Журнал неорганической химии, 2022, T. 67, № 4, стр. 466-475

ВВЕДЕНИЕ

Ионы кальция играют важную роль во многих биохимических и бионеорганических процессах в организме человека, особое место они занимают в минерализации костной и зубной тканей, а также в процессах патогенного минералообразования [1–3]. Актуальность изучения данных процессов сложно переоценить, поскольку за последние несколько десятков лет сформировалось целое направление в современной науке о материалах, связанное с патологическими кристаллами [4].

К таким кристаллам относятся, в частности, желчные камни (холелиты), образование которых в организме человека приводит к желчнокаменной болезни (холелитиазу). При этом важную роль играют состав желчи и концентрация различных ее компонентов [2, 5, 6]. Особое значение при формировании желчных камней имеет процесс образования микрокристаллов карбоната кальция, свойства которых (фазовый состав, морфология, размер частиц) тесно связаны с кристаллизацией холестерина из желчи и, как следствие, с ростом холелитов, что является главным фактором в определении механизма образования желчных камней [1, 2, 6]. Этот факт также подтверждается недавними исследованиями процессов кристаллизации карбоната кальция, согласно которым в отсутствие неорганических солей кальция самопроизвольная нуклеация холестерина невозможна, так как она требует пересыщения раствора ~300%. Такая концентрация холестерина в желчи человека невозможна физиологически, поэтому нуклеация холестерина происходит в результате гетерогенной кристаллизации с участием карбоната и билирубината кальция [1, 7, 8].

В норме в состав желчи человека входят как неорганические (ионы), так и органические компоненты (желчные кислоты, лецитин, холестерин, билирубин и др.), составляющие основу сухого остатка [3, 9, 10].

Полиморфный по своей природе карбонат кальция характеризуется существованием трех различных кристаллических модификаций: кальцит (стабилен), арагонит и ватерит (метастабильны) [11].

Важно отметить, что в неорганической составляющей желчных камней преобладающей фазой является именно метастабильная модификация карбоната кальция – ватерит, а арагонит и кальцит содержатся в холелитах в примесных количествах, что непосредственно связано с условиями протекания процесса кристаллизации CaCO₃ [4–7, 12, 13].

Математическое моделирование, проведенное в исследовании [14], показывает, что аминокислоты гистидин (His), аргинин (Arg), метионин (Met) и триптофан (Trp) в составе пептида имеют сильные межфазные связи Ca–O, а также водородные связи O···H с поверхностью (001) арагонита, т.е. теоретически могут стабилизировать образование данной кристаллической модификации при осаждении CaCO₃ из раствора.

Однако теоретические расчеты требуют экспериментального подтверждения. Интерес представляет влияние данных аминокислот на карбонат кальция, осаждаемый из желчи, потому что, как было отмечено ранее, в данных условиях обычно происходит формирование ватерита. Перевод CaCO₃ в другую фазу при его кристаллизации в естественных условиях в организме человека может снизить стабильность образующихся микрочастиц, привести к ингибированию кристаллизации холестерина. Известно также, что при различных билиарных патологиях (в том числе при ЖКБ) наблюдается изменение концентрации аминокислот в желчи и крови [15].

Детальное исследование механизма и условий кристаллизации CaCO₃, образующегося в реальных условиях в организме человека, можно проводить путем экспериментального моделирования данного процесса, а именно – синтеза и анализа получаемых образцов [2, 16–20]. Некоторые из используемых методов синтеза неорганических соединений кальция применяются и в создании современных наноматериалов [21–24].

Цель настоящей работы – экспериментальное исследование влияния аминокислот гистидина (His), аргинина (Arg), метионина (Met) и триптофана (Trp) при варьировании их концентраций на состав и свойства карбоната кальция, осаждаемого из желчи.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Подбор модельных концентраций

Модельные концентрации. Концентрация свободных аминокислот (АК) в желчи человека зависит от их концентрации в плазме крови и, как правило, имеет близкие значения [25]. В работе [26] для изучения стабилизирующей активности аминокислот по отношению к образованию ватерита из водного раствора использовали данные АК с концентрацией 10–50 ммоль/л, что на 1–2 порядка больше концентрации АК в плазме крови.

Для повышения точности и воспроизводимости результатов экспериментального моделирования в работе при синтезе CaCO₃ использовали модельные концентрации ионов Ca²⁺, ${\text{HCO}}_{3}^{ - }$ и аминокислот, в 10 раз превышающие средние концентрации этих же веществ в желчи человека. Такое пропорциональное увеличение сохраняет соотношения между концентрациями исследуемых веществ, не превышая при этом суммарную ионную силу раствора желчи, содержащего в норме и другие ионы, и позволяет проводить синтез CaCO₃ в малых объемах.

Как указано ранее, в исследовании будут рассмотрены только четыре аминокислоты, которые представляют интерес с точки зрения их влияния на кристаллизацию и фазообразование CaCO₃. Для удобства основная информация об этих АК представлена в табл. 1.

Таблица 1.  

Аминокислоты, исследуемые в работах [19, 21]

Название, сокращение	Структурная формула	М, г/моль	Ссредняя, мкмоль/л	Смодельная, ммоль/л
Гистидин, His (H)		155.16	123	1.23
Аргинин, Arg (R)		174.20	132	1.32
Метионин, Met (M)		149.21	27	0.27
Триптофан, Trp (W)		204.23	60	0.60

Для синтеза карбоната кальция использовали гидрокарбонат натрия и дигидрат хлорида кальция как наиболее подходящие по химическому составу желчи человека. Информация об их концентрации с пересчетом на модельные условия представлена в табл. 2.

Таблица 2.  

Характеристика реагентов

Реагент (формула)	Вводимый ион	М, г/моль	Ссредняя(иона), ммоль/л	Смодельная(иона), моль/л
NaHCO3	${\text{HCO}}_{3}^{ - }$	84.01	10	0.10
CaCl2 · 2H2O	Ca2+	147.01	12	0.12

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Комплексонометрическим методом установлено содержание кальция, пересчитанное на беспримесный стехиометрический CaCO₃ в составе синтезированных образцов. Полученные данные статистически обработаны и представлены в виде доверительных интервалов в табл. 4. Для каждой серии синтезов результаты проверены однофакторным дисперсионным анализом, достоверно установившим наличие зависимостей.

Содержание карбоната кальция варьируется. В синтезах с His и Arg наблюдается рост содержания CaCO₃ в твердой фазе при увеличении концентрации этих аминокислот в желчи. Это может быть связано с тем, что данные аминокислоты имеют основный характер. Met и Trp не имеют какого-либо сходства в своем строении и кислотно-основных свойствах, однако проявляют схожий эффект по отношению к карбонату кальция: содержание последнего в образцах уменьшается при увеличении концентрации этих аминокислот, т.е. они ингибируют кристаллизацию CaCO₃.

Для синтезов с Met и Arg зависимости ω(CaCO₃) от концентрации АК в желчи имеют экспоненциальный вид, это видно из коэффициентов корреляции при наложении такой зависимости на имеющиеся точки (рис. 1).

Рис. 1.

Зависимости содержания CaCO₃ (в пересчете с содержания Ca²⁺) в синтезированных образцах от концентрации Met (M) и Arg (R) в желчи.

Исследование образцов методом качественного РФА показало присутствие ватерита в качестве основной фазы в составе всех образцов, пики при углах 2θ = 24.9°, 27.0°, 32.7°, 44.5°, 50.0° являются наиболее интенсивными и визуально различимыми. Арагонит (2θ = 26.3°, 27.3°, 38.5°, 33.2°, 36.2°, 43.0°, 46.0° и др.) и кальцит (2θ = 29.4°, 39.5°, 43.1°, 48.5° и др.) также обнаружены во всех порошках, однако в значительно меньшем количестве. Дифрактограммы всех синтезированных образцов CaCO₃ имеют почти идентичный вид, отличаясь лишь небольшим набором пиков и их относительной интенсивностью. На рис. 2 представлены дифрактограммы порошков, полученных в присутствии аргинина. Для всех линеек синтезов можно отметить смещение характеристических углов отражения в область меньших углов 2θ (максимальный сдвиг ~1.5°) без изменения общего вида дифрактограмм при повышении концентрации аминокислот в желчи, что свидетельствует об увеличении межплоскостных расстояний в кристаллической структуре образующейся кристаллической фазы CaCO₃. Это может быть вызвано внедрением в кристаллическую структуру карбоната кальция объемных анионов аминокислотных остатков.

Рис. 2.

