1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Химическая физика
  4. T. 41, № 7, 2022

Химическая физика, 2022, T. 41, № 7, стр. 18-22

Кинетический изотопный H/D-эффект растворителя при окислении метиллинолеата в мицеллах Triton X-100

И. В. Москаленко 1, *, И. В. Тихонов 1

1 Ярославский государственный университет им. П.Г. Демидова
Ярославль, Россия

* E-mail: i.v.m.rostov.yar@gmail.com

Поступила в редакцию 08.07.2021
После доработки 01.10.2021
Принята к публикации 20.11.2021

Полный текст (PDF)

Аннотация

Исследовано влияние тяжелой воды на скорость окисления метиллинолеата в мицеллах Triton X-100. Установлено, что скорость окисления в тяжелой воде повышается за счет обмена гидропероксидных радикалов $\left( {{\text{HO}}_{2}^{ \bullet }} \right)$ на дейтеропероксидные $\left( {{\text{DO}}_{2}^{ \bullet }} \right),$ что приводит к уменьшению скорости обрыва цепей. Образование ${\text{DO}}_{2}^{ \bullet }$ подтверждено уменьшением коэффициентов ингибирования нитроксильными радикалами, а реакция ${\text{DO}}_{2}^{ \bullet }$ с молекулой метиллинолеата – снижением скорости окисления в присутствии супероксиддисмутазы.

Ключевые слова: кинетический изотопный эффект растворителя, полиненасыщенные жирные кислоты, пероксидное окисление липидов, гидропероксидный радикал, тяжелая вода.

Гидропероксидный радикал $\left( {{\text{HO}}_{2}^{ \bullet }} \right)$ играет важную роль в механизме окисления органических соединений, в том числе полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) в биологических системах [1–5]. Его участие проявляется, в частности, в обнаруженном кинетическом изотопном H/D-эффекте (КИЭ) [6–8]. Предполагается, что замена водорода на дейтерий может сказаться и на процессах инициирования цепного окисления ПНЖК [9]. Ведущиеся в этом направлении исследования очень важны, поскольку обнаружено, что тяжелая вода (D2O) может сдерживать распространение раковых клеток [10]. При этом практически не изучено влияние D2O на кинетику окисления ПНЖК.

В качестве кинетической модели окисления клеточных мембран удобно использовать инициированное 2,2'-азобис(2-амидинопропан)дигидрохлоридом (AAPH) окисление эфиров ПНЖК, в частности метиллинолеата (LH), в мицеллах Triton X-100 [7]. В данном процессе образуется радикал ${\text{HO}}_{2}^{\centerdot }$ [11]:

водная фаза –

(1)
${\text{AAPH}} \to 2{\text{rO}}_{2}^{ \bullet },$
(2)
${\text{HO}}_{2}^{ \bullet } \leftrightarrow {{{\text{H}}}^{ + }} + {\text{O}}_{2}^{{ \bullet --}},$
(3)
$2{\text{HO}}_{2}^{ \bullet } \to {{{\text{H}}}_{{\text{2}}}}{{{\text{O}}}_{{\text{2}}}} + {{{\text{O}}}_{2}};$

диффузия –

${\text{rO}}_{2}^{ \bullet }\left( {{\text{водная фаза}}} \right) \to {\text{rO}}_{2}^{ \bullet }\left( {{\text{липидная фаза}}} \right),$
${{{\text{O}}}_{{\text{2}}}}\left( {{\text{водная фаза}}} \right)~ \leftrightarrow {{{\text{O}}}_{{\text{2}}}}\left( {{\text{липидная фаза}}} \right),$
${\text{HO}}_{{\text{2}}}^{{{ \bullet }}}\left( {{\text{липидная фаза}}} \right) \leftrightarrow {\text{HO}}_{{\text{2}}}^{{{ \bullet }}}\left( {{\text{водная фаза}}} \right);$

органическая фаза –

${\text{LH}} + {\text{rO}}_{2}^{{{ \bullet }}}{\text{(или HO}}_{2}^{{{ \bullet }}}{\text{) }} \to {{{\text{L}}}^{{{ \bullet }}}}{\text{ + rOOH(или }}{{{\text{H}}}_{{\text{2}}}}{{{\text{O}}}_{{\text{2}}}}{\text{)}},$
${{{\text{L}}}^{ \bullet }} + {{{\text{O}}}_{2}} \to {\text{LO}}_{2}^{ \bullet },$
${\text{LO}}_{2}^{{{ \bullet }}}{\text{ + LH}} \to {\text{ }}{{{\text{L}}}^{{{ \bullet }}}}{\text{ + LOOH}},$
${\text{LO}}_{2}^{{{ \bullet }}} \to {\text{Продукт}} + {\text{ HO}}_{2}^{{{ \bullet }}},$
$2{\text{LO}}_{2}^{ \bullet } \to {\text{Продукты}}.$

