Журнал высшей нервной деятельности им. И.П. Павлова, 2020, T. 70, № 5, стр. 650-654

ВВЕДЕНИЕ

В статье представлены результаты исследования влияния длительных монодиет на визуальные и поведенческие характеристики моллюска виноградной улитки и на электрическую активность ее идентифицированных нейронов. Выбор монодиет для исследования основан на содержании в пище незаменимой аминокислоты триптофана. Триптофан является предшественником 5-гидрокситриптофана (5-HTP), непосредственного прекурсора серотонина (5-гидроокситриптамина, 5-HT). В диетологии рекомендуются диеты и биологически активные добавки (БАД), содержащие продукты с большим количеством триптофана и 5-HTP, повышающие тонус, улучшающие состояние при депрессиях, нарушениях памяти и сна. Биохимиками получены данные о содержании разных аминокислот в пищевых продуктах [Скурихин, Волгарев, 1987]. Приводятся исторические сведения о нарушениях здоровья при недостатке триптофана [https://lahtaclinic.ru/article/pellagra/]. Однако не все медики уверены в эффективности триптофана, поступающего с пищей [http://dietolog.org/components/tryptophan/], для коррекции поведения, и поэтому рекомендуется использование триптофана и 5-HTP в качестве биологически активных добавок (БАД). Использование диет и БАД основано на данных о механизмах действия серотонина и его предшественников, в том числе на нейронном уровне.

В нейробиологии серотонин рассматривается как один из важнейших нейромодуляторов, участвующий в когнитивных процессах, включая функциональные состояния, внимание, эмоции и память. Однако одновременное изучение влияния экзогенных предшественников серотонина на поведенческом и нейронном уровнях у высших животных затруднительно. В качестве модельных объектов для таких исследований используются беспозвоночные. Так, Нобелевская премия по физиологии и медицине в 2000 г. присуждена Э. Кэнделу за достижения в исследованиях процессов обучения на нейронном уровне и серотонина как необходимого элемента обучающейся системы [Kandel, 2000]. Подробный обзор литературы о влиянии экзогенного серотонина и его предшественников на поведение и нейронную активность беспозвоночных животных опубликован в сборнике [Дьяконова, Сахаров, 2019] и в статьях [Сахаров, 1990; Цыганов, Сахаров, 2002]. Д.А. Сахаров использует экспериментальные данные для обоснования концептуального “гетерона” [Сахаров, 1990]. На аплизии и виноградной улитке получены данные о роли серотонина в обучении [Кэндел, 1980; Балабан, 2017; Kandel, 2009; Kandel, 2000; Balaban, 2002]. В большинстве работ изучение функций серотонина и его предшественников проводилось при их экзогенном введении. Задачей нашего исследования было сравнение поведенческих показателей и результатов внутриклеточной регистрации при естественном поступлении триптофана с пищей у виноградных улиток, находившихся длительное время на монодиетах.

МЕТОДИКА

Получение данных о нейронных механизмах действия пищевого триптофана на высших позвоночных животных затруднительно, поэтому мы использовали в качестве модельного объекта наземного легочного моллюска, виноградную улитку. Виноградная улитка Helix pomatia и Helix lucorum – хорошо изученный объект нейробиологических исследований [Балабан, 1987; Сахаров, 1992]. Основным среди прочих преимуществ улитки является наличие идентифицируемых нейронов, позволяющее сравнивать электрическую активность одних и тех же нейронов в разных опытах [Иерусалимский и др., 1992].

Основанием для выбора монодиет, на которых виноградные улитки находились длительное время (до 2 лет), из общих для человека и улиток продуктов являлось содержание в них триптофана [Скурихин, Волгарев, 1987]. Таким образом, были выбраны три широко распространенных растительных продукта: морковь, бананы и яблоки. По данным таблицы из сборника Нестерина и Скурихина [1979], бананы и морковь содержат 45 и 42 мг триптофана на 100 г продукта, а яблоки – 12 мг. Содержание триптофана в моркови и яблоках различается в 3–4 раза. Бананы для третьей экспериментальной группы улиток были выбраны для проверки возможного влияния других, кроме триптофана, веществ на исследуемые параметры. Кроме того, для бананов существуют значительные расхождения в литературных данных. Другой пищи улитки не получали все время исследования.

