Прикладная биохимия и микробиология, 2019, T. 55, № 3, стр. 264-270

МЕТОДИКА

Штаммы грибов и условия выращивания. Объектами исследования служили сибирские штаммы грибов рода Armillaria из коллекции чистых культур лаборатории лесных культур, микологии и фитопатологии Института леса им. В.Н. Сукачёва СО РАН (Россия), включающие − А. borealis Marxm и Korhonen 206г, 74г, 111 и D48/14, A. cepistipes Velen. 27D и 73/8, A. gallica Marxm. 6D и 22/12, A. ostoyae (Romagn.) Herink 26D и A. sinapina Bérubé и Dessur S3-16 и A2-16. Штаммы были изолированы из плодовых тел и базидиоспор Armillaria, а также из пораженной древесины, и выращены на селективных питательных средах методами, описанными в работах [6–8].

Видовая идентификация была установлена в результате скрещивания моноспоровых культур с тестерами европейских и китайских видов, а также подтверждена секвенированием участков генетических маркеров ITS и TEF-lalpha с использованием оборудования ЦКП “Инновационные технологии защиты растений” Всероссийского научно-исследовательского института защиты растений (Санкт-Петербург-Пушкин, Россия) и ЦКП “Геномика” Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск, Россия).

При изучении продукции вторичных метаболитов штаммы культивировали глубинно в колбах (750 мл) со 100 мл среды на шейкере (220 об/мин) в течение 21 сут при 24°С. При скрининге использовали синтетическую среду Норкранс (НРК), содержащую (г/л дистиллированной воды): глюкоза – 10.0, аммоний виннокислый – 1.0, K₂HPO₄ – 1.0, MgSO₄ ⋅ 7 H₂O – 0.5, железо лимоннокислое – 0.005, ZnSO₄ ⋅ 7 H₂O – 0.004, CaCl₂ – 0.056, тиамин – 0.04, рН 6.5 [9]. Для сравнения биосинтетической способности штаммов использовали органно-минеральную среду (2), содержащую (г/л дистиллированной воды): глюкозу – 10.0, пептон – 5.0, KH₂PO₄ – 0.3, MgSO₄ ⋅ 7 H₂O – 1.0), рН 5.6 [10], и глюкозо-картофельную среду (3). Среды засевали суспензией мицелия, снятого с 14-суточных культур, выращенных на скошенном МА.

Выделение, идентификация и количественное определение вторичных метаболитов. Вторичные метаболиты извлекали из фильтрата культуральной жидкости трехкратной экстракцией хлороформом при рН 3.0. Экстракты анализировали методом ТСХ на пластинках силикагеля Silica gel F₂₅₄ (“Merck”, Германия) в системах хлороформ-метанол-25%-ный аммиак (90 : 10 : 0.1) и хлороформ-ацетон (93 : 7). Метаболиты обнаруживали по поглощению и флуоресценции при 254 и 366 нм и после опрыскивания пластин 10%-ным раствором фосфорномолибденовой кислоты в этаноле и 5%-ным раствором FeCl₃ ⋅ 6 Н₂О в метаноле. Метаболиты выделяли с помощью препаративной ТСХ на пластинках силикагеля Silica gel F₂₅₄ (“Merck”, Германия) в системах растворителей. Идентификацию выделенных метаболитов осуществляли на основе сравнения данных УФ-спектроскопии и масс-спектрометрии с литературными источниками [11] и базами данных (http:// www.hmdb.ca/metabolites). Подробную информацию о структуре соединений получали при анализе МС/МС спектров при энергии коллизии 20–40%.

УФ-спектры соединений в метаноле получали на спектрофотометре UV-160А (“Shimadzu”, Япония). Масс-спектры соединений регистрировали на квадрупольном масс-спектрометре LCQ Advantage MAX (“Thermo Finnigan”, Германия), используя одноканальный шприцевой насос для прямого ввода образца в камеру для химической ионизации при атмосферном давлении.

Анализ суммарного содержания меллеолидов в экстрактах определяли полуколичественно с помощью ТСХ и спектрофотометрически в метаноле при 303 нм. Расчет проводили, используя коэффициент молярной экстинкции меллеолида С (ε = 6300) [11].

Определение фитотоксической и фитопатогенной активности. Фитотоксическую активность штаммов изучали стандартными методами [7], используя в качестве биотестов семена и проростки Picea abies и Abies sibirica. Фильтрат культуральной жидкости получали из 21-сут культур на среде НРК путем асептической фильтрации жидкости через мембранные фильтры с размерами пор 0.45 мкм (Владипор МФАС-ОС-2, Россия).