Учитывая, что в водной фазе гидропероксидный радикал диссоциирует по реакции (2) [12], в тяжелой воде обратный процесс ассоциации ${\text{O}}_{2}^{{ \bullet --}}$ будет происходить с катионом D+ по приведенной ниже реакции, в результате которой образуется дейтеропероксидный радикал:

(4)
${\text{DO}}_{2}^{ \bullet } \leftrightarrow {{{\text{D}}}^{ + }} + {\text{O}}_{2}^{{ \bullet {\text{ }}--}}.$

Таким образом, окисление метиллинолеата в мицеллах в среде тяжелой воды является удобной системой для исследования реакционной способности ${\text{DO}}_{2}^{ \bullet }$ в реакциях окисления ПНЖК.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В работе использовались следующие реактивы: азоинициатор – AAPH, мицеллообразователь – Triton X-100, субстрат окисления – метиллинолеат, ингибитор – 2,2,5,7,8-пентаметилхроман-6-ол (C1); все реактивы производства компании Sigma-Aldrich (USA). Супероксиддисмутаза (СОД) из бычьей печени применялась как акцептор супероксидных радикалов. Нитроксильные радикалы :

были синтезированы В.Д. Сенем (ИПХФ РАН), за что авторы выражают ему благодарность.

Фосфатный буфер с рН(pD) = 7.4 готовили из растворов NaH2PO4 и Na2HPO4 на основе деионизованной воды (H2O) или тяжелой воды (D2O). Значения pD измеряли на стеклянном электроде, используя соотношение pD = pH + 0.41 [13]. Растворы на основе H2O очищали от следов металлов переменной валентности с помощью смолы Chelex-100 производства компании Bio-Rad Lab., Inc. (USA). В растворы на основе D2O добавляли Трилон В (Sigma-Aldrich, USA), общая концентрация которого в растворах составляла 5 мМ.

Окисление LH (0.01 моль ⋅ л–1) исследовали в мицеллах Triton X-100 (0.05 моль ⋅ л–1) в фосфатном буфере (0.05 моль ⋅ л–1, pH(pD) = 7.4) под действием инициатора AAPH (0.008 моль ⋅ л–1) при 310 K. Кинетику поглощения кислорода при окислении LH изучали с использованием кислородного биологического монитора YSI 5300A (USА). Скорость инициирования Ri определяли методом ингибиторов по времени окончания периода индукции τind с помощью соотношения

${{R}_{i}} = \frac{{2{{{[{\text{In}}{\kern 1pt} {\text{H}}]}}_{0}}}}{{{{\tau }_{{ind}}}}},$
где [In H] – концентрация C1. Величины τind определяли интегральным методом [14] по уравнению
${{\tau }_{{ind}}} = \int\limits_0^\infty {\left( {1 - {{{\left( {\frac{R}{{{{R}_{0}}}}} \right)}}^{2}}} \right)} dt,$
где R0 и R – скорость окисления в отсутствие и в присутствии ингибитора соответственно.

Коэффициент ингибирования (f) для определяли по уравнению

Значения логарифмов коэффициентов распределения (lg P) в системе октанол–вода взяты из работы [15].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Скорость окисления (R) метиллинолеата в растворе на основе тяжелой воды несколько выше, чем в растворе легкой воды: 2.4 ⋅ 10–7 моль ⋅ л–1 ⋅ c–1 и 2.0 ⋅ 10–7 моль ⋅ л–1 ⋅ c–1 соответственно. Радикально-цепное окисление протекает по сложному механизму (см. выше), поэтому некорректно сравнивать скорости окисления напрямую. Наиболее удобной величиной для определения КИЭ является длина цепи ν = R/Ri. Для ее определения необходимо уточнить значение скорости инициирования ААРН в тяжелой воде. На рис. 1 представлена зависимость скорости инициирования от доли тяжелой воды. Эта зависимость является линейной функцией. Из рис. 2 видно, что при одинаковой концентрации ингибитора период индукции выше в случае раствора на основе тяжелой воды. Для стадии инициирования КИЭ = Ri(H2O)/Ri(D2O) = = 1.16 ± 0.10. Низкие значения КИЭ характерны для реакций ионного обмена [16]. Видимо, данный эффект связан с уменьшением доли протонирования амидиновых групп AAPH [17] в тяжелой воде (Схема 1 ). Это может уменьшать кулоновское отталкивание генерируемых углерод-центрированных радикалов, что приводит к более низкой эффективности выхода радикала из клетки (e) и уменьшению Ri [17].

Схема 1 . Клеточный эффект при распаде AAPH

Рис. 1.

Зависимость скорости инициирования LH в мицеллах от изотопного состава растворителя.

Рис. 2.

Кинетические кривые окисления LH в мицеллах без ингибитора (1, 2) и в присутствии 6 · 10–6 моль · л–1 C1 (3, 4) в среде H2O (1, 3) и D2O (2, 4).

Длина цепи окисления по данным рис. 2 составила 44 ± 4 для легкой воды и 62 ± 6 для тяжелой воды. Таким образом, кинетический изотопный эффект окисления метиллинолеата в мицеллах будет равен КИЭ = ν(H2O)/ν(D2O) = 0.71 ± 0.07. Причинами увеличения длины цепи могут быть уменьшение скорости обрыва цепи и/или увеличение скорости передачи цепи между мицеллами.

Константа скорости обрыва цепи по реакции (3) для ${\text{DO}}_{2}^{ \bullet }$ значительно ниже, чем для ${\text{HO}}_{2}^{ \bullet }$ [18]. Превращением ${\text{HO}}_{2}^{ \bullet }$ в ${\text{DO}}_{2}^{ \bullet }$ в среде тяжелой воды можно объяснять увеличение скорости окисления. Таким образом, нужно доказать сам факт образования радикала ${\text{DO}}_{2}^{ \bullet }$ и убедиться, что он продолжает цепи окисления. Наличие ${\text{DO}}_{2}^{ \bullet }$ можно зафиксировать с помощью нитроксильных радикалов: известно, что не реагирует с ${\text{DO}}_{2}^{ \bullet },$ что снижает коэффициент ингибирования [19, 20]. В работах [21, 22] показано, что при окислении LH в мицеллах происходит регенерация нитроксильных радикалов, механизм которой представлен ниже:

Регенерация идет при взаимодействии с ${\text{HO}}_{2}^{ \bullet }$ как в органической фазе через образование гидроксиламина [19, 23], так и в водной фазе через образование оксоаммониевого катиона [24, 25].

В табл. 1 приведены значения f для ряда нитроксильных радикалов, имеющих различные значения lg P. Из этой таблицы видно, что падение f тем сильнее, чем выше липофильность . Таким образом, при замене H2O на D2O снижение степени регенерации происходит преимущественно в органической фазе, поскольку отрыв нитроксильным радикалом атома дейтерия от радикала ${\text{DO}}_{2}^{ \bullet }$ гораздо менее вероятен, чем отрыв атома водорода от радикала ${\text{HO}}_{2}^{ \bullet }.$ В водной же среде аналогичная реакция протекает по механизму переноса электрона, который менее подвержен влиянию изотопных эффектов.

Таблица 1.

Значения коэффициентов ингибирования для ряда нитроксильных радикалов в среде H2O и D2O

f(H2O) f(D2O) f(H2O)/f(D2O) lg P
1 3.23 1.36 2.38 1.40
2 5.2 2.9 1.79 0.90
3 1.15 0.7 1.64 0.50

Для 1 определены значения f в смесях D2O и H2O (табл. 2). Как видно, коэффициент ингибирования падает при увеличении доли тяжелой воды. Можно полагать, что в результате реакций (2) и (4) происходит частичная замена ${\text{HO}}_{2}^{ \bullet }$ на ${\text{DO}}_{2}^{ \bullet },$ что приводит к уменьшению значений f.

Таблица 2.  

Зависимость коэффициентов ингибирования для 1 от изотопного состава растворителя

Доля тяжелой воды f
0 3.25
0.2 3.08
0.5 2.95
0.84 1.59
1 1.36

При окислении LH в среде D2O происходит передача цепи между мицеллами при участии радикалов ${\text{HO}}_{2}^{ \bullet }$ (${\text{DO}}_{2}^{ \bullet }$), как и в среде H2O [11, 21]. Это подтверждается влиянием СОД на кинетику процесса. При концентрации СОД 100 Ед/мл скорость окисления LH в среде D2O снизилась на 24.3%. Супероксидиддисмутаза селективно реагирует с ${\text{O}}_{2}^{{ \bullet - }},$ снижая тем самым концентрацию ${\text{HO}}_{2}^{ \bullet }$ [11, 22], а следовательно, и концентрацию ${\text{DO}}_{2}^{ \bullet }.$ В результате уменьшается эффективность передачи цепи между мицеллами, что приводит к снижению скорости окисления LH в среде D2O.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Образующийся при окислении метиллинолеата гидропероксидный радикал в результате обратимого депротонирования/протонирования обменивается в тяжелой воде на радикал ${\text{DO}}_{2}^{ \bullet },$ который также ведет цепи окисления, но значительно медленнее участвует в их обрыве. Подтверждением образования ${\text{DO}}_{2}^{ \bullet }$ является снижение коэффициента ингибирования нитроксильными радикалами, которое связано с невозможностью реакции ${\text{DO}}_{2}^{ \bullet }$ с . Кинетический изотопный эффект растворителя при окислении метиллинолеата в мицеллах составил 0.71. При этом в тяжелой воде незначительно снижается скорость инициирования.

