1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Прикладная биохимия и микробиология
  4. T. 55, № 3, 2019

Прикладная биохимия и микробиология, 2019, T. 55, № 3, стр. 282-285

Биосинтез диалкиловых эфиров орто-фталевой кислоты в растениях и в культурах клеток

А. Г. Еникеев 1, А. А. Семенов 1, *, А. В. Пермяков 1, Н. А. Соколова 1, К. З. Гамбург 1, Л. В. Дударева 1

1 Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН
664033 Иркутск, Россия

* E-mail: laps1936@mail.ru

Поступила в редакцию 05.04.2018
После доработки 21.09.2018
Принята к публикации 18.12.2018

Полный текст (PDF)

Аннотация

Исследовано наличие сложных эфиров орто-фталевой кислоты в интактных растениях, в растениях in vitro, и культурах клеток. Выявлено, что все исследованные растительные объекты продуцируют фталевые эфиры в значительных количествах. Таким образом, биосинтез этих веществ является общим свойством растительного мира. Попадая в окружающую среду, они создают природный фон, независимо от возможных техногенных загрязнений.

Ключевые слова: сложные эфиры орто-фталевой кислоты, биосинтез, растения, культуры клеток

Сложные эфиры орто-фталевой кислоты производятся химической промышленностью и широко используются во всем мире как пластификаторы пластических масс и ингредиенты косметических средств [1]. В то же время – это природные вещества, о нахождении которых в живых объектах сообщалось многими исследователями. Первое, известное авторам, сообщение об обнаружении фталатов в растениях датируется 1892 г., т.е. задолго до начала их промышленного производства [2]. К началу 70 гг. прошлого века эти соединения были обнаружены в винограде, маке, землянике, табаке, оливковом, кукурузном и эвкалиптовом маслах, грибах, рыбе, сердце и гипофизе быка [3]. Оптически активный ди-2R-этилгексилфталат присутствует в неочищенном тростниковом сахаре [4]. В последующие годы фталаты как вещества природного происхождения были неоднократно выделены из различных биологических объектов [5–7]. Орто-фталаты обладают широким спектром биологической активности [8–10], на их основе разработан ряд новых высокоэффективных лекарственных средств [11, 12]. Несмотря на наличие большого объема данных, подтверждающих биогенное происхождение фталатов, в современной экологической литературе доминирует мнение рассматривающее присутствие этих соединений в живых объектах исключительно как результат техногенного загрязнения [13–15].

Цель работы – анализ присутствия сложных эфиров орто-фталевой кислоты в растительных объектах различного происхождения и уровня организации (растения in situ, растения in vitro, культуры клеток) с целью подтверждения возможности биогенного происхождения данных соединений.

МЕТОДИКА

Растительный материал. Для исследования растительный материал заготавливался в летние месяцы в Иркутской обл. и на Южном побережье Крыма (Россия) вдали от возможных техногенных загрязнений. Использовали хвою и листья древесных растений, произвольно выбранные травянистые растения различных таксономических групп, а также растения in vitro и культуры клеток из коллекции ЦКП “Биоресурсный центр” Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН (Иркутск, Россия).

Подготовка и очистка химических реактивов. Все используемые органические растворители и материалы проверялись на присутствие в них фталатов. В случае наличия таковых в растворителях производилась очистка путем обработки щелочью с последующей промывкой водой, высушиванием и перегонкой. Для материалов, не подлежащих такой обработке, проводились холостые опыты. Использовали только стеклянную химическую посуду. Исключался контакт с пластическими массами.

Количественный анализ содержания фталатов. В качестве вспомогательного материала для количественного определения фталатов (освобождение от хлорофилла) использовали “окислитель”, приготовляемый встряхиванием хроматографического оксида алюминия (40–50 мкм) с 1%-ным ацетоновым раствором перманганата калия в соотношении 1 : 10 до исчезновения окраски надосадочной жидкости. После фильтрования светло-коричневый порошок промывали хлороформом и высушивали на воздухе.

Точные навески воздушно-сухих образцов измельчали до размеров частиц <0.5 мм и исчерпывающе экстрагировали легким петролейным эфиром. Экстракт медленно пропускали без отсасывания через ~1–1.5 см слой окислителя, промывали хлороформом и объединенные элюаты упаривали досуха. Остаток от перегонки переносили с помощью стандартного раствора в градуированный пикнометр и доводили до метки. В качестве внутреннего стандарта использовали гексановый раствор динонилфталата точно известной концентрации.

Растения in vitro и освобожденные от среды фильтрованием культуры клеток высушивали лиофильно на установке “Иней 3-2” (Россия). Точные навески полученных таким способом образцов исчерпывающе экстрагировали легким петролейным эфиром и обрабатывали как указано выше.

Анализ образцов проводили методом газо-жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором с использованием хромато-масс-спектрометра 7000QQQ/7890A (“Agilent Technologies”, США). Объем вводимой пробы 0.2 мкл. Температура испарителя 250°С, источника ионов 230°С, температура детектора 150°С, температура линии, соединяющей хроматограф с масс-спектрометром, 280°С. Диапазон сканирования 50–800 а. е. м. Для разделения использовали капиллярную колонку HP-5MS (30 м × 0.250 мм × 0.50 мкм), с фазой 5%‑ного фенил-метил-полисилоксана, градиент температуры: от 70 до 280°С со скоростью 5°С/мин, затем выдерживание при 280°С в течение 10 мин. Газ-носитель – гелий, скорость потока газа 1 мл/мин. Разделение потоков 5 : 1. Масс-спектрометр – тройной квадруполь, способ ионизации – электронный удар (энергия ионизации 70 эВ). Анализ проводили в режиме поиска отдельных ионов. Для идентификации целевых соединений использовали сравнение их времен удерживания с временами удерживания стандартов, а также с библиотекой масс-спектров NIST08 и WILEY7. Количество фталевых эфиров определяли сравнением площадей хроматографических пиков с площадью пика внутреннего стандарта.

Опыты проводили трижды. В таблицах приведены средние значения по трем опытам и средняя квадратичная ошибка.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Во всех собранных в природных условиях растительных образцах обнаружены дибутил-орто-фталат (ДБФ) и ди-орто-2-этилгексифталат (ДЭГФ) в разных количествах и соотношениях (табл. 1). Аналогичные результаты ранее неоднократно были получены другими авторами [16]. О биогенном происхождении орто-фталатов в растениях свидетельствуют значительные вариации соотношений ДБФ и ДЭГФ у разных видов. Как поллютанты фталаты попадают в растения путем диффузии, следовательно, у растений разных видов, собранных в пределах одного узкого ареала, относительное содержание различных фталатов должно быть одинаковым.

Таблица 1.  

Содержание сложных эфиров о-фталевой кислоты в растениях in situ, мкг/г сухой массы (n = 3)

Вид ДБФ ДЭГФ
Pleurozium schreberi Willd. Ex Brid 98 ± 3 19 ± 1
Marchantia polymorpha L. 11 ± 7 67 ± 3
Equisetum sylvaticum L. (весенний побег) 11 ± 1 27 ± 2
Equisetum sylvaticum L. (летний побег) 14 ± 2 19 ± 1
Licopodium clavatum L. 8 ± 1 37 ± 1
Athyrium filix-femia Roth et Mert 19 ± 1 9 ± 1
Gymnocarpium dryopteris (L.) Newman 12 ± 2 13 ± 2
Abies sibirica Lodeb. 33 ± 1 45 ± 3
Juniperus communis L. 32 ± 2 39 ± 1
Larix sibirica Lodeb. 11 ± 2 27 ± 2
Picea obovata Lodeb. 9 ± 1 44 ± 3
Pinus sibirica Du Tour 14 ± 1 43 ± 2
Pinus sylvestris L. 16 ± 2 23 ± 2
Pinus nigra subsp. pallasiana (Lamb.) Holmboe* 60 ± 1 66 ± 3
Pinus brutia var. stankewiczii (Sukaczev) Frankis* 32 ± 2 39 ± 1
Alnus alnobetula subsp. fruticose (Rupr.) Raus. 23 ± 1 55 ± 3
Betula platyphylla Sukaczev 8 ± 1 14 ± 2
Fagus sylvatica L. * 23 ± 2 32 ± 3
Magnolia grandiflora L. * 118 ± 5 14 ± 2
Pistacia atlantica subsp. Mutica (Fisch&C.A.Mey.) Rech.F.* 173 ± 4 43 ± 2
Populus tremula L. (листья) 21 ± 3 23 ± 2
Populus tremula L. (кора) 8 ± 1 12 ± 1
Quercus pubescens Willd* 74 ± 3 23 ± 3
Vibumum rhytidophyllum Hemsl* 23 ± 2 25 ± 3
Elodea canadensis Michx 22 ± 1 120 ± 2
Linaria vulgaris Mill., 13 ± 1 89 ± 5
Myriophyllum sibiricum Kom 38 ± 2 158 ± 5
Allium victorialis L. 13 ± 3 5 ± 1
Paris quadrifolia L. 765 ± 5 360 ± 6
Triticum aestivum L. (этиолир.проростки) 42 ± 2 36 ± 3
Veratrum lobelianum Bernh 219 ± 9 56 ± 3

* Растения, собранные в южных районах Крыма.

Для полного исключения возможности загрязнения растительных тканей фталатами извне в качестве объектов исследования использовали закрытые модельные системы – растения in vitro и культуры клеток. Все компоненты сред предварительно проверяли на наличие фталатов. Примеси фталатов обнаружены во всех проверенных образцах сахарозы, включая реактивы высшей степени очистки (“ХЧ” и “for cell culture”). Ранее наличие значительных количеств оптически активного ДЭГФ было обнаружено в “желтом” сахаре [4]. Вероятно, данное соединение является плохо отделяемой природной примесью, что обуславливает его наличие в сахарозе. Для исключения загрязнения пробирочные растения и культуры клеток до начала экспериментов не менее трех пассажей выращивали на средах с глюкозой, не содержавшей фталатов. Остальные компоненты сред фталатов не содержали.

Во всех исследованных пробирочных растениях и в культурах клеток обнаружены орто-фталаты, при этом их качественный состав идентичен растениям in situ (табл. 2). Единственным источником этих соединений в закрытых системах может быть только их биосинтез. Показано, что ДЭГФ из культуры клеток борца байкальского оптически активен [17]. Таким образом, можно утверждать, что бытующее мнение о фталатах исключительно как о техногенных поллютантах нуждается в коррекции. Эти вещества в изобилии поступают в окружающую среду из царства растений.

Таблица 2.  

Содержание сложных эфиров орто-фталевой кислоты в растениях in vitro и культурах клеток, мкг/г сухой массы

Вид ДБФ ДЭГФ
Растения in vitro
Nicotiana tabacum L. 47 ± 7 100 ± 11
Oxytropis triphylla (Pallas) Pers. 9 ± 6 18 ± 1
Solanum tuberosum L. (сорт Луговской) 50 ± 1 63 ± 2
Культуры клеток
Aconitum baicalense Turcz. ex Rapaics 24 ± 2 332 ± 20
Aconitum barbatum Patr. ex Pers. 10 ± 2 246 ± 3
Nicotiana tabacum L. 15 ± 2 76 ± 4
Saussurea controversa DS 9 ± 1 124 ± 11
Scorzonera hispanica L. 85 ± 3 82 ± 2
Solanum tuberosum L. (сорт Луговской) 13 ± 2 43 ± 2

Физиологические функции орто-фталатов неизвестны. Имеются лишь несколько сообщений описывающих некоторые физиологические эффекты действия этих соединений. ДБФ из корневых экссудатов бобовых участвует в отрицательном аллопатическом взаимодействии с клубеньковыми бактериями [18]. При опрыскивании растений пшеницы 1% раствором ДБФ наблюдали ингибирование дыхательной цепи митохондрий и индукцию апоптоза [19]. Однако в этих экспериментах использовали очень высокую, выходящую за рамки физиологических значений, концентрацию фталата, что могло вызвать неспецифический ответ.