Фитопатогенность Armillaria оценивали на двух тест-объектах. При проведении 1 теста семена Picea abies проращивали на стерильной ватно-марлевой подложке, размещенной на слое частично прогруженной в среду НРК стерильной (контроль) щепы и щепы, предварительно инокулированной грибами Armillaria. Тест продолжался в течение 24 сут при 25°С и 12 ч фотопериоде. Для 2 теста семена Abies sibirica высевали в контейнеры на поверхность стерильного песка, размещенного над стерильной (контроль) и инокулированной Armillaria щепой. Растения инкубировали в течение 3 мес. при 25°С и 12 ч фотопериоде. Оценивали следующие основные показатели: энергию прорастания семян (%), лабораторную и грунтовую всхожесть семян (%), послевсходовую гибель сеянцев (%) и морфометрические показатели растений.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Скрининг вторичных метаболитов у штаммов Armillaria проводили на среде НРК, которая обычно применяется для выращивания базидиомицетов [9]. Он показал, что грибы видов A. borealis, A. cepistipes и A. sinapina синтезировали вторичные метаболиты, которые различались по хроматографической подвижности, поглощали УФ-свет и реагировали с 5%-ным раствором FeCl₃ в метаноле и 10%-ным раствором фосфорномолибденовой кислоты в этаноле. УФ-спектры выделенных соединений содержали максимальное значение полос поглощения при 216, 263 и 302–304 нм, что указывало на наличие общего структурного ядра в молекулах в виде гидроксилированного ароматического кольца. Все штаммы синтезировали метаболит 1, который образовывал молекулярный ион 447 [M-H]^–. В его МС/МС спектре наблюдали фрагментарный ион, который создавался при расщеплении сложной эфирной связи, что свидетельствовало о наличии 2-гидрокси-4-метокси-6-метилбензоата с m/z 181 [C₉H₉O₄]. У всех штаммов был обнаружен также метаболит 2, с молекулярным ионом 481 [M-H]^–, который содержал атом хлора с изотопным распределением интенсивностей 3 : 1. В МС/МС спектре метаболита 2 наблюдали фрагментный ион m/z 215, также содержащий атом хлора. Этот фрагмент соответствовал 3-хлоро-6-гидрокси-4-метокси-2-метилбензоату. На основе литературных данных эти метаболиты были идентифицированы как меллеолид С и его хлорпроизводное меллеолид D (рис. 1) [11].

Рис. 1.

Схема биосинтеза меллеолидов [13].

Другие штаммы, кроме A. borealis 111 и A. sinapina A2/16 синтезировали метаболиты 3 и 4 с молекулярными массами 432 и 466 Да, которые также давали фрагментарные ионы m/z 181 и m/z 215 соответственно. На основе базы данных эти метаболиты были идентифицированы как меллеолид В и его хлорпроизводное мелледонал В. У трех штаммов A. borealis 74г, 206г и D48/14 были обнаружены метаболиты 5 и 6 с массами 446 и 480 Да, идентифицированные как 5'-О-метилмелледонал и его хлорпроизводное мелледонал С (табл. 1). Штамм 74г синтезировал также метаболиты 7, 8 и 9 с молекулярными массами 430, 462 и 464 Да, которые соответствовали меллеолиду Н, 13-гидрокси-5'-О-метилмелледоналу и армилларинину (табл. 1). Следует отметить, что штамм 74г являлся наиболее активным продуцентом меллеолидов. У видов A. gallica и A. ostoyae не были обнаружены соединения, идентифицированные у других видов.

По структуре метаболиты, идентифицированные у видов A. borealis, A. cepistipes и A. sinapina, относились к группе трициклических сесквитерпеновых арильных эфиров − меллеолидов. Их отличительной особенностью являлось наличие протоилуденнового ядра, связанного эфирной связью с замещенным ароматическим кольцом орселиновой кислоты. Биосинтез прототоиллудена начинался с циклизации универсального предшественника сесквитерпеноидов – фарнезилдифосфата (рис. 1). Эта реакция катализируется протоиллуденсинтазой Pro 1 [12]. Продукт реакции 6-протоиллуден имел двойную связь между Δ^2,3 атомами углерода. Далее протоиллуден с помощью цитохром Р450-зависимой монооксигеназы изомеризовался в продукт с двойной связью между Δ^2,4 атомами углерода. В образовании орселиновой кислоты принимает участие синтаза орселиновой кислоты ArmB [13]. Известно, что у многих микроорганизмов в качестве вторичных метаболитов синтезируются орселиновая кислота и ее производные, а протоиллуданы встречаются у гомобазидиомицетов. Уникальная способность связывать эти два строительных блока посредством этерификации была обнаружена только у грибов рода Armillaria [14].

