinia. Advances in Experimental Medicine and Biology / Eds. Perry R.D., Fetherston J.D. N. Y.: Springer, 2007. V. 603. P. 415–424.

  3. Wang Z., Zhou L., Qi Z., Zhang Q., Dai R., Yang Y., Cui B., Wang H., Yang R., Wang X. // Clin. Vaccine Immun. 2010. V. 17. № 1. P. 199–201.

  4. Pouliot K., Pan N., Wang S., Lu S., Lien E., Gogu-en J.D. // Infect. Immun. 2007. V. 75. № 7. P. 3571–3580.

  5. Matteı P.J., Faudry E., Job V., Izore T., Attree I., Dessen A. // FEBS J. 2011. V. 278. № 3. P. 414–426.

  6. Lawton W.D., Erdman R.L., Surgalla M.J. // J. Immunol. 1963. V. 91. № 2. P. 179–184.

  7. Straley S.C., Brubaker R.R. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. V. 78. № 2. P. 1224–1228.

  8. Brubaker R.R., Sample A.K., Yu D.Z., Zahorchak R.J., Hu P.C., Fowler J.M. // Microb. Pathog. 1987. V. 2. № 1. P. 49–62.

  9. Motin V.L., Nakajima R., Smirnov G.B., Brubaker R.R. // Infect. Immun. 1994. V. 62. № 10. P. 4192–35804201.

  10. Leary S.E., Williamson E.D., Griffin K.F., Russell P., Eley S.M., Titball R.W. // Infect. Immun. 1995. V. 63. № 8. P. 2854–2858.

  11. Motin V.L., Nedialkov Y.A., Brubaker R.R. // Infect. Immun. 1996. V. 64. № 10. P. 4313–4318.

  12. Brubaker R.R. // Infect. Immun. 2003. V. 71. № 7. P. 3673–3681.

  13. Li J., Li B., Li G., Ren J., Zhang J., Xu C., Yang X., Liu S., Fu L., Chen W. // Protein Expr. Purif. 2008. V. 57. № 2. P. 136–142.

  14. Пaтeнт PФ. 2010. № 2439155 C1.

  15. Патент Великобритании. 2003. № 2197988 С2.

  16. Adair D.M., Worsham P.L., Hill K.K, Klevytska A.M., Jackson P.J., Friedlander A.M., Keim P. // J. Clin. M-icrobiol. 2000. V. 38. № 4. P. 1516–1519.

  17. Anisimov A.P., Lindler L.E., Pier G.B. // Clin. Microbiol. Rev. 2004. V. 17. № 2. P. 434–464.

  18. Anisimov A.P., Dentovskaya S.V., Svetoch T.E., Panfertsev E.A. The Genus Yersinia. Advances in Experimental Medicine and Biology Biology / Eds. Perry R.D., Fetherston J.D. N. Y.: Springer, 2007. V. 603. P. 23–27.

  19. Директива 2010/63/EU Европейского парламента и совета европейского союза по охране животных, используемых в научных целях. СПб.: Rus-LASA “НП объединение специалистов по работе с лабораторными животными”, 2010. 48 с.

  20. Ашмарин И.А., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Гос. изд-во. мед. лит., 1962. С. 85–104.

  21. Machin D., Cheung Y., Palmar M. Survival Analysis: A Practical Approach London: John Wiley & Son, Ltd. 2nd edition, 2006. 278 p.

  22. Anisimov A.P., Dentovskaya S.V., Panfertsev E.A., Svetoch T.E., Kopylov P. Kh., Segelke B.W., Zemla A., Telepnev M.V., Motin V.L. // Infect. Genet. Evol. 2010. V. 10. № 1. P. 137–145.

  23. Williamson E.D., Eley S.M., Stagg A.J., Green M., Russell P., Titball R.W. // Vaccine. 1997. V. 15. № 10. P. 1079–1084.

  24. Пaтeнт PФ. 2015. № 2671525.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Прикладная биохимия и микробиология

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал