Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2021, T. 498, № 1, стр. 258-263

Хромосомы высших эукариот организованы в топологически ассоциированные домены (ТАДы). Размеры и способы формирования этих доменов значительно отличаются у разных животных. У  дрозофилы районы хроматина, разделяющие ТАДы, насыщены генами с высоким уровнем транскрипции. Они активно взаимодействуют между собой, формируя петли хроматина. У дрозофилы границы ТАДов, скорее, определяются активным состоянием и свойствами хроматина, чем сайтами связывания конкретного белка. Тем не менее на границах ТАДов часто присутствуют белки dCTCF, CP190, Chriz/Chromator, Z4/putzig и BEAF-32, связывающиеся с промоторами генов домашнего хозяйства. Роль этих белков в формировании границ ТАДов пока не ясна [1]. Возможно, эти белки являются компонентами комплексов, которые одновременно поддерживают структуру интерфазного хроматина и обеспечивают высокую транскрипционную активность. Однако механизм формирования и функционирования хроматинорганизующих комплексов еще недостаточно изучен.

Считается, что “диск-междисковая” структура политенных хромосом у Drosophila отражает доменную структуру организации хромосом. В дисках политенных хромосом локализован плотно упакованный хроматин, где активность генов подавлена, а в междисках – открытый хроматин, где связывание транскрипционных факторов облегчено, и гены активно транскрибируются. В представленной работе мы детально изучили механизм формирования комплекса между тремя белками BEAF, Z4 и Chriz, локализованными в междисках политенных хромосом, и разработали модель, объясняющую участие такого комплекса в формировании открытого хроматина и, следовательно, границ ТАДов.

Белки Z4/putzig и Chriz/Chromator необходимы для поддержания структуры интерфазных хромосом. Они экспрессируются во многих тканях на всех стадиях онтогенеза, колокализуются во всех междисках политенных хромосом, иммунопреципитируются в общем комплексе и напрямую взаимодействуют друг с другом [2–5]. Белок Z4 участвует в регуляции транскрипции ряда генов. Например, показано, что Z4 входит в состав TRF2-зависимого комплекса, определяющего активность промоторов части генов домашнего хозяйства. Кроме того, Z4 присутствует в ремоделирующем нуклеосомы комплексе NURF [6]. Белок Chriz также связывается с большей частью промоторов генов домашнего хозяйства (данные проекта modENCODE), однако его роль в регуляции транскрипции остается неизвестной. Несмотря на значительное количество публикаций, все еще не обнаружены конкретные ДНК-связывающие белки, рекрутирующие Z4 и Chriz на хроматин.

Белок BEAF-32 необходим для оогенеза, эмбриогенеза и поддержания структуры хромосом [7, 8]. Он был впервые обнаружен на инсуляторной последовательности scs’ и впоследствии локализован на политенных хромосомах во множестве диск-междисковых границ [9]. Анализ геномного распределения BEAF выявил, что этот белок преимущественно локализован в 5' нетранслируемой области различных генов, ориентированных “голова-к-голове”. Примечательно, что большинство из этих генов относятся к генам домашнего хозяйства [10]. Это позволяет предположить, что, взаимодействуя с другими транскрипционными факторами, ассоциированными с генами домашнего хозяйства, BEAF участвует в поддержании открытой структуры хроматина, обеспечивающей значительный уровень транскрипции генов.

Было показано, что каждый из белков, Z4 и Chriz, иммунопреципитируется и частично колокализуется с белком BEAF [4]. На основании этого было выдвинуто предположение, что все три белка входят в состав общего комплекса и взаимодействуют между собой, однако прямое взаимодействие между ними не изучалось [4]. В представленной работе мы впервые доказали, что белки Z4 и Chriz напрямую взаимодействуют с белком BEAF и точно локализовали районы белков, обеспечивающие такое взаимодействие.

В первую очередь, с помощью коиммунопреципитации белков (IP) из лизата клеток S2 мы продемонстрировали, что все три белка, BEAF, Z4 и Chriz формируют общий комплекс. С помощью антител к белку BEAF комплекс связывали с сефарозой А, а затем с помощью специфичных антител детектировали присутствие в нем белков Z4 и Chriz (рис. 1).

