Журнал неорганической химии, 2021, T. 66, № 8, стр. 1017-1024

ВВЕДЕНИЕ

Одна из быстро развивающихся областей современной нанотехнологии – создание и использование нанокомпозитов на основе металлических частиц и полимеров в качестве противомикробных препаратов [1 ] . Они должны объединять в себе такие свойства, как высокая антибактериальная активность, экологичность, низкая токсичность, безопасность, простота изготовления и использования.

Особое внимание в последнее время уделяется материалам на основе наночастиц (НЧ) серебра [2 ] , которые обладают бактерицидным и противогрибковым действием [3 ] . К настоящему моменту в литературе описано большое количество методов синтеза (традиционных и нетрадиционных) НЧ серебра [2 ] . Однако в связи с мировой тенденцией экологизации производства актуальной является разработка “зеленых” методов синтеза наночастиц. В качестве полимерных стабилизаторов синтезируемых НЧ серебра в таких случаях широко используются полисахариды, например хитозан, который обладает широким спектром физиологической активности, в том числе антибактериальной [4–6 ] . Эти свойства в сочетании с высокой сорбционной емкостью и низкой токсичностью хитозана для организма животных и человека служат основанием для его использования при разработке лечебно-профилактических и дезинфицирующих препаратов. Кроме собственного антибактериального действия хитозан также способен повышать чувствительность к антибиотикам некоторых устойчивых к ним микроорганизмов [7 ] .

На сегодняшний день существует ряд исследований [8–13 ] , посвященных методам синтеза и изучению свойств нанокомпозитов хитозан-серебро. Показано, что форма, морфология и кристалличность таких частиц зависят от условий их синтеза.

Цель настоящей работы – получение наночастиц серебра методом гидротермального синтеза в присутствии хитозана, исследование их физико-химических свойств и оценка антимикробного потенциала.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Нанокомпозиты хитозан-Ag получали методом “зеленой химии” путем химического восстановления нитрата серебра хитозаном. Использовали хитозаны с молекулярной массой от 20 до 1200 кДа и степенью дезацетилирования (СД) от 75 до 98% (табл. 1). Для проведения реакции в гомогенных условиях в качестве растворителя для хитозана использовали 2%-ный раствор уксусной кислоты (х. ч.). К раствору хитозана (10 мг/мл) при перемешивании добавляли раствор нитрата серебра (2мМ), через 15 мин реакционную смесь помещали в автоклав. Гидротермальный синтез проводили в паровом стерилизаторе ГК-100-3 (ТЗМОИ, Россия). Полученные гидрозоли очищали диализом против дистиллированной воды.

Измерения гидродинамического диаметра и величины ζ-потенциала синтезированных наночастиц проводили методом динамического светорассеивания с помощью анализатора Zetasizer Nano-ZS (Malvern, Великобритания). Измерения проводили для предварительно разбавленных в 10 раз образцов.

Спектры оптического поглощения гидрозолей хитозан-Ag регистрировали с помощью спектрофлуориметра CM2203 (Солар, Беларусь) при длине волны λ = 400–700 нм.

Морфологию частиц изучали методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) на электронном микроскопе HD-2700 (Hitachi, Япония).

Рентгенофазовый анализ (РФА) образцов проводили на дифрактометре ДРОН-3 (Россия).

ИК-спектры синтезированных композитов записывали на ИК-Фурье-спектрометре Tensor 27 (Bruker, Германия) в диапазоне частот 4000–400 см^–1. Образцы для исследования готовили в виде таблеток с KBr.