Комбинация таких биосинтетических процессов, как гидроксилирование в различных положениях сесквитерпена, окисление первичного спирта при С-1 до альдегида или карбоксильной группы, сдвиг или восстановление двойной связи циклогексена, образование метилового эфира при O-5' и хлорирование при С-6' приводит к образованию около 60 различающихся структурных вариантов молекул [2, 3].

Было обнаружено, что у всех сибирских штаммов видов A. borealis, A. cepistipes и A. sinapina преобладали меллеолид С и его хлорпроизводное меллеолид D, а остальные соединения присутствовали в незначительных количествах. Это совпадало с данными, полученными при изучении спектров меллеолидов у видов A. cepistipes, A. gallica, A. mellea и A. ostoyae, выделенных в Северной Америке и Западной Европе [3].

У сибирских изолятов были обнаружены штаммовые различия в спектре меллеолидов (табл. 2). Так, у трех из четырех изученных штаммов A. borealis спектр меллеолидов различался. Наиболее разнообразные по структуре соединения обнаружены у штамма A. borealis 74г. Отсутствие меллеолидов у изученных штаммов A. gallica и A. ostoyae, вероятно, связанно с трудностями их идентификации вследствие низкого уровня накопления в среде. Известно, что грибы этих видов синтезируют меллеолиды, но североамериканские штаммы A. ostoyae отличаются их низкой продукцией [3].

Изучение биосинтеза меллеолидов штаммами A. borealis 74г и D48/14 при росте на трех питательных средах показало, что состав среды влиял на количество синтезированных метаболитов. Их концентрация на органоминеральной среде 2 оказалась выше в 2 раза по сравнению с другими изученными средами (рис. 2). Можно предположить, что входящий в состав этой среды пептон способствовал активному функционированию биосинтетического пути, ведущего к образованию сесквитерпеновых арильных эфиров. Однако штаммы различались по биосинтетической активности и независимо от состава среды. Так, A. borealis 74г был более активным продуцентом меллеолидов, чем A. borealis D48/14 (рис. 2).

Рис. 2.

Продукция меллеолидов (мг/л) A. borealis штаммов 74г и D48/14 при росте на средах НРК, 2 и 3.

При изучении влияния состава питательной среды на биосинтез меллеолидов A. borealis 74г и D48/14 было обнаружено, что спектр синтезированных метаболитов не изменялся, но содержал разное соотношение меллеолидов. Если на среде НРК у штаммов основными метаболитами были меллеолиды С и D, то у A. borealis 74г на органоминеральной среде 2 преобладал мелледонал В, а на среде 3 − меллеолид С. У штамма A. borealis D48/14 на средах 2 и 3 доминировали 5'-О-метилмелледонал и меллеолид D соответственно. Таким образом, состав среды оказывал и регуляторное влияние на синтез меллеолидов.

Изучение фитотоксичности метаболитов Armillaria показало, что все изученные меллеолид-синтезирующие штаммы A. borealis, A. cepistipes и A. sinapina проявляли токсикогенное действие по отношению к семенам и проросткам P. abies с различной степенью интенсивности (табл. 3). На фоне незначительного снижения лабораторной всхожести (в среднем в 1.2 раза по сравнению с контролем) наблюдали пролонгированное действие биологически активных соединений по отношению к корневой системе. Так, длина главного корня оказалась меньше в 1.2–2 раза по сравнению с контролем, а масса сухого проростка – в 1.2–1.6 раз. Начиная с 12–14-х сут вегетации, активно протекали некротические процессы более чем у 30% тестируемых растений, приводящие к отмиранию корневой системы. Максимальной фитотоксичностью культуральной жидкости характеризовался штамм A. borealis 74г. Фитотоксическая активность практически отсутствовала у штаммов видов A. gallica и A. ostoyae, не синтезирующих меллеолиды в идентифицируемых количествах.

Следует отметить, что фитотоксическое действие Armillaria связывают с присутствием протоиллуденового ядра в структуре меллеолидов [1, 14]. Так, на листьях салата была показана фитотоксичность многих меллеолидов [14] и, в том числе, меллеолида D, 5'-О-метилмелледонала и армилларинина, идентифицированных и у сибирских штаммов.

