Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2021, T. 498, № 1, стр. 264-267

Зрелые ооциты представляют собой неоднородную популяцию, из которой только половина способна завершить мейоз, поэтому эффективность оплодотворения зависит от качества яйцеклетки [1, 2]. В связи с этим в технологии ЭКО актуальной задачей является диагностическое описание строения женской половой клетки [3–7]. В настоящее время набор инструментов, которые не повреждают яйцеклетку, ограничен только визуальным наблюдением [5, 8, 9]. Для характеристики полноценного созревания ооцита используют морфологические признаки: размер клетки, состояние внеклеточного пространства, внешний вид полярного тельца, перивителлинового пространства, а также наличие разного рода цитоплазматических включений. Дополнительные данные о строении живой яйцеклетки человека можно получить или уточнить их с помощью QLSM – метода экспериментальной биофизики, разработанного для бесконтактного тестирования микрообъекта [10].

QLSM основан на послойной томографии, что позволяет получить стопку последовательных оптических срезов по глубине объекта микронных размеров. Изначально данный метод корреляционной микроскопии был предложен для изучения препарата, процедура подготовки которого вызывает гибель клетки [11]. Однако нет причин, которые ограничивают возможность изучения нативного ооцита посредством QLSM. Цель работы состояла в том, чтобы адаптировать данный метод для диагностики женской половой клетки, инкубируемой в физиологической среде. В результате должно реализоваться основное достоинство послойной томографии – неинвазивная визуализация внутреннего строения живой яйцеклетки, а также количественная оценка важных пространственных характеристик, например, клеточного объема.

Использование женских половых клеток в биомедицинских целях разрешено этическим комитетом ФГБУ НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова МЗ РФ. Для научных исследований брали замороженные ооциты донора, что обусловлено доступностью такого клинического материала, разрешенного этическим комитетом. Материал получали из криобанка указанного учреждения. После размораживания и отмывки отдельную яйцеклетку изучали с помощью конфокального микроскопа Leica TCS SPE в режиме бесконтактной лазерной микротомографии (красный лазер – 635 нм, в проходящем свете). Принципы и технические особенности метода QLSM детально описаны ранее [10, 12, 13]. Отметим существенную деталь, интервал воздействия лазера на ооцит при получении стопки срезов (50 штук) составляет не более 60 с. Чтобы предотвратить высыхание анализируемого образца, яйцеклетки в капле физиологического раствора помещали в микрокамеру микроскопа, где поддерживали атмосферу насыщенного пара воды. На рис. 1 приведены микрофотографии женской половой клетки, полученной после размораживания и последующей отмывки от криопротектора (DMSO).

Рис. 1.

Характерное изображение женской половой клетки на заключительных этапах протокола криоконсервирования: (а) вид яйцеклетки непосредственно после размораживания, (б) отмытая от криопротектора (DMSO) яйцеклетка, готовая к оплодотворению. Обозначения: zp – зона пеллюцида (оболочка), оо – ооплазма, pb – полярное тельце, ps –пространство между клеткой и оболочкой ооцита; D – эффективный диаметр яйцеклетки в проекции поля зрения микроскопа.

Размороженная яйцеклетка представляет собой деформированный диск неправильной формы (рис. 1а). Такой вид ооцит принимает в результате замещения клеточной воды криопротектором (DMSO) на этапе подготовки к замораживанию в жидком азоте. После отмывки, следующей за размораживанием, возвращается округлая форма (рис. 1б). К сожалению, в поле зрения светового микроскопа наблюдается результат наложения изображений внутренних структур клетки по всей ее толщине, что ограничивает возможность изучения тонкой внутренней морфологии ооцита. Еще один недостаток заключается в том, что микрообъект визуализируется в одной проекции, что не позволяет оценить пространственные особенности изучаемой яйцеклетки. Например, на основе диаметра (104 мкм) ооцита, видимого в поле зрения микроскопа (рис. 1б), рассчитывается клеточный объем, значение которого равно ~590 пЛ. Данная величина будет соответствовать истинному объему клетки, только если ооцит не распластался при инкубации, оставаясь по форме близким к шару. Бесконтактная лазерная микротомография преодолевает отмеченные ограничения, дополняя ряд диагностических признаков деталями внутреннего строения на разных уровнях ооцита, его формой и объемом (рис. 2).

Рис. 2.

Результаты неинвазивной лазерной микротомографии (QLSM) живой женской половой клетки, инкубируемой в физиологическом растворе: (а) внутреннее строение яйцеклетки в плоскости оптического среза № 5 – вид сверху, (б) внутреннее строение яйцеклетки в плоскости оптического среза № 20 – вид сверху, (в) компьютерная 3-D модель живой яйцеклетки человека – вид сбоку, где V – значение объема (пЛ, пиколитры) исследуемого ооцита. Обозначения: zp – зона пеллюцида (оболочка), оо – ооплазма, ps – пространство между ооцитом и оболочкой.

Из рисунка видно, что посредством QLSM реализована послойная визуализация внутренней структуры живой женской половой клетки. Иллюстрируя данный режим, приведены микрофотографии оптического среза у “макушки” (рис. 2а) и в экваториальной плоскости (рис. 2б) ооцита. На обоих изображениях наблюдается скопление везикул в кортикальной области яйцеклетки. Указанный морфологический признак может отражать реакцию клетки на процесс замещения криопротектора водой, поступающей из внеклеточного пространства [14]. Наблюдаемый дисморфизм, возможно, обусловлен увеличением размера ооцита по мере отмывки DMSO, что вызывает скопление липидных везикул, являющихся строительным материалом для цитоплазматической мембраны [15]. Таким образом, изображение на оптических срезах содержит основные структурные элементы, характерные для зрелого ооцита, что позволяет оценить наличие дисморфизма.

На рис. 2в представлено изображение ооцита после его 3-D реконструкции. Видно, что после размораживания-отмывки яйцеклетка восстановила свою обычную округлую форму, а объем (600 пЛ) компьютерной модели значимо не отличается от величины, рассчитанной на основе сферической экстраполяции и значения эффективного диаметра ооцита (рис. 1б).

В завершение можно сделать следующие выводы. В технологии ЭКО бесконтактная лазерная микротомография является эффективным подходом для диагностического описания морфологии женской половой клетки. Посредством данного метода реализовано основное достоинство послойной томографии – неинвазивная визуализация внутреннего строения нативного ооцита человека. Показано скопление мелких везикул в кортикальной области отмытого ооцита. Данный дисморфизм может быть обусловлен незавершенностью процесса установления равновесного состояния после отмывки криопротектора. Последующая компьютерная 3-D реконструкция позволила дополнить характеристику ооцита значением клеточного объема, что отражает важный функциональный признак – осмотический статус яйцеклетки.