Радиационная биология. Радиоэкология, 2022, T. 62, № 6, стр. 615-619

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА

Проведенное предварительное рассмотрение существующих методик и инструментальных средств показало, что, несмотря на относительно небольшое число молекул ДНК в растворе, чувствительность современных анализаторов спектра, работающих в диапазоне СВЧ, достаточна для экспериментов с молекулами ДНК. Анализ также показал, что методика работы с внутриклеточными ДНК применима в области СВЧ, поскольку в клетках бактерий нет других молекул или органелл, которые способны реагировать на СВЧ ЭМП.

Важно отметить, что воздействие СВЧ ЭМП на электрические диполи в цепи ДНК (пары А–Т и Г–Ц как асимметричные образования), ввиду ее макроскопической длины, имеет классический характер, следовательно, крутильные колебания спирали ДНК описываются классическими законами. Для определения собственной частоты колебаний можно использовать формализм Лагранжа [13], при этом ДНК при скручивании ведет себя как стержень [14, 15]. В модели стержня резонансная частота крутильных колебаний молекулы ДНК f обратно пропорциональна корню квадратному из числа пар оснований (п.о.) в молекуле N:

где коэффициент k = 21.75 ТГц определяется с помощью экспериментальных данных [6]. Это общая формула крутильных колебаний любых ДНК, коэффициент k интегральным образом учитывает квазипериодичность молекулы, ее компактизацию и связанные с ней топологические напряжения, а также окружение молекулы [16, 17]. В силу того, что $D{\text{/}}L \ll 1$ , где D – диаметр витка спирали ДНК, L – ее длина, не имеет значения, кольцевая ДНК или линейная, формула (1) остается справедливой. Число пар оснований в формуле может быть любым, например, для N = = 400 расчет дает частоту порядка 1 ТГц, что совпадает с [18].

Поскольку собственная частота крутильных колебаний ДНК зависит от длины спирали ДНК, для разных клеток она отличается по величине. Для бактерий она порядка 10 ГГц, для ДНК клеток человека – от 1.91 до 4.29 ГГц. Внешнее поле при совпадении частоты поля с собственной частотой колебаний ДНК возбуждает в молекуле крутильные колебания, которые препятствуют репликации ДНК, вследствие чего после нескольких “неудачных” подготовок к делению (в среднем шести клеточных циклов) клетка погибает [6]. Таким образом, факт резонансного поглощения электромагнитного поля СВЧ-диапазона молекулами ДНК доказан косвенно фактом резонансного снижения выживаемости клеток бактерий на расчетной частоте.

При проведении исследования важно учесть, что в случае репликации крутильные колебания спирали ДНК происходят с раскручиванием репликационных вилок и, соответственно, с увеличением момента инерции относительно оси спирали, поэтому репликация уменьшает резонансную частоту крутильных колебаний спирали ДНК. Кроме того, на частоту влияет эффект сверхспирализации. Например, ДНК бактерии E. coli – кольцевая, кольцо компактифицировано в соцветие. При возбуждении в молекуле крутильных колебаний число пар оснований на один виток ее спирали $\gamma = 10$ изменяется, и, поскольку порядок зацеплений $Lk = N{\text{/}}\gamma = {\text{const}}$ (Lk – порядок зацепления), в спирали возникает топологическое напряжение, которое приводит к сверхспирализации. Вследствие этого собственная частота крутильных колебаний молекулы меняется – ввиду изменения жесткости.

В экспериментах исследовалась культура – E. coli M17 с концентрацией $(3{\kern 1pt} - {\kern 1pt} 5) \times {{10}^{8}}\;{\text{КОЕ}}$ в 1 мл или, по способу приготовления культуры, порядка 10⁸ молекул ДНК, оптическая плотность раствора составляла 1.3%. Использовался нетепловой уровень плотности потока мощности СВЧ излучения 2.5 мВт/см². Длина ДНК – 4 483 110 п.о., соответственно, рассчитанная по формуле (1) частота равна 10.272 ГГц. Исследовались также культуры M. avium 104 и Mycobacterium tuberculosis H37Rv с той же оптической плотностью.

Чтобы исключить эффекты репликации и сверхспирализации, культуры готовили не в питательной среде, а в физрастворе, исследования проводили при температуре 21°С.

Источником излучения служил СВЧ-генератор Agilent Technologies E82570 1, для усиления сигнала до 1 Вт использовался усилитель мощности Agilent Technologies E82570 (рис. 1). Плотность потока мощности СВЧ-излучения составляла примерно 2.5 мВт/см². Для определения величины поглощения цифровым осциллографом измерялось напряжение на выходе детектора, пропорциональное мощности СВЧ-излучения (детектор работал на квадратичном участке вольт-амперной характеристики) при наличии поглощающей среды и без нее.

Первые опыты проводились с культурой E. coli M17. Исследуемые растворы заливались в батарею из пяти стеклянных пробирок с внутренним диаметром 13 мм, высота столба растворов составляла 38 мм. Исследования были проведены в частотном диапазоне от 8.5 до 11.0 ГГц. Для грубой оценки шаг изменения частоты составлял 0.1 ГГц, затем, после определения суженого диапазона – 0.01 ГГц и, наконец, вблизи резонансной частоты – 0.001 ГГц.

Было установлено, что на резонансной частоте f₀ = 10.272 ± 0.001 ГГц коэффициент поглощения культурой бактерий составил 2%. Такой небольшой коэффициент поглощения объясняется малой концентрацией бактерий, соответственно, малой концентрацией макромолекул ДНК в физиологическом растворе и малым объемом исследуемой жидкости. После увеличения числа бактерий на несколько порядков, до оптической плотности культуры в пробирке с физраствором 7.3%, коэффициент поглощения достиг 4% на той же частоте. При приближении батареи пробирок к приемной антенне коэффициент поглощения возрастал. По итогам эксперимента был сделан вывод о том, что толщина пробирок, равная 14 мм, по порядку величины совпадает с длиной волны СВЧ-излучения в свободном пространстве 3.2 см, следовательно, имеет место дифракционный эффект на отдельных пробирках и интерференция вторичных волн в месте расположения приемной антенны.

Чтобы исключить обнаруженные эффекты, в последующих опытах пробирки были заменены плоскопараллельной кюветой из органического стекла с размерами сечения 100 × 78 мм, что совпадало с размерами раскрыва приемной антенны толщиной 14 мм. Кювету устанавливали на оптимальном расстоянии, вплотную к приемной антенне.

Для исключения спектра поглощения физраствором и кюветой и получения эффективного поглощения, измерения проводили дважды: с кюветой, заполненной физиологическим раствором 4% и с раствором исследуемой культуры. Коэффициенты поглощения СВЧ-излучения пробирками с физиологическим раствором и с раствором исследуемой культуры определяли следующим образом. В 1 мл содержится порядка 10²⁶ молекул (по известной формуле через число Авогадро, массу 1 мл и молярную массу ${{N}_{A}}m{\text{/}}\mu $) физиологического раствора, поэтому с учетом малой концентрации культуры E. coli M17 (10⁸ молекул ДНК), эффекты переоблучения молекул можно не учитывать и для расчета поглощения параллельного монохроматического пучка излучения в поглощающей среде использовать закон Бугера–Ламберта $I(x) = {{I}_{0}}exp( - kx)$, где I₀ и I(x) – интенсивности падающего и прошедшего на глубину x излучения, k – коэффициент поглощения на соответствующей частоте.

С учетом закона Бугера–Ламберта, коэффициент пропускания определялся по отношению напряжений U:

(U₀ нормировалось к единице).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Результаты измерений представлены на рис. 2. Обработка полученных данных позволяет определить значения коэффициентов поглощения.

1. Нерезонансное поглощение, средний уровень ${{K}_{{{\text{не рез}}}}} = (0.823 + 0.838){\text{/}}2 = 0.8305 \approx 0.83$.

2. Резонансное поглощение на уровне половинной мощности ${{K}_{{{\text{рез/2}}}}} = (0.83 + 0.772){\text{/}}2 \approx 0.8$.

3. Резонансное поглощение на частоте резонанса ${{K}_{{{\text{рез}}\,{{f}_{{\text{0}}}}}}} = 0.8305 - 0.7720 \approx 0.059$.

Принимая 0.83 за 100%, находим, что величина поглощения составляет 7.0%.

Для добротности системы получаем следующие результаты. С учетом толщины стенок кюветы 3 мм толщина слоя жидкости x = 17 мм, при этом коэффициент нерезонансного поглощения составляет ${{k}_{{{\text{нерез}}}}} = (0.11 \pm 0.01)\,{\text{с}}{{{\text{м}}}^{{ - 1}}}$, а резонансного на частоте f₀ = 10.272 ГГц – ${{k}_{{{\text{рез}}}}}\, = \,(0.04\, \pm \,0.01)$ см^–1. Таким образом, суммарное резонансное и нерезонансное поглощение на указанной частоте составляет ${{k}_{{{\text{рез}}}}} + {{k}_{{{\text{нерез}}}}} = (0.15 \pm 0.01)\,{\text{с}}{{{\text{м}}}^{{ - 1}}}$. Добротность резонансной системы не уровне половинного резонансного поглощения, рассчитанная по формуле $Q = {{f}_{0}}{\text{/}}({{f}_{{\text{в}}}} - {{f}_{{\text{н}}}}) = 1030$, где f_в и f_н – верхняя и нижняя границы полосы резонансного поглощения на уровне половинной мощности. Это большая величина, пик резонансной кривой очень острый.

ОБСУЖДЕНИЕ

На резонансной частоте f₀ = 10.271 ± 0.001 ГГц на культуре E. coli M17 в опытах с кюветой получено эффективное поглощение 7.0 ± 0.8%. Определенная резонансная частота с учетом погрешности совпадает с результатами опытов с пробирками f₀ = 10.272 ± 0.001 ГГц и близка к расчетной величине 10.260 ГГц.

На культуре M. avium эффективное поглощение составило 7.3%, резонансная частота – f₀ = = 10.317 ± 0.001 ГГц и близка к расчетной 10.31 ГГц.

На культуре Mycobacterium tuberculosis – 7.1%, f₀ = 10.356 ± 0.001 ГГц и близка к расчетной величине 10.36 ГГц.

Таким образом, результаты исследования являются прямым доказательством наличия резонансного поглощения молекул ДНК в СВЧ спектре. Поглощение ЭМП культурами бактерий имело место почти строго на той частоте, которая соответствовала расчетным собственным частотам крутильных колебаний соответствующих молекул ДНК. Следовательно, эффект резонансного поглощения молекулами ДНК электромагнитного поля сверхвысокой частоты существует, и резонансная частота является собственной частотой крутильных колебаний молекул ДНК.

Результаты исследования могут быть положены в основу метода идентификации различных типов бактерий.