Изучение фитопатогенности живых культур A-rmillaria на проростках и сеянцах хвойных позволило установить, что некоторые меллеолид-синтезирующие штаммы обладали более выраженными фитопатогенными свойствами (табл. 3). Так, наблюдали максимальное снижение энергии прорастания и лабораторной всхожести семян P. abies в 1.7 раза, а также грунтовой всхожести семян A. sibirica в 1.5 раза под действием штаммов A. borealis 206г и A. cepistipes 73/8.

Послевсходовая гибель сеянцев пихты A. sibirica под влиянием всех изученных культур Armillaria варьировала в пределах 32.4–56.1%, что в 1.6–2.8 раз превышало естественную смертность в контроле. Высокий летальный уровень более взрослых растений, по-видимому, был обусловлен не только биосинтезом меллеолидов, но и другими факторами патогенности, поскольку высокую гибель сеянцев (до 47%) наблюдали и в присутствии штаммов, не образующих метаболиты этой группы.

Меллеолиды проявляют цитотоксичность по отношению к различным клеточным линиям рака человека, ингибируя синтез ДНК [15–17], при этом цитостатическое действие не зависит от положения двойной связи в протоиллуденовом кольце. Отмечено снижение цитотоксичности меллеолидов при увеличении гидрофобности молекул, при этом чем меньше в молекуле гидроксильных групп, тем выше цитотоксичность соединения [18].

Некоторые меллеолиды оказывают антифунгальное действие на микоризные базидиомицеты, вызывающие корневые гнили деревьев (Fomitopsis pinicola, Omphalotus illudens, Pleurotus ostreatus и Tapinella panuoides), а также на различные почвенные грибы из родов Aspergillus и Penicillium (P. notatum, Р. oxalicum, A. flavus, A. nidulans). Меллеолиды не оказывают влияния на Mucor racemosus и Trichoderma harzianum, повсеместно присутствующие в почве [3, 16]. Известно, что антимикотическую активность проявляют только меллеолиды, имеющие Δ^2,4 – двойную связь в протоиллуденовом кольце, но для меллеолидов с Δ^2,3 – двойной связью она не показана [3, 16]. Все меллеолиды, идентифицированные у сибирских штаммов Armillaria, содержат Δ^2,3 – двойную связь в протоиллуденовом кольце и, поэтому их присутствие не будет препятствовать колонизации корней другими грибам. Известно, что меллеолиды, в том числе С и D, проявляют антибактериальную активность по отношению к грам-положительным бактериям [10, 11]. В связи с этим было высказано предположение об экологической роли этих соединений. Метаболиты этой группы могут сдерживать развитие конкурентной микробиоты и предотвращать колонизацию корней другими организмами [1]. Таким образом, сибирские штаммы грибов Armillaria, благодаря образованию меллеолидов, обладают антибактериальной и цитотоксичной активностью.

При изучении состава вторичных метаболитов грибов Armillaria у 8 из 11 сибирских штаммов были идентифицированы меллеолиды. Все продуценты видов A. borealis, A. cepistipes и A. sinapina образовывали меллеолид С и его хлорпроизводное меллеолид D. Отмечены штаммовые различия в спектре синтезируемых меллеолидов. Штамм A. borealis 74г синтезировал более широкий спектр меллеолидов (меллеолиды В, C, D, H, мелледоналы В и С, 5'-О-метилмелледонал, 13-гидрокси-5'-О-метилмелледонал и армилларинин) по сравнению с другими представителями этого вида. Показано, что состав среды культивирования влиял, как на количество, так и на соотношение меллеолидов у штаммов A. borealis 74г и D48/14. Все изученные меллеолид-синтезирующие штаммы проявляли токсикогенное и фитопатогенное действие по отношению к семенам и сеянцам P. abies и A. sibirica, ингибируя энергию прорастания, лабораторную и грунтовую всхожесть и развитие корневой системы сеянцев хвойных. Максимальной фитотоксичностью характеризовалась культуральная жидкость штамма A. borealis 74г, содержащая наибольшее количество и разнообразие меллеолидов в профиле метаболома. У штаммов A. gallica и A. ostoyae, не синтезирующих меллеолиды в идентифицируемых количествах, фитотоксическая активность практически отсутствовала. Это могло свидетельствовать о наличии связи между способностью синтезировать протоиллуденовые сесквитерпеновые арильные эфиры изученными штаммами Armillaria и высокой степенью их фитотоксичности.

Авторы выражают благодарность К. Корхонену (Finnish Forest Research Institute) за активное участие в проведение исследований по видовой идентификации грибов рода Armillaria.