Исследование поведения. На разных беспозвоночных доказана зависимость активности от уровня эндогенного серотонина [Балабан, 1987; Сахаров, 1990]. В наших экспериментах для сравнения уровня активности (5 уровней — от нахождения в раковине до максимально активного с вытянутыми щупальцами) за улитками трех групп велось систематическое наблюдение, результаты которого фиксировали в таблицах данных. Об активности улиток судили также по порогу пробуждения улиток в ответ на электростимуляцию через парные серебряные электроды, фиксированные на раковине. Группы улиток, находившихся на монодиетах, были обозначены: М (морковная), Б (банановая) и Я (яблочная). Кроме того, сравнивалось положение в террариумах “спящих” улиток (уровень 0) по отношению к источнику света (внизу – вверху). Статистическая обработка полученных данных (расчет средних значений, отклонений от среднего, ошибки среднего и достоверность полученных данных по критерию Стьюдента) проводилась в программе Microsoft Excel 97-2003.

Активность нейронов. Улиток, прошедших поведенческую проверку, препарировали для электрофизиологического исследования. Использовали два вида полуинтактных препаратов: “расщепленная нога” и “ЦНС – висцера”. Электрическую активность нейронов регистрировали внутриклеточно стеклянными микроэлектродами, заполненными хлоридом или цитратом калия. Электрическая стимуляция мантийного валика осуществлялась парными электродами импульсами (50 мс) стимулятора. Внутриклеточная стимуляция проводилась через регистрирующий микроэлектрод с помощью мостовой схемы усилителя (MES – 8201, Nihon Kohden). Регистрируемые сигналы после усиления и оцифровки фиксировали в программе Axon и анализировали в Mini Analysis Program (Synaptosoft 6.0.7, by Justin Lee 1997-99).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Визуальные параметры. Цвет раковины и выраженность ее рисунка достоверно различались у улиток, длительное время находившихся на морковной (М), банановой (Б) и яблочной (Я) монодиетах. По слепому тесту на визуальные различия случайных наблюдателей (около 20) просили разделить на две группы улиток (2 по 7 улиток), который они безошибочно выполняли для групп, состоящих из спящих улиток, содержащихся на М- и Б-диетах. Раковины банановых улиток были значительно светлее, а видовые различия в их окраске улиток H. pomatia (Подмосковье) и H. lucorum (Крым) практически полностью отсутствовали [Палихова, 2016]. Еще одной особенностью улиток группы Б было наличие в их выделениях нерастворимого в воде окрашенного вещества. Можно предполагать, что это связано с различием ферментов, утилизирующих каротин, однако биохимических задач мы перед собой не ставили. Различия в окраске раковин для улиток М и Я групп не выявлялись.

Поведение, активность. Однозначной зависимости между содержанием улиток на М-, Б- и Я-диетах и их активностью не выявлено. По положению в террариуме обнаружено незначительное предпочтение улитками группы Б более освещенного верхнего положения. Зависимости между уровнем активности улиток, содержащихся на морковной и банановой монодиетах, не обнаружено (Т-тест 0.6, p ≤ 0.05) . Различий активности по порогу пробуждения также не выявлено (8.1 В и 7.6 В, n = 20).

Внутриклеточная активность нейронов. Зарегистрирована активность нейронов париетальных ганглиев 56 улиток, находившихся более полугода на М (28), Б (17) и Я (27) диетах. Активность нейронов сравнивалась по стандартным показателям: значение мембранного потенциала (МП, мВ), наличие фоновой спайковой активности и ее тип (синаптические и\или пейсмекерные ПД, А-спайки), порог генерации потенциала действия ПД и пейсмекерной спайковой активности (нА). Проверялось наличие реакции на механо- и/или электросенсорные стимулы. Определялись: МП (мВ), порог ПД (нА), порог пейсмекерной спайковой активности (нА), максимальная амплитуда суммарного синаптического ответа на электрокожное раздражение (сВПСП, мВ) (рис. 1).

Рис. 1.

Электрическая активность нейронов улиток 3 групп (М – морковная диета, n = 29, Б – банановая диета, n = 12, Я – яблочная диета, n = 27). Сравнение нейронов трех групп по мембранному потенциалу (а) и по значению порогового внутриклеточного тока (нА) для генерации ПД и спайковой пейсмекерной активности (б). (в) – суммарные кривые привыкания амплитуды сВПСП в сериях ритмической (0,1 Гц) электросенсорной стимуляции мантийного валика. Эффект гетеросинаптической потенциации зарегистрирован в 23 нейронах М-группы и в 8 нейронах Я-группы. Экстрастимул (стрелка) – укол ноги в серии ритмического раздражения мантии, разброс данных — ошибки среднего. Восстановление ответа нейрона тестировалось (тест) через 2 мин (2 мин) после серии ритмической стимуляции.

