Радиационная биология. Радиоэкология, 2021, T. 61, № 6, стр. 625-631
Оценка влияния радиомодификатора беталейкина на рост облученной перевивной карциномы Льюиса у мышей
Л. М. Рождественский 1, *, А. А. Липенгольц 1, 2, Н. И. Лисина 1, К. Ю. Романова 1
1 Государственный научный центр Российской Федерации –
Федеральный медицинский биофизический центр им. А.И. Бурназяна ФМБА России
Москва, Россия
2 Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина Минздрава России
Москва, Россия
* E-mail: lemrod@mail.ru
Поступила в редакцию 29.10.2020
После доработки 13.07.2021
Принята к публикации 01.09.2021
Аннотация
Проведены четыре серии опытов на мышах C57Bl/6 с локальным R-облучением в дозе 20 Гр перевивной карциномы Льюиса и 2-кратным введением (за сутки до и сразу после облучения) радиомодификатора и иммуномодулятора беталейкина (рекомбинантного человеческого интерлейкина-1β). Оценку влияния препарата на рост опухоли оценивали по критериям длительности задержки роста и скорости роста после его восстановления в сравнении с этими показателями у интактных и контрольных облученных мышей. Введение беталейкина не привело ни к укорочению стадии задержки роста, ни к ускорению роста после его восстановления ни в одной из серий опытов. В одной серии опытов были отмечены значимое удлинение задержки роста и тенденция к замедлению роста опухоли после его восстановления, причем в этой же серии была отмечена самая низкая скорость роста опухоли в необлученном контроле. Сделано заключение о перспективности разработки модели перевивной опухоли на мышах для оценки потенциальной возможности использования противолучевых средств в практике химиолучевой терапии опухолей.
Беталейкин, представляющий собой отечественный рекомбинантный препарат человеческого ИЛ-1β, позиционируется в настоящее время как противолучевое средство двойного назначения – для экстренного применения при остром лучевом поражении в различных экстремальных ситуациях и для ослабления лейкопенического действия длительных курсов лучевой и химиотерапии онкозаболеваний [1–4].
Учитывая наличие у ИЛ-1 свойства активизации сигнальной цепи, включающей транскрипционные факторы усиления клеточной пролиферации (NFkB, NFB1), исследователи и практики медицины все время должны контролировать вопрос о возможном негативном влиянии ИЛ-1 на опухолевый процесс [5, 6]. При этом надо различать выяснение роли эндогенно вырабатываемого ИЛ-1 и рекомбинантных препаратов ИЛ-1α и ИЛ-1β, вводимых извне. Для применения ИЛ-1 в широкой медицинской практике преимущественный интерес представляет, конечно, второе направление.
Взаимодействие цитокинов, как важнейших факторов врожденного иммунитета, и онкологической патологии имеет разные аспекты изучения и лежит в основе разработки направления иммунотерапии опухолей [5–7]. Особняком стоит направление использования цитокинов для противодействия лучевому поражению клеток радиочувствительной иммуногемопоэтической системы, вообще, и стволового кроветворного пула, особенно, хотя и здесь вопрос о возможности неблагоприятного влияния провоспалительных цитокинов (прежде всего ИЛ-1) стоит достаточно остро. Но здесь не обсуждается проблема роли вводимого цитокина как возможного участника злокачественной трансформации, а только вопрос о его влиянии на скорость роста опухоли, ее метастазирование и возможность защиты опухолевых клеток от лучевой гибели.
Учитывая наличие у ИЛ-1 провоспалительного, вообще, и гемопоэзстимулируюшего, в частности, действия для продвижения беталейкина в онкологическую практику, важна дифференциация разновидностей злокачественных опухолей по безопасности применения ИЛ-1 [5, 6]. Рекомбинантные препараты ИЛ-1 были апробированы при лучевой терапии как лейкозов, так и солидных опухолей в качестве стимуляторов гемопоэза, и пока негативного их влияния на результаты лучевой терапии отмечено не было [2, 9–11]. Несмотря на широкую апробацию рекомбинантных препаратов ИЛ-1β и ИЛ-1α в качестве стимуляторов гемопоэза, исследования ИЛ-1 на моделях перевивных опухолей в эксперименте не теряют своей актуальности в плане выявления различных особенностей влияния цитокинов на опухолевый рост.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
В экспериментах из четырех повторностей были использованы мыши самки С57Bl/6 c массой 20–22 г, которым трансплантировали подкожно в правое бедро 14%-ю суспензию диспергированной опухолевой ткани в объеме 0.2 мл. Суспензию опухолевых клеток готовили путем сначала грубого измельчения с помощью ножниц выделенной и отсепарированной от окружающей соединительной ткани опухоли, а затем путем продавливания измельченной массы через металлическое ситечко с мелкими отверстиями и ее бужирования с помощью шприца и иглы диаметром 0.2 мм в объеме раствора Хенкса в мл, соотносящегося с массой выделенной опухоли в граммах как 6 : 1. Культура клеток легочной карциномы Льюиса была получена из банка опухолевых клеток РОНЦ им. Н.Н. Блохина. Затем из мышей с перевитой опухолью формировали следующие группы по восемь особей: необлученный контроль c привитой опухолью (К1), облученный контроль с привитой опухолью (К2), облученная группа с привитой опухолью и введением беталейкина (Обл + Бл). Локальное рентгеновское облучение опухоли осуществляли через 9–10 сут после перевивки в дозе 20 Гр (при мощности дозы 1.1 Гр/мин) производили на аппарате РУСТ М1 (200 кВ, 2.5 мА, алюминиевый фильтр 1.5 мм). Беталейкин производства ГНЦ НИИ особо чистых биопрепаратов (Санкт-Петербург) приобретали в аптечной сети. Лиофилизированный препарат в ампулах по 1 мкг/амп. растворяли перед введением в 0.9%-ный раствор NaCl и вводили в/бр в объеме 0.2 мл из расчета 50 мкг, кг двукратно (за сутки до облучения и сразу после него, в 3-й серии только профилактически). В 1-й серии опытов была дополнительная группа с перевитой опухолью и введением беталейкина через 9–10 сут после перевивки, но без облучения. Всем контрольным животным вводили растворитель в том же объеме. Динамику роста опухоли оценивали путем измерения ее объема ежедневно за исключением нерабочих дней с помощью штангенциркуля в трех взаимоперпендикулярных направлениях и последующего расчета объема элипсоида по формуле элипсоида [8] (рис. 1).
Рис. 1.
Данные по динамике изменения усредненного объема опухоли в группе “Облучение + беталейкин” в разных сериях опыта. Цифры на рисунке – номер серии опыта.
Fig. 1. Dynamics of average tumor volume changes in the group “Exposure + betaleukine” in different experiment series. Digits near lines are series numbers.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Полученные результаты представлены в табл. 1.
Таблица 1.
Критерии и оценки динамики роста карциномы Льюиса в разных экспериментальных группах Table 1. Criteria and evaluation of Lewis carcinoma growth in different experimental groups
| Серии | Отсутствие роста, сут | Скорость роста, мм3/сут | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| контроль необлученный (п/перевивки)-К1 | контроль облученный (п/облучения)-К2 | облучение + Бл (п/облучения) Обл + Бл | контроль необлученный (п/перевивки)-К1 | контроль облученный (п/облучения)-К2 | облучение + Бл (п/облучения) Обл + Бл | |
| 1-я | 0 | 9 | 13 | 232.9 | 207.9 | 157.1 |
| 2-я | 0 | 8.5 | 9 | 524.1 | 491.8 | 503.4 |
| 3-я | 0 | 8 | 8 | 460.7 | 490 | 517 |
| 4-я | 0 | 8 | 8 | 582.7 | 439.5 | 491.5 |
Из данных, представленных в табл. 1, следует, что двукратное введение беталейкина до и после локального облучения опухоли (как бы суммирующее его радиозащитное и стимулирующее восстановление действия) не отразилось негативно ни на продолжительности периода отсутствия роста, ни на скорости роста в период его восстановления. Более того, в 1-й серии опытов было отмечено негативное влияние беталейкина на прогрессию опухоли, проявившееся в удлинении задержки роста и снижении скорости роста в период восстановившегося роста (рис. 2). При этом именно в этой серии был отмечен значимо сниженный рост необлученной опухоли в интактном контроле.
Рис. 2.
Динамика роста опухоли в разных группах серии 1: 1 – К1, 2 – К2, 3 – Облучение + беталейкин. Для облученных групп представлены раздельно регрессионные зависимости роста в стадиях задержки и восстановившегося роста.
Fig. 2. Tumor growth dynamics in different groups of the experiment series 1: 1 – an unexposed control with transplanted tumor (K1), 2 – an exposed control with transplanted tumor (K2), 3 – an exposed group with transplanted tumor and betaleukine injection (exposure + betaleukine).
Отмеченное в 1-й серии различие в динамике роста опухоли в облученных группах контроля и введения беталейкина было исследовано на статистическую значимость следующим образом. В каждой из указанных групп оценочные параметры роста были рассчитаны для каждого отдельного животного, а полученные статистические ряды сравнены между собой по непараметрическому критерию Манна–Уитни. Различие по продолжительности периода задержки роста оказалось значимым (р = 0.04), а по скорости роста нет (р = 0.25).
Далее, в двух сериях опыта было проверено влияние беталейкина на рост необлученной опухоли, и также не было отмечено ускоряющего рост влияния. Результаты одного из этих дополнительных исследований представлены на рис. 3.
Рис. 3.
Усредненная динамика роста опухоли после перевивки в необлученных группах с введением 1 и без введения 2 беталейкина.
Fig. 3. Average tumor growth dynamics in K1 with 1 and without 2 betaleukine injection.
Как видно на рис. 3, динамика роста необлученной опухоли также не подвержена влиянию введенного беталейкина. Оценка по непараметрическому критерию Манна–Уитни статистической значимости различий в скорости роста опухоли в группах необлученных мышей с введением беталейкина и параллельного контроля в 1-й и 2-й сериях опыта дала отрицательный ответ (р = 0.7 и 0.6 соответственно).
ОБСУЖДЕНИЕ
Прежде всего возникает вопрос, насколько результаты данного опыта в конкретной его аранжировке могут быть распространены на ситуацию использования беталейкина с целью защиты иммуногемопоэза при лучевой терапии спонтанных опухолей иного вида и притом у человека. Представляемый в этой статье материал конечно не дает окончательного ответа на поставленный вопрос, а является только попыткой подхода к его разрешению.
В литературе встречаются примеры как с позитивной, так и с негативной ролью ИЛ-1 в развитии опухолевого процесса. Однако основная масса этих работ касается роли эндогенного ИЛ-1, вырабатываемого либо самими опухолевыми клетками (аутокринный фактор роста), либо стромальными клетками опухоли, либо различными типами лейкоцитов, привлеченными в ткань опухоли ее антигенными свойствами и являющимися по существу проявлением противоопухолевой активности иммунной системы организма [5–7]. Но этот аспект проблемы “провоспалительные цитокины – спонтанный опухолевый рост” выходит за рамки данной работы и здесь не рассматривается.
Ясно, что введение экзогенного ИЛ-1, да еще в условиях туморицидного действия большой дозы облучения представляет собой совершенно иную ситуацию, в которой конечный результат применения ИЛ-1 будет зависеть в первом приближении от соотношения противолучевого/стимулирующего влияния препарата на опухоль, с одной стороны, и на иммуногемопоэтическую систему организма – с другой стороны.
Подход, связанный с использованием лейко/нейтропоэз-стимулирующего действия ИЛ-1 был уже апробирован в клинике для устранения лейкопений разного генеза (после лучевой и химиотерапии опухолей, в том числе в комбинации с трансплантацией костного мозга), и при этом не было отмечено негативного влияния ИЛ-1 на результаты противоопухолевой терапии [2, 9–13]. В этом ряду выделяется исследование М.Л. Гершановича, который стал использовать беталейкин не на пике лейкопении, а параллельно с применением химиопрепаратов и облучения [2]. В результате ему удалось предотвращать развитие выраженной лейкопении и избегать прекращения курса уничтожающего клетки воздействия. Это дало ему право говорить не о восстанавливающем лейкопоэз действии, как при курсах введения Г-КСФ, а о протекторном (не буквально, а феноменологически) эффекте беталейкина.
Акцент в нашей работе, конечно, сделан на сугубо феноменологическом аспекте: оказывает ли применение ИЛ-1 негативное влияние на развитие конкретной карциномы (не более того), и на это получен однозначно отрицательный ответ. В наших исследованиях применение стимулирующего пролиферативный процесс ИЛ-1 в условиях однократного локального облучения опухоли в большой дозе 20 Гр не смогло ни сократить период постлучевого прекращения роста, ни увеличить скорость роста после его восстановления.
Однако в эту, в целом единообразную, картину как бы нейтрального отношения введенного в организм извне ИЛ-1 к росту облученной перевивной опухоли одна из серий опыта внесла важный нюанс, выразившийся в заметном удлинении периода задержки роста опухоли после облучения и тенденции к замедлению роста в период его возобновления. При этом в данной серии опыта была отмечена самая низкая скорость роста опухоли в необлученной группе. Возникло предположение, что влияние беталейкина на рост перевивной опухоли зависит не только от факторов облучения и стимулирующей иммунный ответ активности препарата, но и от соотношения пролиферативного потенциала самой опухоли и влияющей на этот потенциал иммунной системы организма.
Полученный экспериментальный материал был подвергнут следующему анализу. Чтобы наглядно выявить роль беталейкина, была сопоставлена связь роста опухоли в облученных группах с беталейкином и без него, а рост в интактном контроле был использован как точка отсчета (рост для каждой группы выражался в % от роста в биоконтроле). Результат такой трансформации сопоставляемых показателей представлен на рис. 4.
Рис. 4.
Оценка влияния беталейкина на скорость роста опухоли в период восстановившегося после облучения роста в разных сериях опыта. (Цифры у точек – номер серии опыта). Диагональная линия – линия равнозначного ответа. Регрессионная зависимость сопоставляемых показателей серий опытов 2–4: y = 16.4 + 0.88x; r = 0.98, p = 0.12.
Fig. 4. Evaluation of betaleukine influence on growth rate in different experiment series. Digits near points are series numbers. Regression dependence of comparable indicators in 3 series: y = 16.4 + 0.88x; r = 0.98, p = 0.12.
На рис. 4 видно, что для трех серий имеется прямая линейная зависимость между сопоставляемыми показателями, лишь слегка (в пределах ошибки) превышающая диагональную линию равнозначного ответа, что свидетельствует об отсутствии влияния беталейкина на скорость роста опухоли в период выраженного роста после облучения. Аналитическое выражение представленной на рис. 4 зависимости
свидетельствует также о недостаточности данных для утверждения значимости указанной на рис. 4 зависимости. В то же время соотношение показателей для одной из серий на рис. 4 лежит существенно ниже указанной линии, что отражает тормозящее влияние беталейкина на рост опухоли.Затем отношение роста опухоли у облученных мышей с введением беталейкина и без него было сопоставлено непосредственно с выраженностью роста опухоли в интактном контроле (рис. 5).
Рис. 5.
Зависимость нормированного по К2 роста опухоли в группе “Облучение + беталейкин” (“Облучение + беталейкин”/К2, %) от роста опухоли в К1 в разных сериях опыта. Цифры у точек – номер серии опыта). Регрессионная зависимость сопоставляемых показатедей серий опытов 1–4: y = 53.2 + 0.1x; r = 0.97, p = 0.03.
Fig. 5. Dependence of tumor growth in the group “Exposure + betaleukine”, normalized on К2, on the tumor growth in K1 in different series. Regression dependence of comparable indicators in 4 series: y = 53.2 + 0.1x; r = 0.97, p = 0.03.
На рис. 5 видно, что между ростом опухоли в необлученных контролях и в группах с введенным беталейкином, скорректированных данными в облученных контролях, наблюдается линейная зависимость. Ее аналитическое выражение имеет следующий вид:
где y – отношение роста опухоли в облученных группах с введением беталейкина и без него, %; x – рост опухоли в интактном контроле, мм3/сут.Таким образом, картина роста опухоли в условиях ее локального облучения и введения в организм беталейкина после включения показателя роста опухоли в интактном организме в качестве фактора, непосредственно влияющего на весь процесс, приобрела черты единой и значимой зависимости, связывающей все четыре серии опытов. Конечно, нельзя утверждать, что эта зависимость имеет строго линейный характер, так как она представлена всего двумя неравными по нагруженности областями: весьма слабого стимулирующего указанный рост или даже отсутствующего влияния беталейкина (три сконцентрированные точки в области высоких значений роста в интактном контроле) и одной, но выраженной по влиянию беталейкина точки в области низкого роста в интактном контроле. Задача последующих опытов в проверке высказанной гипотезы заключается в нагрузке промежуточных областей роста опухоли в интактном контроле. Для этого необходимо разработать подход к управляемому получению низких уровней роста перевивной опухоли в интактном контроле.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Применение беталейкина при локальном облучении перевивной карциномы Льюиса у мышей ни в одной из четырех серий опыта не привело к ускорению роста опухоли, так же как введение беталейкина необлученным мышам с перевитой опухолью. В одной из серий опыта, в которой была отмечена наиболее низкая скорость роста опухоли в необлученном контроле, введение беталейкина привело даже к некоторому ограничению роста опухоли, что, возможно, указывает на оптимальные условия противоопухолевого действии иммуномодулятора в комбинации с облучением. Полученные результаты представленных опытов свидетельствуют о перспективности разработки модели с перевивной опухолью у мышей для предварительной оценки потенциальной возможности использования исследуемого противолучевого препарата в практике химиолучевой терапии опухолей.
Список литературы
Симбирцев А.С. Интерлейкин-1: от эксперимента в клинику // Мед. иммунология. 2001. Т. 3. № 3 (27). С. 431–438. [Simbircev A.S. Interlejkin-1: ot eksperimenta v kliniku // Medicinskaya immunologiya. 2001. T. 3. № 3(27). S. 431–438 (In Russian]
Гершанович М.Л., Аксенова Л.В. Беталейкин (рекомбинантный интерлейкин-1β) – эффективный стимулятор и протектор лейкопоэза в условиях комбинированной химиотерапии злокачественных опухолей: Пособие для врачей. СПб.: Новая Альтернативная Полиграфия, 2008. С. 1–16. [Gershanovich M.L., Aksenova L.V. Betalejkin (rekombinantnyj interlejkin-1β) – effektivnyj stimulyator i protektor lejkopoeza v usloviyah kombinirovannoj himioterapii zlokachestvennyh opuholej: Posobie dlya vrachej. SPb.: Novaya Al'ternativnaya Poligrafiya, 2008. S. 1–16 (In Russian]
Гребенюк А.Н., Легеза В.И. Противолучевые свойства интерлейкина-1. СПб.: Фолиант, 2012. 216 с. [Grebenyuk A.N., Legeza V.I. Protivoluchevye svojstva interlejkina-1. SPb.: Foliant, 2012. 216 s. (In Russian]
Рождественский Л.М. Актуальные вопросы поиска и исследования противолучевых средств // Радиац. биология. Радиоэкология. 2013. Т. 53. № 5. С. 513–520. [Rozhdestvenskij L.M. Aktual’nye voprosy poiska i issledovaniya protivoluchevyh sredstv // Radiac. biologiya. Radioekologiya. 2013. T. 53. № 5. S. 513–520 (In Russian]
Кетлинский С.А., Симбирцев А.С. Цитокины. СПб.: Фолиант, 2008. 552 с. [Ketlinskij S.A., Simbircev A.S. Citokiny. SPb.: Foliant, 2008. 552 s. (In Russian]
Dinarello C.A. Biological basis for interleukine-1 in disease // Blood. 1996. V.87. № 6. P. 2095–2147.
Baker K.J., Houston A., Brint E. IL-1 family members in cancer; two sides to every story // Front. Immunol., 07 June 2019. https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.01197
Липенгольц А.А., Черепанов А.А., Шейно И.Н. и др. Увеличение эффективности рентгенотерапии злокачественных новообразований при помощи гадолинийсодержащего препарата // Радиац. биология. Радиоэкология. 2014. Т. 54. № 5. С. 479–481. [Lipengol'c A.A., Cherepanov A.A., Shejno I.N. i dr. Uvelichenie effektivnosti rentgenoterapii zlokachestvennyh novoobrazovanij pri pomoshchi gadolinijsoderzhashchego preparata // Radiac. Biologiya. Radio-ekologiya. 2014. T. 54. № 5. S. 479–481 (In Russian)]
Redman B.G., Abubakr Y., Chou T. et al. Phase II trial of recombinant interleukine-1β in patients with metasta-tic renal cell carcinoma // J. Immunother. 1994. V. 16. P. 211–215.
Nemunaitis J., Appelbaum F.R., Lilleby K. et al. Phase I study of recombinant interleukine Iβ in patients undergoing autologous bone marrow transplant for acute myelogenous leukemia // Blood. 1994. V. 83. № 12. P. 3473–3479.
Iizumi T., Sato S., Iiyama T. Recombinant human inreleukine-1β analogue as a regulator of hematopoiesis in patients receiving chemorherapy for urogenital cancers // Cancer 1991. V. 68. P. 1520–1523.
Crowm J., Moore M., Gabrilove J. et al. A Phase I trial of recombinant human interleukine-1β alone and in combination with myelosuppressive doses of 5-fluorouracil in patients with gastrointestinal cancer // Blood. 1991. V. 78. № 6. P. 1420–1427.
Weisdorf D., Catsanis E., Blazar B.R. et al. Interleukin-1α administered after auriologous transplantation: a phase I/II clinical trial // Blood. 1994. V. 84. № 6. P. 2044–2049.
Дополнительные материалы отсутствуют.
Инструменты
Радиационная биология. Радиоэкология
Пн.-пт.: 10.00-19.00