Скрининг антимикробной активности проводили диско-диффузионным методом (модификация лунок). Минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) определяли по стандартной методике методом двойных разведений: в лунки планшета, содержащие питательную среду (МПБ) и инокулят-тест бактерий в концентрации 10⁶ КОЕ/мл, добавляли исследуемый нанокомпозит хитозан-Ag с уменьшающейся концентрацией. Необходимую концентрацию суспензии тест-организма получали методом серийных разведений. Результаты оценивали через 24 ч инкубации при 37°С по накоплению бактериальной биомассы в МПБ путем измерения оптической плотности на спектрофотометре при длине волны λ = 525 нм. Минимальной ингибирующей концентрацией считали минимальную концентрацию препарата, которая ингибирует рост микроорганизмов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Спектры поглощения синтезированных гидрозолей приведены на рис. 1. В них регистрируется полоса поверхностного плазмонного резонанса (ППР), что подтверждает формирование наночастиц серебра (Ag⁰). Известно [14, 15 ] , что анализ формы, интенсивности и значения длины волны максимума ППР (λ_max) позволяет оценить габитус наночастиц серебра и их распределение. Увеличение размера частиц приводит к сдвигу λ_max в длинноволновую область, при анизотропии частиц можно наблюдать асимметричную форму ППР, а уширение ППР часто обусловлено увеличением полидисперсности образца. В нашем случае спектральный максимум находится в диапазоне 410–424 нм (рис. 1), что соответствует ППР изолированных и слабовзаимодействующих наночастиц серебра. Положение и форма полосы ППР указывают также на формирование сферических НЧ Ag с размерами ≤100 нм [14–16 ] : а – 20, б – 30, в – 250, г – 340, д – 800, е – 1200 кДа; разведение гидрозолей в 10 (*), 2 (**) и 5 (***) раз.

Рис. 1.

Спектры поглощения гидрозолей хитозан-Ag, синтезированных на основе хитозанов с различной молекулярной массой: а – 20, б – 30, в – 250, г – 340, д – 800, е – 1200 кДа. Разведение гидрозолей в 10 (*), 2 (**) и 5 (***) раз.

Форма полосы ППР и значение λ_max зависят от времени синтеза и молекулярной массы хитозана. Независимо от молекулярной массы используемого хитозана интенсивность ППР возрастает с увеличением времени синтеза, это связано с ростом концентрации восстановленного серебра в реакционной смеси. В присутствии Хит20 с увеличением времени синтеза наблюдается значительный сдвиг полосы ППР в коротковолновую область от 420 до 409 нм (рис. 1а), т.е. повышается содержание более мелких частиц серебра.

В спектре поглощения наночастиц Хит30-Ag, синтезированных в течение 15 мин, наблюдаются два максимума (рис. 1б). Это связано с присутствием в синтезированном гидрозоле серебра в различном дисперсном состоянии кластеров ${\text{Ag}}_{{\text{8}}}^{{{\text{2}} + }}$ c оптическим поглощением при λ = 328 нм [17 ] и наночастиц Ag⁰ с максимумом поглощения при λ = 416 нм. С увеличением времени гидротермальной обработки полоса поглощения кластеров исчезает, а в спектрах регистрируется одиночный интенсивный пик, характерный для высокодисперсного наноразмерного серебра (рис. 1б). При этом наблюдается незначительный гипсохромный сдвиг λ_max.

Для спектров нанокомпозитов на основе Хит250 и Хит340 по сравнению с нанокомпозитами на основе низкомолекулярных хитозанов (20 и 30 кДа) характерны более широкие полосы ППР с меньшей (в ~2 и 5 раз соответственно) интенсивностью (рис. 1в, 1г). Время синтеза не оказывает существенного влияния на значение λ_max нанокомпозитов на основе Хит250 (λ_max = 412 нм), в то время как в спектрах Хит340 наблюдается сдвиг максимума в коротковолновую область от 416 до 411 нм (рис. 1г).

Для гидрозолей нанокомпозитов на основе высокомолекулярных хитозанов (800 и 1200 кДа) характерны опалесценция и высокая оптическая плотность (рис. 1д, 1е). Следует отметить, что в спектрах этих нанокомпозитов выраженная широкая полоса ППР регистрируется лишь после гидротермальной обработки в течение 90 мин (рис. 1д, 1е). При этом для нанокомпозитов Хит800-Ag наблюдается сдвиг максимума ППР в длинноволновую область до 420–424 нм, что указывает на формирование более крупных частиц или их агрегацию.

Максимальной восстанавливающей способностью по отношению к ионам Ag⁺ обладают низкомолекулярные хитозаны (20 и 30 кДа), при этом наибольшая концентрация восстановленного серебра наблюдается при времени синтеза 60 и 90 мин. С увеличением молекулярной массы хитозана снижается эффективность восстановления серебра и увеличивается степень полидисперсности гидрозолей (рис. 1).

Синтезированные нанокомпозиты имеют положительный ξ-потенциал поверхности (табл. 2), обусловленный наличием заряженных аминогрупп хитозана. Известно [18 ] , что значение ξ-потенциала является критерием устойчивости дисперсных систем: чем больше ξ-потенциал, тем выше агрегативная устойчивость системы. Порогом коагуляции является значение ξ-потенциала, равное 25–30 мВ [18 ] . Величина ξ-потенциала частиц хитозан-Ag составляет 42–65 мВ, что свидетельствует об их высокой агрегативной устойчивости за счет стабилизирующего действия биополимера хитозана.

Согласно РФА, нанокомпозиты хитозан-Ag являются рентгеноаморфными (рис. 2). На дифрактограммах образцов наблюдается аморфное гало с широким пиком при 2θ ~ 22.5°, соответствующим хитозану, и рефлексами, характерными для кристаллического серебра: 27.81°, 32.25°, 38.15°, 44.3°, 46.21°, 54.83°, которые относятся к (210), (122), (111), (200), (231), (142) кристаллографическим плоскостям обычной кубической решетки Аg (JCPDS, file № 04-0783) [19, 20 ] .

Рис. 2.

Рентгенодифрактограммы нанокомпозитов Хит20-Ag (а) и Хит800-Ag (б). Время синтеза 60 мин.

Для понимания молекулярных взаимодействий серебра и хитозана записаны ИК-спектры исходных хитозанов и композитов на их основе (рис. 3). В ИК-спектре исходных хитозанов присутствуют характеристические пики при 3440–3430 см^–1 (соответствуют валентным колебаниям O–H и N–H функциональных групп, вовлеченных во внутримолекулярные водородные связи), 2920 и 2879 см^–1 (относятся к ν_s(C–H) и ν_as(C–H) соответственно), 1645–1641 см^–1 (отвечают деформационным колебаниям N–H первичного амина) [21 ] . Наличие остаточных N-ацетильных групп подтверждается полосами поглощения с максимумами при 1656 см^–1 (валентные колебания C=O в амидной группе, амид I) и 1323 см^–1 (колебания C–N в амиде III). Пики при 1383 и 1084 см^–1 обусловлены колебаниями С–О в первичных спиртах [21 ] . Полоса поглощения с максимумом при 1154 см^–1 может быть отнесена к валентным асимметричным колебаниям C–O–C, а пик при 894 см^–1 соответствует деформационным колебаниям С–Н глюкопиранозного кольца [22, 23 ] .

Рис. 3.

ИК-спектры исходных хитозанов 30 (1) и 800 кДа (3), нанокомпозитов Хит30-Ag (2) и Хит800-Ag (4).

В ИК-спектрах нанокомпозитов хитозан-Ag увеличивается интенсивность полосы деформационных колебаний δ(NH₂) при 1565 см^–1, что свидетельствует о взаимодействии этих групп с серебром. Наблюдается также уменьшение интенсивности и гипсохромный сдвиг до 1630 см^–1 полосы поглощения, относящейся к валентным колебаниям CONH₂-группы. Полосы колебаний связей C–N и С–О сдвигаются в область низких частот до 1408 и 1077 см^–1 соответственно. Эти изменения указывают на формирование координационных связей между ионами серебра и гидроксильными и аминогруппами хитозана, что коррелирует с данными [24 ] . Следует отметить, что в спектрах нанокомпозитов хитозан-Ag появляется новая характеристическая полоса валентных колебаний C=O при 1715–1710 см^–1, обусловленная формированием кетонов, альдегидов и карбоксилов в реакции восстановления ионов серебра гидроксильными группами хитозана [10 ] . В то же время отсутствует пик при 817 см^–1, характерный для ${\text{NO}}_{{\text{3}}}^{--}$-ионов [24 ] , что подтверждает эффективную очистку нанокомпозитов диализом против воды.

В длинноволновой области ИК-спектров нанокомпозитов хитозан-Ag по сравнению со спектром исходных хитозанов наблюдается уменьшение интенсивности и гипсохромный сдвиг полосы поглощения (за исключением образцов Хит800-Ag и Хит1200-Ag), являющейся суперпозицией полос валентных колебаний ν(OH) и ν(NH) хитозана, что доказывает взаимодействие этих групп с серебром. Наиболее интенсивное уменьшение полосы поглощения характерно для образцов на основе низкомолекулярных хитозанов, а величина сдвига максимума составляет 20 и 15 см^–1 для Хит20-Ag и Хит30-Ag соответственно, в то время как для образцов Хит800-Ag и Хит1200-Ag изменения в длинноволновой области по сравнению с исходными хитозанами не столь значительны, а сдвиг максимума не наблюдается. Авторы [10 ] отмечают, что уменьшение интенсивности этой полосы тем больше, чем больше концентрация металлического серебра в образцах. Это согласуется с данными УФ-Вид-спектроскопии, согласно которым наиболее интенсивные пики ППР НЧ Ag⁰ регистрируются в образцах Хит20-Ag и Хит30-Ag.

Таким образом, в растворах хитозана в уксусной кислоте при давлении 1.5 атм происходит восстановление ионов серебра с образованием наночастиц хитозан-Ag, представляющих собой структуру металлическое ядро–полимерная оболочка (core-shell). Это подтверждают данные ПЭМ-анализа (рис. 4).

Рис. 4.

ПЭМ-изображения нанокомпозитов Хит20-Ag (а–в) и Хит800-Ag (г). Время синтеза 30 (а, б) и 60 мин (в, г).

Морфология частиц зависит от времени синтеза и молекулярной массы полимера. В образцах на основе низкомолекулярных хитозанов наблюдается бимодальное распределение: наряду с мелкими частицами (кластерами) серебра размером ≤8 нм присутствует фаза крупных металлических частиц (30–60 нм) (рис. 4а–4в), что нехарактерно для образцов на основе высокомолекулярных хитозанов (рис. 4г). Так, на микрофотографиях нанокомпозитов Хит800-Ag присутствуют крупные субмикронные агломераты (150–500 нм), состоящие из множества мелких сферических (20–50 нм) частиц металлического серебра в матрице полимера. Гидродинамический диаметр таких частиц составляет 704.0 ± 9.0 и 1356.0 ± 13.0 нм для Хит1200-Ag и Хит800-Ag соответственно.

Во всех случаях размер металлического ядра составляет <60 нм, что согласуется с данными спектрального анализа. Толщина полимерной оболочки образцов составляет ≤30 нм.

Гидродинамический диаметр (табл. 3) нанокомпозитов значительно превышает размеры, оцененные методом ПЭМ, это обусловлено высокой степенью гидратации хитозановой оболочки. Величина гидродинамического диаметра нанокомпозитов хитозан-Ag возрастает с увеличением молекулярной массы хитозана (табл. 3). Так, для низкомолекулярных хитозанов Хит20 и Хит30 величина D_H находится в наноразмерном диапазоне и не превышает 150 нм. Для частиц серебра, стабилизированных хитозанами со средней молекулярной массой, значения гидродинамического диаметра составляют 300–500 нм. Наибольшие значения D_H характерны для частиц на основе высокомолекулярных хитозанов. При этом максимальное значение D_H, зарегистрированное для Хит800-Ag, вероятно, обусловлено образованием агрегатов частиц, которые вносят значительный вклад в интенсивность рассеивания света. Это согласуется с анализом данных, полученных методом ПЭМ (рис. 4г). Высокомолекулярные хитозаны по сравнению с низкомолекулярными имеют меньшие значения СД и меньшую концентрацию аминогрупп (табл. 1). Поэтому агрегирование и увеличение эффективного гидродинамического диаметра Хит800-Ag и Хит1200-Ag можно объяснить меньшей растворимостью высокомолекулярных хитозанов при рН 4 (значение рН гидрозолей после диализа). Так, авторы в работе [25 ] описывают эффект обратимого агрегирования наночастиц серебра, стабилизированных хитозаном, при повышении значения рН.

По сравнению с низкомолекулярными у высокомолекулярных хитозанов стабилизирующие свойства преобладают над восстанавливающими. Вероятным механизмом формирования наночастиц является предварительная фиксация ионов серебра на аминогруппах хитозана, а затем формирование НЧ серебра за счет восстановления гидроксогруппами полимера [10, 26]. Стабилизация частиц происходит на аминогруппах хитозана за счет образования химической связи между электронами атома азота и незаполненной орбиталью атома серебра [26]. Можно предположить, что различие в морфологии наночастиц Ag связано с конформационными различиями макромолекул хитозана. Так, по сравнению с высокомолекулярными низкомолекулярные хитозаны содержат большее количество аминогрупп (табл. 1), которые из-за наличия одноименного заряда отталкиваются и могут удаляться от центральных участков макромолекул хитозана, содержащих восстанавливающие гидроксильные группы [26]. В результате восстановленные кластеры серебра, менее стабилизированные в растворах низкомолекулярных хитозанов по сравнению с высокомолекулярными, образуют более крупные частицы. В случае высокомолекулярных хитозанов низкая степень восстановления может быть обусловлена стерической стабилизацией ионов серебра.

Проведенный скрининг антибактериальной активности синтезированных образцов в отношении широкого спектра штаммов условно-патогенных и патогенных микроорганизмов (Bacillus pumilus, Pseudomonas aeruginosa, Geobacillus, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Salmonella dublin, Escherichia coli, Candida albicans) показал, что наибольшая антимикробная активность характерна для образцов с максимальной концентрацией Ag⁰: Хит20-Ag и Хит30-Ag, синтезированных на основе низкомолекулярных хитозанов (20 и 30 кДа) при времени выдерживания в автоклаве 60 мин. Поэтому указанные образцы использовали в дальнейшем для изучения чувствительности микроорганизмов к нанокомпозитам хитозан-Ag. Методом серийных разведений установлено, что наибольшая чувствительность наблюдалась у E. coli (МИК_Ag = 1.1 мкг/мл), умеренная – у S. aureus и S. dublin (МИК_Ag = 4.25 мкг/мл), наименьшая – у P. vulgaris (МИК_Ag = 8.5 мкг/мл). Это согласуется с литературными данными об антимикробной активности гидрозолей хитозан-серебро, синтезированных электрохимическим методом [27]: МИК_Ag = 1.56 и 3.13 м.д. для E. coli и S. aureus соответственно. Сопоставимые значения МИК получены авторами [28] для суспензии нановолокон хитозана, допированных наночастицами Ag: 0.68 и 1.36 мг/л для E. coli и S. aureus соответственно. Полученные нами результаты также подтверждают большую резистентность грамположительных бактерий к наночастицам серебра, которую отмечают авторы в работах [27–29].

Анализ данных скрининга антимикробной активности синтезированных образцов свидетельствует о перспективности использования нанокомпозитов Хит20-Ag и Хит30-Ag как потенциальных протекторов при лечении различных бактериальных инфекций.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Методом гидротермального синтеза получены нанокомпозиты хитозан-Ag в форме агрегативно устойчивых гидрозолей. Показано, что нанокомпозиты представляют собой структуру ядро–полимерная оболочка. Установлено, что наиболее полное восстановление Ag⁺ наблюдается при использовании низкомолекулярных хитозанов (20 и 30 кДа) и времени синтеза 60 и 90 мин. Оптимизированы условия синтеза для получения нанокомпозита хитозан‑Ag с максимальной антимикробной активностью. Полученные материалы перспективны для использования в качестве антимикробных компонентов в фармацевтической, парфюмерно-косметической отраслях и пищевой промышленности.