Журнал высшей нервной деятельности им. И.П. Павлова, 2022, T. 72, № 1, стр. 100-116

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Гибель дофаминергических клеток черной субстанции при болезни Паркинсона (БП) связывают с появлением синхронной осцилляторной активности в моторных нейросетях, которые тесно связаны с контролем движения. Предполагается, что эта активность является причиной возникновения двигательных нарушений при БП (Brown, 2006; Pogosyan et al., 2010; Sharott et al., 2014; Neumann et al., 2016). Усиленная активность в β-диапазоне при БП регистрируется в моторных областях неокортекса и ядрах базальных ганглиев (BG) у пациентов с паркинсонизмом (Brittain et al., 2014) и у животных с экспериментальной моделью БП (Sharott et al., 2005; Brazhnik et al., 2012; Dejean et al., 2012). Механизмы возникновения и распространения патологической активности в моторных нейросетях, контролирующих локомоцию, до конца не изучены.

Базальные ганглии – это сложноорганизованная сеть ядер переднего мозга, которые играют ведущую роль в контроле двигательной активности. В последние десятилетия эта функция BG интенсивно исследуется на животных моделях БП. Однако понимание того, как происходит обмен информацией между ядрами и каковы механизмы контроля движений, отсутствует (Rodriquez-Sabate et al., 2019). BG поражаются при БП в первую очередь, и больше всего страдает функция ядер, имеющих в норме дофаминергическую иннервацию, – стриатума и наружной части бледного ядра (GPe) (Gauthier et al., 1999; Smith Y., Villalba, 2008; Eid, Parent, 2015; Mallet et al., 2019). Входные ядра BG, dStr и STN, получают мощную глутаматергическую иннервацию от коры и таламуса и направляют ее в структуры, контролирующие движение. Установлено, что dStr и STN посылают тормозные и активационные сигналы соответственно к наружному сегменту бледного ядра (GPe) и выходному звену BG – внутреннему сегменту бледного ядра (GPi) и ретикулярной части черной субстанции (SNr) (Parent, Hazrati, 1995).

GPe рассматривают как ключевое звено в нейросети BG, контролирующей локомоцию. В действительности это ядро получает информацию от моторных областей коры и практически от всех ядер BG. Оно, в свою очередь, осуществляет контроль активности компонентов сети за счет обширных проекций на все ядра BG (Kita, 2007; Hegeman et al., 2016), моторный таламус (Yasukawa et al., 2004; Mastro et al., 2014) и моторные отделы коры (Chen et al., 2015; Grewal et al., 2018; Abecassis et al., 2019; Karube et al., 2019). Кроме того, реципроктные связи между активационными нейронами субталамического ядрa (STN) и тормозными нейронами GPe, возможно, формируют своего рода центральный пейсмейкер BG, который вовлечен в генерацию залповой β-активности и ее распространение у животных с экспериментальной БП (Bevan et al., 2002; Tachibana et al., 2011; Nevado-Holgado et al., 2014; de la Crompe et al., 2020).

В настоящее время данные об участии GPe в аномальной нейросетевой активности и о его вкладе в процесс развития двигательных нарушений при БП весьма ограничены. Большинство экспериментальных работ выполнено на анестезированных животных, поэтому реальный вклад GPe в развитие моторной дисфункции еще предстоит выяснить. В нашей работе локальную полевую активность в GPe регистрировали одновременно с записью ЛПП в основных структурах моторной нейросети у бодрствующих животных во время ходьбы в круговом тредмилле в контроле и при экспериментальной БП.

МЕТОДИКА

Все экспериментальные процедуры были одобрены комиссией по этике ИТЭБ и соответствовали Директиве Европейского парламента и Совета (2010/63/EU). Сделано все возможное для уменьшения количества использованных в работе животных и минимизации их дискомфорта.

Животные и хирургические операции. Опыты проводили на крысах-самцах аутобредной линии Вистар (300–350 г). Животные содержались в виварии в индивидуальных клетках в контролируемых условиях (22–24°C, 12 ч цикл свет/темнота) и имели доступ к еде и воде без ограничения.

Крыс анестезировали тилетамином-золепамом (Золетил, 18 мг/кг) и ксилазином (12 мг/кг), вводимыми внутримышечно. Для поддержания нормальной температуры тела животных использовали термоплатформу, частоту сердечных сокращений контролировали пульсоксиметром (Oxy9Vet Plus, Bionet, S. Korea). Животное помещали в стереотаксис, местный анестетик (1%-й мепивакаин гидрохлорид) вводили в зону намечаемого разреза. Для разрушения ДА-синтезирующих клеток SNc (n = 29) в область левого медиального переднемозгового пучка (координаты: AP = 4.6 мм, ML = 1.2 мм, DV = –8.3 мм) вводили 6 мкг нейротоксинa 6-OHDA (Sigma-Aldrich) в объеме 3 мкл физиологического раствора, содержащего 0.1% аскорбиновой кислоты, со скоростью 1 мкл/мин. Для защиты норадренергических нейронов за 20 мин до инъекции 6-OHDA вводили дезметилимипрамин (15 мг/кг, в/бр). Контрольной группе крыс (n = 7) вместо нейротоксина вводили физиологический раствор.

Для регистрации ЛПП использовали имплант, состоящий из пучка пяти стальных изолированных электродов (диаметр 50 мкм), с одного из которых удаляли изоляцию на расстоянии 0.5 мм от кончика (локальный референтный электрод). Исследование проведено на 3 группах крыс: 1-я группа – контрольные животные (n = 7) и 2 группы животных с односторонним повреждением ДА-нейронов левого полушария мозга (n = 29). У животных с повреждением ДА-нейронов (n = 8) билатерально имплантировали электроды в наружную часть бледного ядра интактного и поврежденного полушарий (GPe: AP = = 0.9 мм, ML = 3.0 мм, DV = –6.5 мм). Остальным крысам с повреждением ДА-нейронов (n = 21) и контрольным (n = 7) электроды вживляли в левую половину полушария в 5/6 слой MCx (AP = –2.0 мм, ML = 2.7 мм, DV = –2.0 мм), SNr (AP = 5.7 мм, ML = 2.2 мм, DV = –8.0 мм), dStr (AP = 0.15 мм, ML = 3.5 мм, DV = –4.5 мм) и GPe (см. выше). Общим заземлением служил винт в кости над мозжечком.

Анализ двигательной активности в круговом тредмилле. Регистрацию ЛПП в звеньях моторной нейросети проводили в состоянии покоя и во время ходьбы крыс в круговом тредмилле. За основу прибора взята конструкция, представленная в работе Avila et al. (2010). Перед проведением операции животных тренировали ходить в направлении по и против часовой стрелки при скорости вращения платформы 9 оборотов в минуту (15–20 мин, 3 раза в день, в течение 3–4 дней). Kрысы с односторонним повреждением могли идти в направлении против часовой стрелки (влево, в сторону поврежденного полушария). Однако при ходьбе по часовой стрелке (вправо, направление в сторону интактного полушария) животные испытывали затруднения вплоть до полной неспособности идти при вращении платформы тредмилла. Для количественной оценки двигательной активности в контроле и у крыс с односторонним ДА-дефицитом, а также определения влияния леводопы применяли метод, основанный на расчете величины отношения числа шагов, сделанных задней внутренней лапой, к числу шагов, совершенных задней наружной лапой, при ходьбе животного в тредмилле в направлении по (вправо) и против (влево) часовой стрелки (Brazhnik et al., 2016). Подсчет количества шагов проводили в пяти 30-секундных проходках, и полученные величины отношения усредняли по каждому направлению движения, а также вычисляли % завершенных проходок.

Регистрация локальных полевых потенциалов. Регистрацию ЛПП проводили на бодрствующих крысах в дневное время. Животных помещали в тредмилл за 5 мин до начала опыта для адаптации. Сигналы ЛПП усиливали в 1000 раз (Grass Instruments Semiconductor) Model 12 Neurodata Acquisition System, США). Для оцифровки сигнала использовали 16-канальный PCIDAS 1200JR (с разрешением A/D 330 КГц, при уровне оцифровки 1000 Гц) и фильтровали в диапазоне 3–200 Гц для последующей обработки с помощью программы Datapac 2k2 (Run, США). Записи с каждого электрода реферировали к локальному референтному электроду. Регистрацию активности в отделах моторной нейросети проводили в состоянии покоя и при ходьбе на 7, 14 и 21-й день после имплантации электродов. На 28–35-й день после 10-минутной записи активности во время ходьбы крысам вводили леводопу (5 мг/кг, пк) с последующей регистрацией ЛПП в течение 20–60 мин. Видеорегистрация ходьбы в тредмилле была синхронизирована с записью активности ЛПП.

Спектральный анализ локальных полевых потенциалов. Для анализа электрической активности взяты записи, не имевшие двигательных артефактов. Записи экспортировали в программу Spike2 (CED, UK) с последующим анализом с помощью скриптов, написанных для Spike2 и MATLAB. Для расчета мощности и когерентности брали 60 с эпохи и использовали оконное преобразование Фурье (ширина окна 1 с, смещение 250 мс). Данные, полученные с 2 электродов в каждой структуре, усредняли. Гистограммы спектральной плотности строили в диапазоне 10–100 Гц с разрешением 1 Гц, вычисляли ведущую частоту (Гц), интегральную мощность ритмов (мВ²/Гц) и когерентность между структурами в исследуемых диапазонах частот. Частоты пиков в спектрах мощности и когерентности считали значимыми, если они удовлетворяли критериям, описанным ранее (Brazhnik et al., 2016). При анализе ЛПП использовали величины значимых пиков спектров в β- (25–40 Гц) и γ- (45–90 Гц) частотных диапазонах. Мощность и среднее значение когерентности в спектрах определяли от величины пика частоты +/–3 Гц, т.е. при расчете для β-осцилляций использовали диапазон частот 30–36 Гц, а для γ- осцилляций – 50–56 Гц. Мощность рассчитывали как сумму площадей шести 1-герцевых столбцов, окружающих значимый пик, плюс площадь пика. Величину когерентности определяли как среднее значение когерентности в 7 столбцах.

Гистологический контроль. После окончания экспериментов у животных под глубоким наркозом проводили электролитическую маркировку мест отведения. Крыс перфузировали 4%-м раствором формальдегида в фосфатном буфере. На срезах мозга толщиной 40 микрон верифицировали положение электродов и определяли содержание тирозингидроксилазы (TH) в стриатуме и SNc и SNr, используя первичные кроличьи поликлональные антитела (Pel-Freez Biologicals, USA), вторичные биотинилированные антикроличьи IgG, с обработкой срезов авидин-биотин-пероксидазным комплексом (ABC-kit, Vector Labs, USA) и выявлением окраски с помощью раствора диаминобензидина с перекисью водорода (DAB-kit, Vector Labs, USA). Снижение содержания TH (на ~98%) отмечено в SNc полушарий с ДА-дефицитом.

Статистическая обработка результатов. Результаты представлены средней величиной ± стандартная ошибка. Результаты поведенческого теста (ходьба в тредмиле) в контроле (ДА+), при дефиците дофамина (ДА–) и после введения леводопы (ЛД+) анализировались методом двухфакторного дисперсионного анализа (2-way ANOVA) с последующим применением апостериорного анализа Холма-Шидака (Holm-Sidak post hoc). Для анализа изменения мощности и когерентности осцилляций и выявления различий между группами данных использовали однофакторный дисперсионный анализ Краскела–Уоллиса и тест Данна (Kruskal–Wallis one-way ANOVA; Dunn’s post hoc). Для сравнения двух групп данных применяли U-критерий Манна–Уитни (Mann–Whitney U-test). При статистическом анализе использовали программу SigmaPlot 12.1 (SyStat Software) на уровне значимости p < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Одновременная регистрация активности GPe в контрольном полушарии и полушарии с повреждением дофаминсинтезирующих нейронов черной субстанции. Экспериментальная модель БП на грызунах с односторонним повреждением ДА-нейронов SNc позволяет сравнить активность в здоровом и поврежденном полушариях у животных во время ходьбы. Запись ЛПП у крыс в состоянии покоя или при ходьбе в направлении по или против часовой стрелки осуществляли с электродов, имплантированных в GPe обоих полушарий, начиная с 14-го дня после операции (8 животных). Осцилляторная активность в GPe полушарий с ДА-дефицитом отличалась от таковой в контрольном (рис. 1). Ритмическая активность в контрольном GPe была представлена осцилляциями в широком диапазоне γ-частот (45–90 Гц) (рис. 1 (а)). Эти осцилляции возникали при ходьбе и не наблюдались в состоянии покоя. В то время как в записях активности GPe полушарий с ДА-дефицитом во время ходьбы были выявлены два выраженных спектральных пика: первый в β-диапазоне частот (25–40 Гц, пик 33.6 ± 0.6 Гц), второй в γ-дипазоне (45–60 Гц, пик 51.1 ± 0.4 Гц) (рис. 1 (б)). Мощность ЛПП в β-диапазоне частот в GPe полушарий с ДА-дефицитом превышала величину этого показателя в контрольных полушариях в два раза (11.7 ± 2.2 × × 10^–6 мВ²/Гц и 6.1 ± 0.8 × 10^–6 мВ²/Гц, p = = 0.036, U-тест). Отметим, что в полушариях с ДА-дефицитом осцилляции в β- и γ-диапазонах нередко регистрировались с разных электродов одного и того же пучка, хотя в ряде случаев в записях с одного электрода присутствовали осцилляции в обоих частотных диапазонах. Учитывая это, можно разделить записи ЛПП из GPe полушарий с ДА-дефицитом на две группы (с частичным перекрытием частот) – с доминантными β- (рис. 1 (б1), n = 4) и γ-осцилляциями (рис. 1 (б2)), n = 4).

Рис. 1.

Одновременная регистрация ЛПП в GPe контрольного ДА(+) и полушария с ДА-дефицитом ДА(–). (а, б): спектры мощности и примеры осцилляций в β- (30–36 Гц) и γ- (50–56 Гц) частотных диапазонах в покое (П) и при ходьбе. На вставках представлены примеры ЛПП, отфильтрованных в β- и γ-частотных диапазонах. (б1): спектры мощности и образцы ЛПП с доминантными β-осцилляциями. (б2): то же в записях с доминантными γ-осцилляциями. Пики обозначены стрелками. (в, г): динамика мощности осцилляций в GPe при ходьбе. Цифрами обозначены 1-минутные интервалы времени.

Fig. 1. Simultaneous recordings of LFP activity from the GPe in control (DA+) and DA-depleted (DA–) hemispheres. (а, б): averaged GPe LFP power spectra and examples LFP recordings filtered in β- (30–36 Hz) and γ- (50–56 Hz) frequency ranges with FIR-digital band pass filters. (б1) and (б2) represent LFP power spectra in the GPe and traces of band pass filtered LFP activity from the channels with dominant β- or γ-oscillations from the DA(–) hemisphere. (в, г): dynamic of total LFP power in β- or γ-frequency ranges in the GPe from rest (R) and walking in the two hemispheres. Numbers above bars represent consequent 60-s epochs of walking.

Изменения мощности осцилляций в β- и γ-частотных диапазонах в полушариях с ДА-дефицитом имели противоположную направленность (рис. 1(г)). Наибольшая мощность β-осцилляций отмечена в начале движения, и она существенно снижалась при ходьбе. В отличие от β, γ-осцилляции первоначально имели широкий частотный диапазон (45–90 Гц, пик 76.7 ± 1.9 Гц), и они быстро замещались осцилляциями в узком диапазоне частот, 50–56 Гц (пик 51.1 ± 0.4 Гц) с одновременным возрастанием их мощности. Как в контрольном полушарии, так и в полушарии с ДА-дефицитом cмещение происходило в течение 1–2 мин после начала ходьбы животного. Oтметим, что осцилляции с частотой 50–56 Гц в GPe в контрольных полушариях и полушариях с ДА-дефицитом были стабильны и длительны, присутствуя в течение ~80% времени в первые 200 с ходьбы (158.3 ± 6.8 с и 164.6 ± 6.3 с соответственно). Мощность γ-осцилляций в контрольном полушарии была ниже при ходьбе влево, но достоверно не отличалась от таковой на поврежденной стороне. При движении вправо, когда животные испытывали затруднения, осцилляции в диапазоне ~50 Гц возникали в обоих полушариях раньше, чем при ходьбе влево. При этом мощность γ-осцилляций была выше в полушариях с ДА-дефицитом при ходьбе вправо (8.5 ± 2.5 × 10^–6 мВ²/Гц), чем при ходьбе влево (6.9 ± 2.3 × 10^–6 мВ²/Гц, p = = 0.013, U-тест).

2. Осцилляторная активность в моторных нейросетях в контрольной группе и у животных с односторонним дефицитом ДА. Для оценки роли GPe в механизмах возникновения и передачи β- и γ-осцилляций в моторных сетях после повреждения ДА-синтезирующих клеток регистрировали ЛПП в MCx и ядрах BG в контроле и у крыс с односторонним ДА-дефицитом. Величины мощности осцилляторной активности в двух частотных диапазонах (β и γ) в GPe сравнивали с мощностью осцилляций в MCx, dStr и SNr, a величины когерентности ЛПП в парах MCx – dStr, MCx – GPe, dStr – GPe, GPe – SNr – со значением когерентности в паре MCx – SNr.

2.1. Усиление мощности осцилляций в моторных сетях при дефиците дофамина. В данной работе при анализе ЛПП в отделах нейросети MCx – BG выявлены значительные различия в активности между двумя группами животных, контрольной (ДА+) и с ДА-дефицитом (ДА–) (рис. 2 (а, б)). Установлено, что в полушариях с ДА-дефицитом β-осцилляции (30–36 Гц) возникали во время ходьбы и доминировали в MCx и SNr в 100% случаев, и в 50–88% присутствовали в dStr и GPe (рис. 2 (в)). Наибольшая величинa мощности β-осцилляций, нормализованная к осцилляциям в состоянии покоя, выявлена в MCx и SNr (MCx: 4.2 ± 0.3, n = 21; SNr: 3.3 ± 0.4, n = 21), а ее величины в dStr и GPe были значительно ниже (dStr: 1.4 ± 0.8, n = 12; GPe: 1.5 ± 0.8, n = = 21; p < 0.001, Kruskal–Wallis test). Заметим, что β-осцилляции отсутствовали во всех структурах в состоянии покоя (рис. 2 (б)) и в записях у контрольных животных (рис. 2 (а)). Величины мощности осцилляций в β-диапазоне в записях ЛПП из ядер BG и MCx полушарий с ДА-дефицитом при ходьбе были достоверно выше их величин в контрольных полушариях: MCx (p < 0.001, n = 23 и 7), SNr (p < 0.001, n = 20 и 7), GPe (p < 0.01, n = 24 и 7), dStr (p < 0.01, n = 12 и 5 соответственно; U-тест; рис. 2 (г)).

Рис. 2.

β- и γ-Осцилляции в MCx и ядрах BG в контроле (ДА+) и полушариях с ДА-дефицитом (ДА–). (а, б): спектры мощности осцилляций в отделах моторной нейросети в покое и при ходьбе. Стрелками обозначены пики в β- и γ-частотных диапазонах. (в): наличие ЛПП с осцилляциями в ДА(+) и ДА(–) группах. (г): Нормализованные к состоянию покоя мощности β- и γ-осцилляций в отделах нейросети при ходьбе. *р < 0.05, выше в MCx и SNr в сравнении с dStr and GPe в ДА(–); #р < 0.01, выше в ДА(–) в сравнении с ДА(+).

Fig. 2. β- and γ-oscillatory activity in the MCx and BG in control group (DA+) and rats with DA-deficit (DA–). (а, б): averaged LFP power spectra in motor circuits in DA(+) and DA(–) groups during rest and treadmill walking. Arrows show peaks in LFP spectra associated with β- or γ-oscillations. (в): histograms indicate % LFP power spectra with prominent oscillations in each node of motor circuits in DA(+) and DA(–) groups. (г): normalized to rest total LFP power of oscillations in the MCx and BG nuclei in DA(+) and DA(–) during walking. *р < 0.05, higher in MCx and SNr relative to dStr and GPe in DA(–); #р < 0.01, higher in DA(–) relative to DA(+).

Кроме β-осцилляций в dStr и GPe полушарий с ДА-дефицитом выявлено усиление осцилляций в узком γ-частотном диапазоне (50–56 Гц) при ходьбе (рис. 2 (б)). В записях из MCx и SNr γ-осцилляции у животных с ДА-дефицитом не обнаружены (рис. 2 (б)), так же как и в контрольной группе (рис. 2 (а)). При этом в записях из dStr и GPe в контрольной группе во время ходьбы преимущественно регистрировались осцилляции низкой мощности в широком диапазоне γ-частот (45–90 Гц) с краткими эпизодами 50–56 Гц γ-осцилляций. Oсцилляции в γ-диапaзоне (50–56 Гц) отмечены в 50% записей из GPe и 33% из dStr в контроле, но не обнаружены в MCx и SNr (рис. 2 (в)). Заметим, что в GPe и dStr контрольной группы длительность эпизодов осцилляций с частотой 50–56 Гц в течение первых 200 с ходьбы была в 6.5 раза меньше, чем у животных с ДА-дефицитом (24.5 ± ± 11.2 с и 159.1 ± 6.5 с соответственно). При этом нормализованная мощность γ-осцилляций (50–56 Гц) в dStr и GPe была выше в полушариях с ДА-дефицитом по сравнению с контрольными (dStr: 2.1 ± 0.1 и 1.3 ± 0.2 соответственно, p = 0.023, n = 12 и 7; GPe: 3.9 ± 0.4 и 1.6 ± 0.1 соответственно, p < 0.001, n = 24 и 7; U-тест; рис. 2 (г)).

2.2. Когерентность осцилляций в моторной нейросети. Возрастание мощности β- и γ-активности в полушариях с ДА-дефицитом сопровождалось увеличением когерентности осцилляций в этих частотных диапазонах между компонентами моторной нейросети (MCx – dStr – GPe – SNr) (рис. 3). Увеличение когерентности β-осцилляций в полушариях с ДА-дефицитом представлено спектрами когерентности (рис. 3 (а, б)), гистограммами, демонстрирующими наличие (%) когерентных осцилляций во всех парах структур изучаемой нейросети (рис. 3 (б)), и графиками средних величин когерентности (рис. 3 (г)). В состоянии покоя и у контрольных животных когерентные β-осцилляции отсутствуют (рис. 3 (а, б)). При ходьбе величина когерентности β-осцилляций возрастала в полушариях с ДА-дефицитом во всех парах изучаемых компонентов нейросети (p < 0.001, U-тест). При этом oчевидно, что когерентность в паре MCx – SNr значительно выше (0.51 ± 0.03), чем в парах MCx – dStr (0.16 ± 0.05), MCx – GPe (0.1 ± ± 0.02), GPe – SNr (0.11 ± 0.03) и GPe – dStr (0.09 ± 0.02) (p < 0.001, Kruskal–Wallis test) (рис. 3 (а, г)).

Рис 3.

Усиление синхронизации между отделами моторной нейросети в полушариях с ДА-дефицитом. (а, б): спектры когерентности между отделами нейросети в покое и при ходьбе. Стрелки указывают пики когерентности в 2 частотных диапазонах. (в): наличие когерентных ЛПП в парах структур нейросети в ДА(+) и ДА(–) группах. (г): когерентность между отделами нейросети при ходьбе. *р < 0.05, выше в парах MCx – SNr (β ритм) и dStr – GPe (γ ритм) в ДА(–) группе; §р < 0.05, выше для dStr – GPe (γ ритм) в ДА(+) группе; #р < 0.01, выше в ДА(–) в сравнении с ДА(+).

Fig. 3. Increases in LFP coherence between different elements in the motor circuits after loss of dopamine. (а, б) averaged LFP coherence spectra in motor circuits in DA(+) and DA(–) groups during rest and walking. Arrows show peaks in LFP coherence spectra associated with γ-oscillations. (в): histograms indicate the % coherence spectra in pairs from motor circuits with β- or γ-oscillations in DA(+) and DA(–) groups during walking. (г): averaged LFP coherence in pairs from motor circuits in DA(+) and DA(–) groups during walking. *р < 0.05, higher in MCx – SNr pair in DA(–) group; *р < 0.05, highest in MCx-SNr (β-rhythm) and dStr – GPe (γ-rhythm) in DA(–) group; §р < 0.05, highest in dStr – GPe in DA(+) group; #р < 0.01 higher in DA(–) relative to DA(+).

В паре GPe – dStr полушарий с ДА-дефицитом, помимо когерентных β-осцилляций, в 100% записей выявлены значительные когерентные γ-осцилляции в узком диапазоне частот (50–56 Гц) (рис. 3 (а, б)). Когерентность γ-осцилляций между dStr и GPe на 14–21-й день после введения нейротоксина была высокой (0.30 ± 0.03) (рис. 3 (б, г)), и ее величина повышалась к 28–35-му дню до 0.39 ± 0.03. В контроле в 80% записей из dStr и GPe регистрировались когерентные осцилляции в широком диапазоне γ-частот (45–90 Гц), наличие которых подтвержденo спектрами когерентности (рис. 3 (а)) и представлено на графиках их средних величин (рис. 3 (г)). При этом расчетные величины когерентности для диапазона частот в контроле (0.17 ± 0.06) были выше порогового уровня, но достоверно ниже соответствующих величин в полушариях с ДА-дефицитом (0.30 ± 0.03, p < 0.05, t-тест). В других парах структур моторной сети как в контроле, так и при ДА-дефиците когерентные γ-осцилляции в диапазоне 50–56 Гц отсутствовали.

2.3. Влияние стимуляции дофаминергических рецепторов. Для того чтобы показать, что возникновение синхронизованной в β-частотном диапазоне активности в ядрах BG связано с утратой способности нейронов SNc синтезировать ДА, мы вводили леводопу. Опыты выполнены через 21–35 дней после повреждения ДА-синтезирующих нейронов (n = 23). Леводопа значительно снижала мощность и когерентность β-осцилляций в MCx и ядрах BG при ходьбе, как и выраженность и когерентность γ-осцилляций в dStr и GPe в диапазоне 50–56 Гц. При этом в записях из GPe у 6 из 13 животных с ДА-дефицитом снижение мощности 50–56 Гц γ-осцилляций (пик 53.1 ± 0.6 Гц) сопровождалось одновременным восстaновлением паттерна 45–90 Гц γ-осцилляций (пик 73.1 ± 1.7 Гц), сходным с записями ЛПП в контроле. Спектры мощности осцилляций до и после введения леводопы представлены на рис. 4 (а), а спектры когерентности – на рис. 4 (б). Значительное снижение когерентности осцилляций наблюдалось при ДА-дефиците во всех парах моторной нейросети и подтверждалось уменьшением числа спектров с когерентными осцилляциями (рис. 4 (в)), а также снижением средних величин когерентности (рис. 4 (г)).

Рис. 4.

Влияние стимуляции ДA-рецепторов при введении леводопы (ЛД+) на осциляциии в моторной нейросети и выраженность двигательных нарушений при ДA-дефиците. (а): спектры мощности до и после ЛД+. (б): спектры когерентности между отделами нейросети при тех же условиях. (в): наличие когерентных ЛПП до и после ЛД+. (г): когерентность между отделами нейросети в ДA(–) группе до и после ЛД+. *р < 0.05, выше в парах MCx – SNr (β ритм) и dStr – GPe (γ ритм) в ДА(–) группе; #p < 0.05, снижение после ЛД+. (д): Оценка двигательного дефицита при ходьбе в круговом тредмилле. Сторона повреждения и пораженные лапы обозначены белыми кружками. (и): отношение числа шагов при ходьбе влево и вправо в ДA(+), ДА(–) и ЛД(+). #p < 0.05, ниже при ходьбе влево в ДA(–). (ж): % завершенных 30-секундных проходок.

Fig. 4. Effects of levodopa (LD+)-induced dopamine receptors stimulation on LFP synchronization and treadmill walking in DA(–) group. (а): LFP power spectra before and after LD(+). (б): LFP coherence spectra in motor circuit under the same conditions. (в): Histograms indicate the % coherence spectra with oscillations before and after LD(+). (г): Averaged LFP coherence before and after LD(+). *р < 0.05, the same as in Fig. 3 (г); #р < 0.05, higher before relative to LD(+). (д): Experimental design for motor behavior scoring. Affected paws and DA(–) hemisphere are indicated by open circles. (и): Step count ratios during walking in DA(+), DA(–) groups and following LD(+). # p < 0.05, lower as walking to the right in DA(–) group. (ж): % completed walking trials.

Используя круговой тредмилл, можно количественно оценить степень двигательных нарушений и выявить эффект заместительной терапии леводопой у животных с ДА-дефицитом. Крысы контрольной группы идут равномерно в круговом тредмилле (рис. 4 (д)) влево и вправо, что подтверждается одинаковыми величинами отношения числа шагов при ходьбе (0.93 ± 0.01 и 0.98 ± 0.01 соответственно, рис. 4 (и), см. ДА+) и 100%-й завершенностью 30-секундных проходок (рис. 4 (ж), см. ДА+). После одностороннего повреждения ДА-нейронов величина отношения числа шагов при ходьбе вправо значительно уменьшалась (0.51 ± 0.05, p < 0.001, 2-way ANOVA; рис. 4 (и), см. ДА–), а также снижалось до 42% число завершенных 30-секундных проходок (рис. 4 (ж), см. ДА–). Леводопа снижала мощность β- и γ-осцилляций в звеньях моторной нейросети, и животные могли идти в направлении по часовой стрелке (вправо), а отношение числа шагов при ходьбе вправо и влево было соответственно 0.87 ± ± 0.02 и 0.97 ± 0.01, p > 0.05 (рис. 4 (и), см. ЛД+). При этом число завершенных 30-секундных проходок вправо приближалось к 100% (рис. 4 (ж), см. ЛД+).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В экспериментальной модели БП мы изучали роль GPe в возникновении и распространении синхронизованной осцилляторной активности в моторных нейросетях, появляющейся после повреждения ДА-синтезирующих клеток SNc. В контрольной группе и у крыс с БП регистрировали ЛПП в MCx и ядрах BG в покое и при ходьбе. Анализ ЛПП в MCx и ядрах BG показал, что в структурах полушарий с ДА-дефицитом при ходьбе, но не в состоянии покоя или в интактном мозге, возникают аберрантные β-осцилляции (30–36 Гц). Мощность и когерентность осцилляций были наибольшими в MCx и SNr, в то время как выраженность осцилляций в dStr и GPe была ниже, как и величины их когерентности с MCx и SNr. Помимо β-осцилляций выявлена синхронная γ-активность в диапазоне 50–56 Гц при ходьбе, исключительно в dStr и GPe. В MCx и SNr осцилляции в γ-диапазоне отсутствовали. В ЛПП dStr и GPe у контрольных животных при ходьбе регистрировались осцилляции низкой мощности и в более широком диапазоне γ-частот (45–90 Гц).

Вклад GPe в процесс генерации и распространения β-частотных осцилляций. β-Осцилляции, регистрируемые у пациентов с БП, часто ассоциируют с возникновением таких симптомов, как тремор, ригидность, акинезия и брадикинезия (Weinberger et al., 2009). Предполагается, что в генерации β-активности участвует реципроктная микросеть STN – GPe (Plenz, Kita, 1999; Mallet et al., 2008; Tachibana et al., 2011; Koelman, Lowery, 2019), а моторный неокортекс способствует усилению их мощности и распространению этой активности в нейросети BG – таламус – MCx (Sharott et al., 2018; West et al., 2018; Baaske et al., 2020; de la Crompe et al., 2020). GPe имеет обширные реципроктные связи с моторными отделами неокортекса и всеми ядрами BG (Chen et al., 2015; Saunders et al., 2015; Abecassis et al., 2019). В силу центрального расположения оно может вносить существенный вклад в осцилляторную активность в моторных нейросетях, контролирующих локомоцию (рис. 5). В последнее время отношение к роли GPe в работе моторных нейросетей существенно изменилось – от оценки его как простого передаточного звена информационного потока от моторной коры и стриатума к выходным ядрам – SNr/GPi (Albin et al., 1989; Hernandez et al., 2015) до признания его центральным и интегративным звеном в системе BG (Kita, 2007; Gittis et al., 2014; Mastro et al., 2017; de la Crompe et al., 2020; Dong et al., 2021).

Рис. 5.

Схема связей между отделами неокортекса и ядрами базальных ганглиев у крыс. GPe входит в состав двух основные моторных нейросетей: MCx – базальные ядра – таламо-кортикальная сеть (сплошная линия), включающая Рro-GPe нейроны как ключевой элемент непрямого стриопаллидарного пути, и FСx – стриопаллидарная сеть (пунктирная линия), включающая Аrk-GPe-нейроны с их возвратными тормозными проекциями к FSI и MSNs стриатума. STN контролирует активность Рro и Аrk GPe-нейронов. Сокращения: DA –дофаминергические; GABA – ГАМК-ергические и Glu – глутаматергические проекции, FCx – фронтальная кора.

Fig. 5. Schematic representation of main connections of the BG – neocortex network of the rodent brain. GPe connectivity comprises the two major neuronal motor circuits: (1) the MCx – BG – thalamocortical with Рro-GPe and (2) the FCx – striato – pallidal with Аrk-GPe, which are interlinked with the STN. Dopaminergic (DA) – GABAergic (GABA), and glutamatergic (Glu) projections are depicted by diamond, arrow and circuit heads, respectively. FCx – frontal neocortex.

Предполагается, что дихотомическая организация нейронных популяций в GPe играет заметную роль в генерации и проведении β-осцилляций при БП (Mallet et al., 2012; Mastro et al., 2014, 2017; Abdi et al., 2015; Pamukcu et al., 2020). Детально описаны две группы нейронов в GPe: быстроразряжающиеся прототипные (Pro-GPe) и низкочастотные аркипаллидальные (Ark-GPe). Активности этих групп нейронов находятся в противофазе. Каждая субпопуляция нейронов GPe вносит специфический вклад в контроль двигательной активности. Pro-GPe нейроны, экспрессирующие парвальбумин и транскрипционные факторы Nkx2.1 и Lhx6 (Abdi et al., 2015; Dodson et al., 2015; Hernandes et al., 2015; Abrahao, Lovinger, 2018), в основном проецируются на субталамическое ядро и выходные ядра BG. Предполагается, что они участвуют в генерации β-активности в паре GPe – STN и ее распространении через выходные ядра базальных ганглиев, GPi и SNr, на моторные ядра таламуса и неокортекс (Saunders et al., 2015; Mallet et al., 2019).

В целом не ясно, какие звенья моторной сети вносят принципиальный вклад в процесс генерации и распространения β-активности: MCx и ее проекции к BG (Sharott et al., 2018), микросети STN – GPe (Bevan et al., 2002; Tachibana et al., 2011; Koelman, Lowery, 2019) и dStr – GPe (McCarthy et al., 2011; Corbit et al., 2016) или более широкая нейросеть, включающая таламус (Nevado-Holdago et al., 2014; Brazhnik et al., 2016; Singh, 2018). Результаты нашей работы показывают, что когерентныe β-осцилляции присутствуют во всех звеньях нейросети BG – MCx при дефиците ДА, и их мощность со временем возрастает. Данные, полученные при регистрации активности в MCx и ядрах BG, выявили наибольшую мощность β-осцилляций в MCx и SNr, напрямую связанных со структурами, контролирующими локомоцию. С другой стороны, мощность β-осцилляций в dStr, получающего информацию от моторной коры и GPe, была низкой, как и величины когерентности β-осцилляций в этих ядрах с активностью в MCx и SNr в β-частотном диапазоне.

В соответствии с ранними работами о наличии аберрантной β-активности в MCx и SNr (Brazhnik et al., 2012; 2016), а также в STN у крыс с ДА-дефицитом (Delaville et al., 2015), результаты этого исследования во многом подтверждают предположение о ключевой роли гиперпрямого пути от MCx к STN в генерации и распространении патологической β-активности по моторной сети (Nambu et al., 2002; Polyakova et al., 2020). Данные о том, что мощность β-осцилляций в MCx и SNr наибольшая, подтверждают предположение о преимущественном вкладе гиперпрямого пути (MCx – STN – SNr) в передачу β-активности, в то время как участие dStr и GPe в генерации и распространении β-ритмов минимально. Сильным аргументом в пользу этого предположения служит и тот факт, что β-активность в моторной коре является ведущей по отношению к β-активности в субталамическом ядре у пациентов с БП (Litvak et al., 2011; Sharott et al., 2018) и у животных с экспериментальной БП (Sharott et al. 2005; Polyakova et al., 2020). Отметим, что моторный таламус, получающий моносинаптические связи от SNr и посылающий прямые связи к MCx, является необходимым звеном в BG – таламо-кортикальной цепи, вовлеченной в проведение β-осцилляций (Nevado-Holgado et al., 2014; Brazhnik et al., 2016).

Вклад нейронной сети GPe – dStr в процесс усиления γ-осцилляций при дефиците дофамина. Мы показали, что при ходьбе у крыс с дефицитом ДА в GPe и dStr регистрируется устойчивая ритмическая активность в узком γ-диапазоне 50–56 Гц. Мощность этих осцилляций была значительна, как и величина когерентности, по сравнению с контрольной группой, где в ЛПП выявлены осцилляции низкой мощности в широком диапазоне γ-частот (45–90 Гц). Отметим, что в записях MCx и SNr в полушариях с ДА-дефицитом γ-осцилляции 50–56 Гц отсутствовали. Какова же природа γ-осцилляторной активности у животных с экспериментальной БП?

Ключевым компонентом сети ядер BG считается стриато-паллидальный путь, анатомические проекции которого хорошо изучены, но его роль до сих пор не ясна. Проекционные нейроны стриатума (MSNs) получают информацию от MCx и передают ее на выходное звено BG, GPi/SNr, через прямой стриато-нигральный путь (dMSNs), или к тем же ядрам опосредованно с переключением в GPe (Pro-GPe нейроны) – стриато-паллидальный непрямой путь (iMSNs). Вторая популяция GPe нейронов, Ark-GPe, экспрессирующие проэнкефалин (Mallet et al., 2012) и транскрипционныe факторы FoxP2 и Npas1 (Abdi et al., 2015; Hernandez et al., 2015; Hegeman et al., 2016; Abrahao, Lovinger, 2018; Pamukcu et al., 2020), получает сигнал по коллатералям от проходящего dMSNs (Ketzef, Silberberg, 2021) и за счет обратных проекций к стриатуму способна подавлять или усиливать активность его нейронов и, таким образом, регулировать степень их участия в передаче информации на выходные ядра BG, GPi/SNr и в контроле локомоции (Glajch et al., 2016; Mallet et al., 2016; Chuhma, 2021).

Нами установлено, что активность в GPe у животных с ДА-дефицитом представлена по крайней мере двумя частотными диапазонами – бета (30–36 Гц) и гамма (50–56 Гц). Природа синхронной γ-активности в диапазоне 50–56 Гц заслуживает особого внимания в связи с тем, что ее значительное усиление совпадает по времени с возникновением β-осцилляций у животных с БП. Кроме того, γ-активность 50–56 Гц в полушариях с ДА-дефицитом, как и в случае с β-осцилляциями, эффективно устранялась или значительно снижалась при введении леводопы с восстaновлением контрольного паттерна активности (45–90 Гц) и нормальной локомоции, что указывает на очевидную связь усиления этого ритма с нарушением двигательной функции у животных с БП.

Результаты морфологических исследований позволяют предположить, что обратные проекции от Ark-GPе-нейронов к стриатуму контролируют активность проекционных нейронов (MSNs) и высокочастотных интернейронов (FSI) стриатума (Berke, 2009; Mastro et al., 2014; 2017). Показано, что спайковая активность FSI имеет высокую корреляцию с ЛПП стриатума в диапазоне γ-частот (см. Berke, 2009), а их локальная оптостимуляция способна запустить осцилляции в γ-частотном диапазоне (Cardin et al., 2009). Наличие γ-осцилляций обнаружено также у части проекционных нейронов стриатума (Lemaire et al., 2012). Данные, полученные на моделях моторных сетей с аберрантной синхронизацией, сходной с наблюдаемой при БП, свидетельствуют, что для возникновения и проведения по нейронной сети BG осцилляторной активности необходимо взаимодействие между GPe- и FSI-нейронами стриатума (Corbit et al., 2016). Это в определенной степени подтверждает участие GPe в проведении γ-осцилляций к dStr и их усиление при ДА-дефиците.

Результаты клинических наблюдений свидетельствуют, что нарушения процессов планирования и осуществления действия (исполнительная функция) вносят значительный вклад в возникновение специфической двигательной симптоматики при БП – застывание (FoG), неспособность начать движениe (акинезия) или изменить его направление. В работах последних лет показана связь между развитием FoG и дисфункцией фронтальных и префронтальных отделов неокортекса при БП (Maidan et al., 2015, Belluscio et al., 2019). Активность во фронтальных и префронтальных отделах неокортекса у контрольных животных характеризуется наличием γ-осцилляций в диапазоне 40–90 Гц (см. обзор Berke, 2009), которые могут контролировать функцию проекционных отделов мозга, в частности, ядер BG (Smith et al., 2016; Choi et al., 2019; McGregor et al., 2019). Усиление мощности и длительности γ-осцилляций (50–56 Гц), регистрируемых в dStr и GPe у животных с ДА-дефицитом, по времени совпадает с появлением двигательных нарушений (акинезии, застывания), что может быть специфической характеристикой дисфункции в сети фронтальная кора – стриато-паллидальная система при БП.

На основании представленных результатов можно считать, что при дефиците дофамина меняется баланс в функционировании отдельных элементов нейронных сетей, включающих различные отделы неокортекса и ядер BG. Следствием этого являются возникновение и распространение когерентных осцилляций в моторных нейросетях. Выявленные различия между двумя типами активности в GPe с ДА-дефицитом (β- и γ-осцилляции) предполагают наличие в нем двух нейронных популяций, Pro-GPe и Ark-GPe, которые участвуют в работе разных моторных сетей, контролирующих различные аспекты процесса движения. Высокосинхронизованная β-активность, обнаруженная при БП во всех звеньях MСx – BG – таламо-кортикальной нейросети и наиболее выраженная в MCx и SNr, в основном ассоциируется с возникновением брадикинезии. В то время как усиленная по мощности и продолжительности 50–56 Гц γ-активность в dStr и GPe у крыс с ДА-дефицитом может быть характеристикой состояния кортико-стриато-паллидальной нейросети, связанной с появлением специфических двигательных симптомов (акинезия, застывание) в ситуациях, когда нарушена исполнительная функция.

ВЫВОДЫ

1. B норме активность MCx и ядер базальных ганглиев, включая GPe, не синхронизированa, что обеспечивает координированную работу моторных нейросетей, контролирующих локомоцию.

2. Утрата ДА при БП сопровождается появлением когерентных осцилляций в MCx, GPe и другиx ядраx BG и приводит к нарушениям движения.

3. При дефиците ДА активность в GPe представлена осцилляциями в двух частотных диапазонах, β (30–36 Гц) и γ (50–56 Гц), что указывает на наличие в GPe по крайней мере двух, отличающихся по свойствам, нейронных групп.

4. β-Осцилляции, связанные с развитием брадикинезии, замедленностью движений и мышечной ригидностью при БП, имеют наибольшую мощность в MCx и SNr, а в GPe и dSTR их мощность значительно ниже, что предполагает минимальную роль этих ядер в передаче β-ритма в моторных нейросетях.

5. С другой стороны, усиление когерентной 50–56 Гц γ-активности в GPe и dSTR, но не в MCx и SNr, может быть связано с другими типами двигательных нарушений при БП – акинезией, неспособностью начать движение.

6. Наличие β- и γ-осцилляторной активности в GPe полушарий с ДА-дефицитом свидетельствует о сложности организации моторных нейросетей, контролирующих в норме различные аспекты локомоции.