Дифрактограммы образцов CaCO₃, полученных в присутствии Arg в желчи (А – арагонит, В – ватерит, К – кальцит).

Более подробный количественный РФА установил содержание ватерита, арагонита и кальцита в кристаллической фазе. В табл. 5 видно изменение содержания арагонита в полученных порошках.

Интерес представляет наличие зависимости (достоверно установлен дрейф) между содержанием арагонита в твердой фазе и концентрацией аминокислоты в желчи для синтезов с Met и Arg: содержание фазы арагонита увеличивается с ростом концентрации данных аминокислот. Для образцов CaCO₃ с His наблюдается обратная зависимость. Для синтезов в желчи с Trp таковая зависимость отсутствует.

Результаты ИК-фурье-спектроскопии коррелируют с данными предыдущих анализов. ИК-спектры полученных образцов содержат все характеристические колебания треугольного аниона ${\text{CO}}_{3}^{{2 - }}{\text{:}}$ невырожденное полносимметричное валентное колебание ν₁ (ν_s) при 1040–1110 см^–1; дважды вырожденное симметричное деформационное колебание ν₂ (δ_s) при 856–875 см^–1; трижды вырожденное асимметричное валентное колебание ν₃ (ν_as) при 1408–1490 см^–1; трижды вырожденное деформационное колебание ν₄ (δ_as) при 700–745 см^–1.

Остальные полосы в ИК-спектрах характеризуют функционально-групповой состав органической составляющей полученных порошков. Для всех образцов характерно наличие пиков при 2800–3000 см^–1, включающих валентные колебания связей С–H, перекрывающиеся с валентными колебаниями связи N–H, характерными для билирубина, лецитина и аминокислот. Во всех спектрах при 3200–3700 см^–1 наблюдается широкая полоса колебаний связи O–H, включенной в водородную связь, характерная для холестерина и лецитина. При 2350 см^–1 наблюдаются паразитные пики валентных колебаний связи C=O углекислого газа воздуха. В области 1500–1600 см^–1 присутствует набор пиков, отвечающих валентным колебаниям карбоксилат-аниона O–C–O^– и деформационным колебаниям связи N–H в билирубине и группы ${\text{NH}}_{3}^{ + }$ в аминокислотах.

Важно, что в сериях синтезов с Met и Trp для полученных образцов не наблюдается каких-либо значимых качественных изменений в соответствующих ИК-спектрах. В данном случае концентрация аминокислот недостаточна для их влияния на структурно-групповой состав получаемых порошков. В синтезах с His и Arg (рис. 3) действие аминокислот более явное: с увеличением их концентрации в желчи происходит рост интенсивности колебаний при 875 см^–1 и 1480–1490 см^–1, указывающий на повышение доли карбоната кальция в составе твердой фазы, причем полоса колебаний ν₃ принимает вид, характерный для арагонита, что коррелирует с данными определения ω(CaCO₃) в твердой фазе и результатами РФА. С ростом концентрации аминокислот становятся также более интенсивными пики деформационных колебаний группы ${\text{NH}}_{3}^{ + }$ и валентных колебаний группы O–C–O^– при 1540–1640 см^–1, что может говорить о повышении содержания данных аминокислот в составе синтезированных порошков, где они могут присутствовать как в свободном виде в смеси с аморфной и органической фазами, так и в адсорбированном состоянии на поверхности кристаллических фаз карбоната кальция.

Рис. 3.

ИК-спектры образцов CaCO₃, полученных в присутствии Arg в желчи.

Данные оптической микроскопии подтверждают результаты всех предыдущих исследований: основу всех образцов составляют сферолитические микрочастицы ватерита (до ~10 мкм) [2, 5].

В образцах, синтезированных с His и Met, наблюдается большое количество агломерированных частиц и аморфных включений органической природы, число сферолитов ватерита уменьшается с увеличением концентрации данных аминокислот в желчи. Для образцов, полученных в присутствии Arg и Trp (рис. 4), наблюдается наибольшее число сферических частиц ватерита, причем с ростом концентрации этих аминокислот в желчи происходит увеличение числа таких частиц и уменьшение их размера.

Рис. 4.

Микрофотографии образцов CaCO₃, синтезированных в присутствии Arg и Trp.

Методом ФКС установлены размеры и объемные доли частиц во фракциях порошка размером <10 мкм для всех исследуемых образцов. Результаты измерений каждого из синтезированных порошков представлены в табл. 6 в виде доверительных интервалов. Для большинства образцов наблюдается тримодальное распределение частиц по размерам. Таким образом, порошки характеризуются наличием трех фракций: I фракция – частицы радиусом порядка сотых микрометра; II фракция – частицы радиусом порядка десятых микрометра; III фракция – частицы радиусом порядка единиц микрометра. В образцах 01, 02, H1, H2, H3, M1, M4, M5) распределение частиц по размерам носит бимодальный характер.

По фракционному составу полученных образцов CaCO₃ методом однофакторного дисперсионного анализа можно определить наличие зависимостей между концентрацией аминокислот в желчи, размером частиц каждой фракции и их объемной долей в составе общей фракции радиусом до 10 мкм.

В синтезе с His при увеличении концентрации аминокислоты в желчи происходит рост размера частиц фракций II и III, понижение их содержания и увеличение доли фракции I (ее появление в составе осадков наблюдается при увеличении С_мод гистидина до 2С_мод и 10С_мод).

В серии образцов, полученных с Met, фракция I появляется только при концентрации метионина 1С_мод. Размер частиц практически не изменяется (незначительно снижается после скачкообразного увеличения при 1С_мод) при увеличении концентрации Met в желчи, однако содержание фракций II и III варьируется, при 1С_мод происходит скачкообразное изменение их содержания.

Образцы, полученные в присутствии Arg, характеризуются полным набором всех трех фракций. Радиусы частиц практически не изменяются при увеличении концентрации аминокислоты в желчи, однако средний размер фракции I достоверно отличается от размера частиц, полученных в отсутствие аминокислот. Для фракций II и III наблюдается скачкообразное изменение их долей при 1С_мод аргинина с повышением доли фракции II и снижением доли фракции III при дальнейшем введении АК.

Синтезированные с Trp осадки характеризуются фракцией I, достоверно большей по размерам, чем образцы без АК, при этом с ростом концентрации Trp размеры фракций I и II практически не изменяются, а размер фракции III возрастает. Доля фракций I и II снижается, а III – увеличивается при повышении концентрации Trp в желчи. Такой эффект снижения доли “крупных” частиц и повышения доли “малых” может иметь ингибирующее действие на рост и агрегацию образующихся холелитов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Cинтезировано 22 образца карбоната кальция в желчи при варьировании концентрации аминокислот His, Met, Arg и Trp.

Комплексонометрическим титрованием установлено содержание кальция в пересчете на CaCO₃ в составе твердой фазы всех синтезированных образцов. Максимальный выход по CaCO₃ имеют образцы, полученные с Arg, минимальный – с Met. Повышение концентрации аминокислоты приводит к росту массовой доли карбоната кальция в случае с His и Arg и к ее снижению в синтезах с Met и Trp. Замечено ингибирующее действие Met на кристаллизацию CaCO₃ и образование осадка в желчи в целом.

С помощью РФА установлено, что основным компонентом фазового состава всех полученных порошков является ватерит. Для аминокислот Met и Arg доказан их стабилизирующий эффект по отношению к метастабильному арагониту: с ростом их концентрации в желчи происходит увеличение массовой доли арагонита в составе твердой фазы. Это может иметь ингибирующий эффект на дальнейший рост и агрегацию желчных камней, так как арагонит отличается от ватерита своей морфологией, дзета-потенциалом и, как следствие, адгезией к холестерину. Результаты ИК-фурье-спектроскопии коррелируют с данными РФА.

Оптическая микроскопия показала присутствие сферолитов ватерита во всех полученных порошках. Методом ФКС установлено, что микрочастицы карбоната кальция радиусом <10 мкм представлены тремя фракциями. Наибольший интерес представляют синтезы с His и Trp, в которых с ростом концентрации аминокислот наблюдается увеличение доли мелкоразмерной фракции и снижение доли крупноразмерных фракций. Радиус частиц всех фракций при этом возрастает.

Полученные результаты указывают на необходимость дальнейшего исследования минералообразования в желчи человека на модельных системах с целью выявления механизмов, установления функциональных зависимостей и определения причин образования зародышей желчных камней. В дальнейшем планируется исследование влияния рассмотренных в работе аминокислот на состав и свойства CaCO₃ в иной области концентраций и при их совместном присутствии.