Fig. 1. Electrical activity of snails’ neurons from carrot (М, n = 29), bananas (Б, n = 12) and apples (Я, n = 27) diets. (а) – membrane potential (mV), (б) – meanings of the threshold of intracellular current (нА, nA) for AP generation and for spike pacemaker activity. (в) – habituation curves for synaptic responses evoked by rhythmical (0.1 Hz) electro-sensory stimulation of mantle. Heterosynaptic potentiation has been observed in 23 neurons of M-group of snails and in 8 neurons of Я-group. An extra-stimulus (arrow) was a shot to the foot; deviations are the errors of mean. Recovery of responses were tested (тест) after 2 min (2 мин) from rhythmic stimulation series.

Достоверных различий между активностью нейронов улиток М-, Б- и Я-групп обнаружено не было. Так, средние значения МП нейронов всех групп составляли около 50 мВ (рис.1 (а)). Нейроны, известные как командные для оборонительного поведения [Балабан, 1987], были типично молчащими с порогом ПД 1–4 нА и при больших значениях внутриклеточного тока генерировали спайковую пейсмекерную активность. Разброс пороговых средних значений для нейронов трех групп улиток объясняется различиями между идентифицированными нейронами подглоточного комплекса ганглиев и не выходит за пределы отклонений от среднего (рис. 1 (б)). Синаптические потенциалы возникали как в фоне, так и в ответ на механо- и электросенсорную стимуляцию разных участков тела на полуинтактных препаратах улитки (суммарные возбуждающие постсинаптические потенциалы, сВПСП, cEPSPs). Параметры вызванных ответов не отличались от известных [Иерусалимский и др., 1992]. Крупные нейроны в вентральной области париетальных ганглиев проявляли типичную для этих идентифицированных нейронов фоновую активность пейсмекерного, синаптического и смешанного типа. В ППа6, ППа7 и в ЛПа6-нейронах регистрировались типичные для этих нейронов аксонные спайки (А-спайки).

Так как влияние серотонина рассматривается в связи с его участием в процессах обучения [Балабан, 2017; Kandel, 2009], мы провели проверку хорошо изученных феноменов пластичности синаптических ответов париетальных нейронов [Палихова и др., 2019; Sokolov, Palikhova, 1999]. Первоначальные данные показали типичную динамику привыкания суммарных синаптических ответов. Не столь однозначны данные о влиянии надпороговой гетеросинаптической стимуляции на амплитуду сВПСП в серии ритмической электростимуляции мантийного валика. Эффект гетеросинаптической потенциации [Абрамова и др., 2007; Палихова, Пивоваров, 2016] наблюдался в 23 нейронах М-улиток из 29 нейронов в группе и в 8 нейронах Я-улиток из 27 нейронов в группе. Показано, что гетеросинаптическая потенциация возникает чаще в нейронах М-группы (около 80%), чем в нейронах Я-группы около (30%). Однако это предварительные данные, требующие проверки, так как использованный в качестве экстрастимула укол ноги трудно стандартизировать. С уверенностью можно говорить о том, что гетеросинаптическая потенциация регистрируется в нейронах обеих групп улиток, хотя и с разной частотой и динамикой (рис. 1 (в)).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, значимых различий как по поведенческим критериям, так и по нейронной активности у улиток, содержащихся длительное время на разных монодиетах, мы не нашли. В яблоках содержится в 3–4 раза меньше триптофана, чем в моркови и бананах, тем не менее явные внешние различия (окраска раковины) наблюдались только у улиток на банановой монодиете [Palikhova, 2016]. Это может быть связано с процессами метаболизма каротина, однако биохимических задач мы в наших экспериментах не ставили. Результаты внутриклеточного исследования идентифицированных нейронов улитки достоверно не отличались для улиток из 3 групп монодиет, а также от известных ранее данных [Иерусалимский и др., 1992]. Полученные данные поддерживают представление некоторых медиков о малом значении пищевого триптофана для обеспечения нормального метаболизма серотонина [https://healthylife.nsp.com/], однако вывод этих авторов о необходимости употреблять БАД мы не разделяем. В качестве перспективы предполагается продолжение исследований нейрональной пластичности для объяснения данных о роли экзогенного триптофана в индивидуальных различиях процессов кратковременной памяти и внимания.

Итак, значительных различий между улитками, содержащимися длительное время на монодиетах, содержащих разное количество триптофана, мы не обнаружили как по поведенческим критериям, так и по параметрам активности идентифицированных нейронов.