Авторы благодарят профессора Е.М. Плисса за полезную дискуссию.

Работа выполнена при поддержке Российским научным фондом (грант 20-13-00148).

Список литературы

  1. Рогинский В.А. // Кинетика и катализ. 1996. Т. 37. № 4. С. 521.

  2. Yin H., Xu L., Porter N.A. // Chem. Rev. 2011. V. 111. № 10. P. 5944.

  3. Panov A. // Mol. Biol. 2018. V. 52. № 3. P. 295.

  4. Poon J., Zilka O., Pratt D.A. // J. Amer. Chem. Soc. 2020. V. 142. № 33. P. 14331.

  5. Пучков С.В., Непомнящих Ю.В. // Хим. физика. 2020. Т. 39. № 3. С. 42.

  6. Тихонов И.В., Москаленко И.В., Плисс Е.М. и др. // Хим. физика. 2017. Т. 36. № 5. С. 14.

  7. Москаленко И.В., Тихонов И.В., Плисс Е.М. и др. // Хим. физика. 2018. Т. 37. № 11. С. 25.

  8. Soloviev M., Moskalenko I., Pliss E. // Reac. Kin. Mech. Cat. 2019. V. 127. № 2. P. 561.

  9. Pinchuk I., Lichtenberg D. // Chem. Phys. Lipids. 2017. V. 205. P. 42.

  10. Fulczyk A., Lata E., Talik E., Kowalska T., Sajewicz M. // Front. Chem. 2020. V. 8. P. 541.

  11. Roginsky V., Barsukova T. // Chem. Phys. Lipids. 2001. V. 111. № 1. P. 87.

  12. Bielski B.H.J., Cabelli D.E., Arudi R.L. // J. Phys. Chem. Ref. Data. 1985. V. 14. № 4. P. 1041.

  13. Covington A.K., Paabo M., Robinson R.A., Bates R.G. // Anal. Chem. 1968. V. 40. № 4. P. 700.

  14. Loshadkin D., Roginsky V., Pliss E. // Intern. J. Chem. Kinet. 2002. V. 34. № 3. P. 162.

  15. Wang Y., Xiao J., Suzek T.O. et al. // Nucleic Acids Res. 2011. V. 40. № D1. P. D400.

  16. Amorati R., Baschieri A., Morroni G., Gambino R., Valgimigli L. // Chem. Eur. J. 2016. V. 22. № 23. P. 7924.

  17. Musialik M., Kita M., Litwinienko G. // Org. Biomol. Chem. 2008. V. 6. №. 4. P. 677.

  18. Assali M., Rakovsky J., Votava O., Fittschen C. // Intern. J. Chem. Kinet. 2020. V. 52. № 3. P. 197.

  19. Baschieri A., Valgimigli L., Gabbanini S. et al. // J. Amer. Chem. Soc. 2018. V. 140. № 32. P. 10354.

  20. Harrison K.A., Haidasz E.A., Griesser M., Pratt D.A. // Chem. Sci. 2018. V. 9. № 28. P. 6068.

  21. Тихонов И.В., Плисс Е.М., Бородин Л.И., Кузнецова Т.А., Сень В.Д. // Изв. АН. Сер. хим. 2015. №. 10. С. 2438.

  22. Тихонов И.В., Плисс Е.М., Бородин Л.И., Сень В.Д. // Хим. физика. 2017. Т. 36. № 6. С. 20.

  23. Pliss E., Soloviev M., Sen’ V. et al. // Reac. Kinet. Mech. Cat. 2021. V. 132. № 2. P. 617.

  24. Sen V.D., Tikhonov I.V., Borodin L.I. et al // J. Phys. Org. Chem. 2015. V. 28. № 1. P. 17.

  25. Тихонов И.В., Бородин Л.И., Плисс Е.М. // Хим. физика. 2020. Т. 39. № 11. С. 3.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Химическая физика

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал