Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2021, T. 498, № 1, стр. 268-274

Распространение аногенитальных папилломавирусов в природе достаточно велико [1]. Ежегодный прирост количества заболеваний, характеризующихся разрастаниями у теплокровных по типу остроконечных кондилом Condyloma acuminata, вызываемых аногенитальными типами ВПЧ6 и ВПЧ11, достигает 1 млн случаев в тех странах, где осуществляется контроль за этим заболеванием [2], при этом в число заболеваний включаются не только аногенитальные кондиломы и бородавки, но также карциномы легких, миндалин и рак гортани [3]. Кроме того, известно [4], что аногенитальные типы папилломавирусов ВПЧ6 и ВПЧ11 ответственны за появление и развитие неканцерогенных (условно) рецидивирующих респираторных папилломатозов верхних дыхательных путей.

Вследствие возвратного характера этого заболевания пациенты вынуждены подвергаться многократному хирургическому вмешательству (от 40 до 150 раз) в течение своей жизни [5–7]. Полагают, что возвратный характер папилломатозов обусловлен латентным состоянием вируса без клинических признаков заболевания, не распознаваемого иммунной системой хозяина вследствие низкой копийности и малого содержания антигенов, но способным проявляться при иммуносупрессии, под действием внешних факторов (УФ радиация, ирритация и стрессы) [8]. Латентность ВПЧ поддерживается увеличением содержания транскриптов “раннего” гена ВПЧ Е1, ответственного за выживание и сохранность эписомальных геномов папилломавирусов в условиях ограниченной репликации [9].

Широкое распространение папилломатозов требует и достаточно крупных финансовых затрат. В США затраты на лечение аногенитальных папилломатозов составляют 220 млн долларов ежегодно [10], на лечение рецидивирующих респираторных папилломатозов тратится свыше 100 млн долларов [5, 6]. В странах Западной Европы, в частности, в Англии ежегодно затрачивается 16.8 млн фунтов стерлингов для лечения этих заболеваний [11].

Несмотря на то что ВПЧ6 L1 и ВПЧ11 L1 входят в состав таких вакцин, как квадривалентный Гардасил и 9-валентный нона-Гардасил, желательна разработка специальных вакцин против аногенитальных папилломатозов.

Гардасил послужил неплохим профилактическим препаратом, но только для предотвращения цервикального рака. Другие типы папилломатозов: рак головы и шеи [12], аногенитальные папилломатозы, рецидивирующие респираторные папилломатозы [13–15] оказались вне сферы действия этих вакцин и за последние 10 лет заболеваемость увеличилась примерно в 10 раз согласно статистике Международного агенства по изучению рака IARC, GLOBOCAN, WHO [16, 17]. Так как при этом все же у пациентов обнаруживались специфические антитела к типам ВПЧ6 и 11 (наряду с 16 и 18 типами), предположили, что одной из причин роста заболеваний является нарушение иммуногенеза Т лимфоцитов [2, 4, 18].

В задачу настоящей работы входило использование растительной экспрессионной системы на основе плодов трансгенногопо гену hpv6 L1 томата для синтеза антигенного белка ВПЧ6 L1 с целью рассмотрения перспективы создания вакцины достаточно широкого действия против аногенитальных и других опасных папилломатозов.

На рис. 1 приведена схема генетической конструкции для синтеза антигенного белка ВПЧ6 L1 в растительной экспрессионной системе, разработанной нами ранее [19].

Рис. 1.

Схема генетической конструкции для синтеза ВПЧ6 L1.

Центральным регуляторным элементом данной конструкции является ген RdRP, кодирующий РНК зависимую РНК полимеразу вируса мозаики огурца CMV, состоящий из двух фрагментов: РНК 2а (собственно полимеразу) и матрицу суперсупрессора РНК интерференции, кодирующую белок антисайленсер CMV 2b [20]. Наличие собственного суперсупрессора РНК интерференции белка СМV 2b, кодируемого в цис-ориентации, позволяет накапливать РНК реплисомы в количестве до 200 на клетку. При этом значительно усиливается экспрессионная эффективность разработанной нами конструкции, а реплисомы способны ассамблироваться в димеры, тримеры, пентамеры и, наконец, в разнообразные полимеры (полигоны, сотовые структуры, структуры в виде пучков димеров и др.), в которых нет доступных сайтов для действия РНКаз [21].

Генетическую трансформацию плодов томата проводили по ранее опубликованному методу [19]. Для этого на полевой делянке СИФИБР СО РАН в поликарбонатной теплице выращивали растения томата розовоплодного гибрида F1 (основа томата сорта Абаканский розовый) до достижения размера зеленых плодов 200–400 г с содержанием сырого протеина до 6%.

Генетические конструкции, клонируемые в Agrobacterium tumefaciens EHA 105, хранились при –62°С в криоконсервации (среда LB с 30% глицерином). После высева на агаровую среду LB c 50 мг/л ампициллина клетки росли в течение 2 сут, а затем бактериальный газон суспендировали стерильным раствором 1% ацетосирингона (Sigma, USA) в 5% глюкозе. Эту бактериальную суспензию использовали для трансформации зеленых плодов.

Для наработки вакцинного материала с целью последующей вакцинации мышей в доклинических испытаниях использовали около 50 кг зеленых плодов. Плоды трансформировали в ламинар-боксе в стерильных условиях. Для этого одноразовым шприцем вводили по 10–20 мкл бактериальной суспензии в локулюсы (камеры) в нижней части плода, отверстия заклеивали кусочком медицинского лейкопластыря, а затем плоды раскладывали на полки бытового холодильника и содержали в темноте при 6–8°С. Трансформация осуществлялась в течение 18 сут (и более, см. рис. 2). При трансформации создавали стандартные условия, что и отразилось на примерно одинаковом выходе синтезированного антигенного белка (25–33% ОРБ). За период 18 сут плоды томата краснели, но были еще достаточно плотными, поэтому для их гомогенизации использовали электрический измельчитель (фирма Redmond). Гомогенизированный вакцинный материал распределяли в пищевые пластиковые контейнеры, замораживали и до момента анализа хранили при температуре –24°С в бытовом морозильнике. Перед анализом гомогенаты размораживали при комнатной температуре, затем осветляли центрифугированием (14 000 g в течение 15 мин при 4°С). Супернатант использовали для электрофореза, Вестерн-блот-гибридизации и ИФА. Антигенные белки L1 типов ВПЧ16, 18, 31 и 45 получали аналогичным образом.

Рис. 2.

ДСН электрофорез (слева вверху) и Вестерн-блот-гибридизация (слева внизу) антигенного белка ВПЧ6 L1, полученного в растительной экспрессионной системе на основе плодов томата через 18 сут после трансформации и ИФА динамики накопления белка ВПЧ6 L1 в течение 7, 12, 18, 40 и 60 сут после трансформации (в правой части рисунка). Для проявления в Вестерн-блот-гибридизации использовали в качестве первичных антител сыворотку крови мышей, предварительно вакцинированных ВПЧ6 L1. Использованы вторичные антитела, конъюгированные с щелочной фосфатазой, субстрат 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат (ВСIP) и активатор окисления нитротетразолий синий (NBT). В левой части рисунка обозначения: № 1 и № 6 – 1.5 и 2.5 мкг HPV16 L1 (SantaCruz, США), № 2 и № 5 – 5 мкл воды, № 3 и № 4 – 5 мкл гомогенатов контрольных плодов, № 7–12 представляют образцы по 0.5 мкл индивидуально трансформированных геном hpv6 L1 плодов. М – показано положение цветных полос стандартных белков 50 кДа (пурпурная окраска) и 75 кДа (желтая окраска) набора Full Range Rainbow Recombinant protein molecular weight markers (Amersham). 56 кДа – молекулярная масса стандартного белка HPV16 L1 (SantaCruz).

Обозначения на графике в правой части рисунка: К –“пустой” отрицательный контроль, HPV16 L1 – положительный контроль, стандарт 200 нг HPV16 L1 (SantaCruz, США), НТР плоды – нетрансформированные плоды. Использованы в качестве первичных антител сыворотка крови мышей, вакцинированных ВПЧ6 L1, вторичные антитела – конъюгаты мышиных IgG с пероксидазой хрена (Abcam, UK), субстрат – ортофенилендиамин (SigmaFAST™ OPD). В барах представлены средние квадратичные ошибки (N = 30).

Для ДСН электрофореза с последующей Вестерн-блот-гибридизацией на пластинки SDS PhastGel (ПААГ градиент 8–15%) наносили по 0.5 мкл образцов гомогенатов трансформированных плодов. В качестве контролей на пластинки наносили воду (2 мкл), гомогенаты нетрансформированных плодов (2 мкл), а также растворы HPV16 L1 (SantaCruz, USA) 1.5 мкг и 2.5 мкг в 6 мкл (максимально допустимый объем нанесения) и подвергали электрофорезу в приборе PhastSystem (Amersham, UK), используя программное обеспечение прибора для разделения белков (программа № 3).

Для получения антител к ВПЧ6 L1 мышей (беспородные самки в возрасте 6 мес, полученные из вивария Восточно-Сибирского института медико-экологических исследований, г. Ангарск, работы с животными одобрены на заседании биоэтического совета СИФИБР СО РАН протокол № 9 от 30.10.2019) перорально вакцинировали вакцинным материалом плодов томата из расчета 500 мг антигенного белка ВПЧ6 L1 на мышь трижды с интервалами: 1, 2 и 3 мес (итого 6 мес вакцинации). Всего в эксперименте мышей содержали 10 мес от момента первой вакцинации на полном рационе, затем у них брали кровь и определяли наличие антител в сыворотке крови по ранее опубликованному методу [22]. При содержании мышей соблюдали стандартные условия, прописанные в ГОСТ 33215-2014, 33216-2014.

Для оценки антител, получаемых в сыворотке крови вакцинированных мышей, была проведена значительная подготовительная работа. (Антитела к HPV6 L1 зарубежными фирмами в Россию не поставляются.)

Эффективность и титр полученных антител в сыворотке крови мышей определяли косвенным путем, анализируя сыворотку крови мышей, вакцинированных ВПЧ16 L1, ВПЧ6 L1 и сравнивая титр (эффективность) с титром коммерческих антител на HPV16 L1 фирмы SantaCruz (США). Для их сравнительной оценки использовали следующие антитела: мышиное моноклональное антителo на HPV16 L1 (CAMVIR-1), sc-47699; мышиное моноклональное антитело на HPV16 L1 (MD2H11), sc-65713; козьи поликлональные антитела на HPV16 L1 (vc-13), sc-18052. Оказалось, что во всех случаях антитела из сыворотки крови мышей, нами вакцинированных ВПЧ16 L1, либо ВПЧ6 L1, были примерно на 3 порядка более эффективны, чем любые коммерческие антитела фирмы SantaCruz. Причиной, по-видимому, является более высокая авидность (от англ. avidity - жадность, цепкость связывания) антител, получаемых нами в сыворотке крови вакцинированных мышей. Поэтому мы сочли возможным использовать антитела сыворотки крови вакцинированных мышей в анализах. Аналогичный подход к получению сывороток крови мышей, содержащих антитела на определенный тип ВПЧ, хорошо известен в литературе и широко используется в аналитической работе [23].

На рис. 2 представлены результаты электрофоретического разделения (слева вверху) экстрактов плодов томата, трансгенного по ВПЧ6 L1, Вестерн-блот-гибридизация с сывороткой крови мышей, вакцинированных ВПЧ6 L1 (слева внизу). Динамика накопления белка ВПЧ6 L1 в плодах томата в течение 7, 12, 18, 40, 60 сут после трансформации представлена в правой части рис. 2.

Как можно видеть из рис. 2 (слева), на ДСН электрофореграмме экстрактов плодов томата (по 5 мкл), трансформированных геном hpv6 L1, присутствуют только пятна (пятна под № 7–12), совпадающие по Rf с подвижностью стандартного белка оболочки папилломавируса L1 в 56 кДа (HPV type 16 L1 antigen protein, full length, recombinant from S.cerevisiae) (SantaCruz, США), который нанесен на пластинку SDS PhastGel в количестве 1.5 мкг (пятно № 1) и 2.5 мкг (максимально возможное количество в 6 мкл, пятно № 6). Других пятен, соответствующих по подвижности маркерному белку HPV16 L1 фирмы SantaCruz, на пластинке нет. В качестве контролей представлены нанесение 5 мкл воды (№№ 2 и 5) и экстракт нетрансформированных плодов по 5 мкл (№№ 3 и 4), в которых также не обнаружено каких-либо пятен. При нативном электрофорезе обнаруживали только одну полосу соответствующей подвижности (Rf 56 кДа), других высокомолекулярных соединений, реагирующих с антителами, не было обнаружено. Для соотнесения с маркерными стандартными белками на рис. 2 (слева, буква М) указаны Rf двух белков (50 и 75 кДа) из линейки цветных белковых стандартов фирмы Amersham, предназначенных для визуализации хроматографирования на пластинках SDS PhastGel (“Full Range Rainbow Recombinant protein molecular weight markers” (RPN 800). Проявление зон гибридизации в Вестерн блоттинге осуществляли с помощью антител, полученных в сыворотке крови мышей, вакцинированных ВПЧ6 L1 по методу, опубликованному ранее [22].

При изучении динамики синтеза ВПЧ6 L1 (рис. 2, справа) методом ИФА обнаружено, что уже через 7 сут в плодах накапливается значительное количество ВПЧ6 L1, которое возрастает к 18 сут трансформации и при дальнейшей инкубации поддерживается на том же примерно уровне. В качестве контроля были взяты экстракты нетрансформированных плодов томата, в которых не было обнаружено присутствия антигенного белка ВПЧ6 L1. Положительным контролем послужил маркерный стандартный белок HPV16 L1 (SantaCruz, CША) в количестве 25 мкг в лунку планшета. Во всех случаях в качестве первичных антител использовали сыворотку крови мышей,

В табл. 1 приведен анализ выборки из 16 плодов (массой около 200 г), трансформированных геном hpv6 L1 в течение 18 сут. Методом ИФА [22] показано, что в плодах накапливалось значительное количество антигенного белка ВПЧ6 L1, достигающее значений 25–30% общего растворимого белка (ОРБ). В контроле (нетрансформированные плоды) антигенный белок, реагирующий с антителами на ВПЧ6 L1, не был найден.

В последнее время значительное внимание уделяется перекрестным взаимодействиям антигенных белков оболочки папилломавирусов различных типов, так как это создает перспективу возможности получения профилактической вакцины более широкого спектра действия, включая высококанцерогенные и аногенитальные типы и, вероятно, меньшей стоимости при ее изготовлении за счет уменьшения числа ее компонентов.

В настоящей работе методом Вестерн-блот-гибридизации белков ВПЧ6 L1, ВПЧ16 L1, ВПЧ18 L1, ВПЧ31 L1 и ВПЧ45 L1 с антителами сыворотки крови мышей, вакцинированных ВПЧ6 L1, изучали перекрестное взаимодействие между этими типами (рис. 3). Для этого на нитроцеллюлозную мембрану Hybond™-С EXTRA (оптимизированную для гибридизации белков) (Amersham Biosciences, UK) наносили однократно по 5 мкл осветленных гомогенатов соответствующих трансформированных плодов, высушивали на воздухе в течение дня, блокировку осуществляли 3% раствором БСА в течение суток при 6–8°C, на следующий день проводили гибридизацию с антителами сыворотки крови мышей, вакцинированных ВПЧ6 L1 по методу, опубликованному [22].

Рис. 3.

Вестерн-блот-гибридизация и перекрестное взаимодействие антигенных белков ВПЧ6 L1, ВПЧ16 L1, ВПЧ18 L1, ВПЧ31 L1 и ВПЧ45 L1 с антителами из сыворотки крови мышей, вакцинированных ВПЧ6 L1. Использованы вторичные антитела, конъюгированные с щелочной фосфатазой, субстрат 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат (ВСIP) и активатор окисления нитротетразолий синий (NBT). К – в качестве отрицательного контроля гомогенаты нетрансформированных плодов. HPV16 L1 – положительный контроль, в пятно нанесено 5 мкг раствора стандартного белка HPV16 L1 (SantaCruz, США). Осветленные гомогенаты антигенных белков ВПЧ6 L1, ВПЧ16 L1, ВПЧ18 L1, ВПЧ31 L1 и ВПЧ45 L1 нанесены в объеме 5 мкл в пятно однократно.

На рис. 3 можно видеть, что все типы белков L1 (6, 16, 18, 31 и 45) были способны достаточно хорошо гибридизироваться с антителами сыворотки крови мышей, вакцинированных ВПЧ6 L1. В контроле (нетрансформированные плоды) пятен гибридизации не обнаружено.

Таким образом, оказалось, что разрабатываемая нами кандидатная вакцина против аногенитальных типов папилломавирусов может оказаться перспективной для разработки вакцины с использованием в качестве профилактической с целью индукции синтеза антител широкого спектра, узнающих антигены L1 папилломавирусов также и высокоонкогенных типов.

Молекулярный механизм перекрестного праймирования “наивных” антигенпредставляющих клеток: дендритных клеток, Т и В лимфоцитов, макрофагов, моноцитов, нейтрофилов и др. – уже весьма детально изучен и представлен в ряде обзоров [24–26]. Согласно этим данным для осуществления мониторинга за состоянием “здоровья” клеток иммунная система привлекает антигенпредставляющие клетки для сбора антигенов из микроокружения других клеток и представляет их CD8+ T лимфоцитам в форме пептидов, ассамблированных с МНС1 молекулами (главного комплекса гистосовместимости, класс 1) [24, 25]. Конформационные различия структуры эпитопов антигенных белков L1 различных типов папилломавирусов составляют примерно 7–15 ангстрем [23] и поэтому, вероятно, может быть допустимым перекрестное праймирование при наличии больших доз антигенных белков в вакцине.

Рассматривая полученные результаты, мы видим, что на рис. 2 (слева) на электрофореграмме присутствует только одно пятно, соответствующее молекулярной массе 56 кДа. Высокое соответствие продукта трансляции задаваемой матрицей при синтезе белка является характерным свойством растительных экспрессионных систем. Более того, вирусные контролирующие элементы: репликазы, промоторы, энхансеры, цис- и транс-элементы, обеспечивающие полицистронный характер трансляции в природных условиях, способствуют также прочитыванию длинных матриц в рекомбинантных генетических конструкциях. Микробиальные (дрожжевые, бактериальные) же экспрессионные системы характеризуются тем, что в них часто происходят преждевременные остановки трансляции вследствие разнообразных блокаторов экспрессии. Это приводит к накоплению неполноразмерных, промежуточных продуктов синтеза, достаточно различающихся по массе. Данное обстоятельство является значительным препятствием для биотехнологических работ по созданию вакцин, так как требуются дополнительные затраты на очистку и концентрацию целевого белкового продукта, что неизбежно приводит к удорожанию вакцин. С другой стороны, бактериальные системы отличаются высокой степенью протеолиза, что может снижать выход целевого продукта [27–29]. Белок ВПЧ6 L1, полученный в нашей растительной экспрессионной системе, представляет собой вполне однородное белковое соединение, судя по рис. 2.

Целевой продукт в нашей растительной экспрессионной системе по данным ДСН электрофореза составляет на 18 сут инкубации примерно одну треть от общего растворимого белка (ОРБ) и более (табл. 1). Поэтому нет необходимости в очистке конечного продукта и дальнейшей его концентрации для пероральной вакцинации, так как содержание 200–300 мкг на мг ОРБ примерно соответствует концентрации белков L1 в Гардасиле. Поэтому мы полагаем, что для создания профилактической вакцины против аногенитальных папилломатозов и рецидивирующих респираторных папилломатозов, в том числе и высококанцерогенных, перспективно использовать растительные экспрессионные системы.

Эти данные позволяют считать перспективным создание вакцин с меньшим числом антигенных белков, что, с одной стороны, существенно уменьшает трудоемкость и стоимость процесса изготовления вакцины, а с другой стороны, увеличивает эквивалентную дозу нейтрализующих антител при снижении количества ее компонентов. Показано, что увеличение числа компонентов вакцины не приводит к усилению ее эффективности [30], возможно, не только из-за разбавления титра антител при многих компонентах вакцины, а также в результате иммунных нарушений [18].

Таким образом, в настоящей работе рассмотрена предпосылка для реальной перспективы создания пероральной растительной профилактической вакцины более широкого спектра действия, включая аногенитальные и высококанцерогенные типы папилломавирусов.