Однако иммунопреципитация допускает возможность опосредованных взаимодействий между белками. Чтобы выяснить, могут ли белки Z4, Chriz и BEAF взаимодействовать напрямую мы использовали дрожжевую двугибридную систему (ДДС). Сначала были протестированы взаимодействия между полноразмерными белками BEAF, Z4 и Chriz. На основе вектора pGBT9, содержащего промотор гена Adh и ДНК-связывающий домен дрожжевого белка GAL4, мы создали конструкции, экспрессирующие в дрожжах белок BEAF. кДНК белков Z4 и Chriz клонировали в вектор pGDA, включающий активационный домен GAL4. В экспериментах использовался дрожжевой штамм pJ69-4A.

Рис. 1.

Результаты тестирования взаимодействия между белком BEAF и белками Z4 и Chriz методом IP из лизата клеток S2. Иммунопреципитацию проводили с помощью антител к белку BEAF (αBEAF) и с помощью преиммунной сыворотки крови (отрицательный контроль). Перед загрузкой в SDS-PAGE для Вестерн-блоттинга IP-комплексы промывали 300 мм KCl-содержащими буферами. Мембрану PVDF последовательно гибридизовали со специфичными антителами против белков Chriz и Z4 (αChriz и αZ4, обозначены слева от соответствующих панелей). Inрut – 10% от лизата клеток, использованного в коиммунопреципитации; IP – иммунопреципитация антителами к BEAF; Output – супернатант после IP; PI – иммунопреципитация преиммунной сывороткой; Output PI – супернатант после PI. Наличие полосы в колонке IP означает, что тестируемые белки входят в состав общего комплекса.

Эффективность экспрессии Chriz и Z4 в составе конструкций подтверждалась с помощью Вестерн-блоттинга. Эксперименты проводили в соответствии с методикой, описанной нами ранее [11]. Оказалось, что белок BEAF способен напрямую взаимодействовать как с белком Z4, так и с белком Chriz (рис. 2).

Рис. 2.

Взаимодействия между белком BEAF и белками Z4 и Chriz в ДДС.

Тестируемые белки изображены схематично. Для белка Z4: conservative – высококонсервативный район; прямоугольники 1–7 обозначают цинковые пальцы. Для белка Chriz: N – N-концевой консервативный домен; Chro – хромодомен; positive – район, обогащенный положительно заряженными аминокислотами; С-1, С-2, С-3 – консервативные С-концевые районы белка. Для белка BEAF: BED – домен цинкового пальца; LZ – лейциновая молния; BESS – домен BESS. Цифрами обозначены аминокислотные остатки, ограничивающие домены и производные формы. Слева указаны названия белков и их производных, размер производных обозначен отрезками, пунктирные линии обозначают внутренние делеции. Справа от схем обозначена сила взаимодействия между белками: “+++” – сильное; “++” – умеренное; “+” – слабое; “–” – отсутствие взаимодействия.

Для подтверждения выявленных взаимодействий мы провели реципрокные эксперименты: кДНК белка BEAF переклонировали в вектор pGDA, а кДНК белков Z4 и Chriz – в вектор pGBT9. Затем взаимодействия между белками снова протестировали в ДДС. Полученные результаты полностью подтвердили наличие прямых межбелковых взаимодействий.

С помощью соосаждения белков на глутатион S-сефарозе (GST pull down) мы также продемонстрировали, что белки Chriz и BEAF напрямую взаимодействуют in vitro (рис. 3).

Рис. 3.

Результаты тестирования взаимодействия между белками BEAF и Chriz в GST pull down экспериментах. Input – нанесено 10% белка BEAF-His, использованного в каждом эксперименте (положительный контроль). Детекция проводилась с помощью антител к гистидину (αHis), с которым был слит белок BEAF – верхняя панель. GST – cвязывание белка BEAF-His с белком GST (отрицательный контроль). Белок BEAF-His связывали с 10 мкл (вторая дорожка) и 5 мкл (третья дорожка) белка Chriz, слитого с GST. Наличие полосы в вертикальной колонке означает, что белки BEAF и Chriz связываются напрямую. Нижняя панель (αGST) – контрольная гибридизация мембраны с антителами к GST. Полосы в вертикальных колонках отражают количество белков Chriz-GST и GST, использованных в каждом эксперименте.

Чтобы с помощью ДДС выявить минимальный район взаимодействия для каждого из партнеров, на основе векторов pGDA и pGBT9 были созданы серии делеционных производных тестируемых белков.

Ранее было показано, что N-концевой район белка Z4 (1–237 а.о.) обеспечивает его взаимодействие с белком Chriz [4]. Мы локализовали на N конце белка Z4 консервативный участок (98–169 а.о.) и показали, что именно он отвечает за взаимодействие белка Z4 с белком BEAF (рис. 2). Также белок Z4 содержит 7 цинковых пальцев С₂Н₂ типа (239–515 а.о.), однако самостоятельного связывания Z4 с ДНК в междиске обнаружено не было [2]. Поочередно делетируя каждый из них, мы продемонстрировали, что во взаимодействии с белком BEAF участвуют цинковые пальцы 1–3 (рис. 2). С-концевой район белка Z4 не нужен для взаимодействия с белком BEAF.

В предыдущей работе мы показали, что последовательность белка Chriz от 273 до 503 а.о. обеспечивает его взаимодействие с белком Z4 [5]. Обогащенный положительно заряженными аминокислотами участок Chriz от 503 до 621 а.о. дополнительно стабилизирует взаимодействие Chriz–Z4. Неожиданно оказалось, что эти же последовательности отвечают за взаимодействие белка Chriz с белком BEAF (рис. 2). N- и С-концевые районы белка Chriz, а также его хромодомен не участвуют во взаимодействии Chriz–BEAF (рис. 2).

На N конце белка BEAF расположен нетипичный домен типа цинковый палец, называемый BED доменом. Он отвечает за связывание белка BEAF с консенсусной последовательностью ДНК CGATA [12]. На С-конце находится BESS домен, отвечающий за гомодимеризацию белка и участвующий в белок-белковых взаимодействиях. Недавно было предсказано наличие у белка BEAF домена лейциновой молнии [10], способствующего гомодимеризации [13].

Со стороны белка BEAF во взаимодействиях с обоими белками, Z4 и Chriz, одновременно участвуют только BESS домен и район лейциновой молнии (рис. 2). Таким образом, Z4 и Chriz взаимодействуют с белком BEAF, способным образовывать ди/тримеры.

Наиболее эффективно белок BEAF связывается с так называемыми “Dual-core” последовательностями, где 2–5 коровых сайта связывания разделены АТ богатой последовательностью размером около 200 п.н. [12]. Исходя из этого, можно предположить, что через свои BESS домены и район LZ белок BEAF образует ди/тримеры и таким образом эффективно связывается с “Dual-core” последовательностями. Однако полногеномное картирование не выявило каких-либо жестких правил размещения или относительной ориентации мотивов CGATA в областях обогащения белком BEAF [14]. Некоторые последовательности, демонстрирующие сильное связывание в экспериментах EMSA (electrophoretic mobility shift assay), имеют только 2 мотива CGATA, в то время как другие, имеющие 3 и более мотивов, связывали BEAF гораздо хуже. Это предполагает, что BEAF, так же, как ДНК-связывающий белок Su(Hw) [11], нуждается в партнерах, опосредующих его связывание с различающимися по структуре мотивами генома. Сложная перекрывающаяся структура выявленных нами межбелковых взаимодействий позволяет предположить, что партнерами, способствующими связыванию белка BEAF с районами междисков политенных хромосом, служат белки Z4 и Chriz.

Основываясь на полученых данных, мы предлагаем модель сборки и функционирования комплекса BEAF/Z4/Chriz (рис. 4). В таком комплексе белки Z4 и Chriz не только стабилизируют связывание BEAF с ДНК, но одновременно могут привлекать на хроматин другие белковые компоненты, такие как комплекс NURF [8] и белок CP190.

Рис. 4.

Модель взаимодействия между димеризующимся белком BEAF и белками Z4 и Chriz. Заглавными буквами обозначены мотивы связывания белка BEAF; (AT)n – АТ богатая последовательность. Районы белка BEAF обозначены светло-серым; районы белка Chriz – темно-серым; районы белка Z4 – черным. Остальные обозначения, как на рис. 2.

Например, были получены данные, что искусственное привлечение белка Chriz в район диска политенных хромосом, соответствующий интеркалярному гетерохроматину, приводит к локальной деконденсации хроматина и рекрутированию белков Z4 и CP190 [15]. Кроме того, показано, что хроматиновый комплекс, содержащий белки Chriz, Z4 и BEAF, участвует в H3S10 фосфорилировании интерфазных хромосом, предположительно за счет местного рекрутирования тандемной киназы JIL-1.

Локальное связывание и активность такого комплекса на политенных хромосомах может приводить к деконденсации областей междисков [4]. Таким образом, стабильный комплекс BEAF/Z4/Chriz способен формировать активный открытый хроматин, соответствующий междискам политенных хромосом и границам ТАДов.