Изучение физиологической роли орто-фталатов в растениях позволит расширить знания о биохимических механизмах регуляции растительного метаболизма и взаимодействии растений с другими организмами.

Работа выполнена на оборудовании ЦКП “Биоаналитика” Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН (г. Иркутск).

Список литературы

  1. Мазитова А.К., Аминова Г.К., Маскова А.Р., Буйлова Е.А. // Нефтегазовое дело. 2015. Т. 13. № 3. С. 83–86.

  2. Parry E.J. Monographs on Essential Oils, London: Scott, Greenwood and Inc. (Londres), 1892. V. 1. P. 212–230.

  3. Graham P.R. // Environmental Health Perspectives. 1973. V. 3. P. 3–11.

  4. Черных Е.А, Семенов А.А. // Химия природных соединений. 1980. № 2. С. 247–248.

  5. Babu B., Wu J.T. // Sciense of the Total Environment. 2010. V. 408. № 21 P. 4969–4975.

  6. Husein A.I., Ali-Shtayeh M.S., Jamous R.M., Jondi W.J., Zatar N.A.A. // International J. Current Research and Academic Review. 2014. V. 2. № 9. P. 195–203.

  7. Tian C., Ni J., Chang F., Liu S., Xu N., Sun W., Xie Y., Guo Y., Ma Y., Yang Z., Dang C., Huang Y., Tian Z., Wang Y. // Scientific Repots. 2016. V. 6. 19791. doi 10.1038/srep19791

  8. Lee K.H., Kim J.H., Lim D.S., Kim, C.H. // J. Pharmacy and Pharmacology. 2000. V. 52. № 5. P. 593–598.

  9. El-Sayed M.H. // World Applied Sciences J. 2012. V. 20. P. 1202–1212.

  10. Rameshthangam P., Ramasamy P. // Virus Research. 2007. V. 126. № 1. P. 38–44.

  11. Николаева И.Г., Хобракова В.Б., Баторова С.М., Николаева Г.Г., Николаев, С.М., Горшков А.Г., Верещагин А.Л., Парьева К.В., Монголов Х.П. // Химико-фармацевтический журн. 2005. Т. 39. № 8. С. 37–40.

  12. Семенов А.А, Громова А.С., Луцкий В.И., Неретина О.В., Плотникова Ю.К., Малов И.В., Лязин А.Б. 2008. Патент РФ. № 2322975.

  13. Азарова И.Н., Парфенова В.В., Барам Г.И., Теркина И.А., Павлова О.Н., Суслова М.Ю. // Прикл. биохимия и микробиология. 2003. Т. 39. № 6. С. 665–669.

  14. Крылов В.А., Волкова В.В. // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. 2014. № 1–2. С. 210–213.

  15. Niu L., Xu Y., Xu C., Yun L., Liu W. // Environmental Pollution. 2014. V. 195. P. 16–23.

  16. Rajamanikyam M., Vadlapudi V., Parvathaneni S.P., Koude D., Sripadi P., Misra S., Amanchy R., Upadhyayula S.M. // EXCLI J. 2017. V. 16. P. 375–387.

  17. Семенов А.А., Еникеев А.Г., Снеткова Л.В., Пермяков А.В., Соколова Н.А., Дударева Л.В. // Докл. РАН. 2016. Т. 471. № 3. С. 366–367.

  18. Макарова Л.Е., Дударева Л.В., Петрова И.Г., Васильева Г.Г. // Прикл. биохимия микробиология. 2016 Т. 53. № 2. С. 217–222.

  19. Воробьев А.Л., Смирнова Е.Г., Бакеева Л.Е., Ягужинский Л.С. // Докл. РАН. 2005. 405. № 3. 412–415.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Прикладная биохимия и микробиология

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал