Радиационная биология. Радиоэкология, 2021, T. 61, № 5, стр. 515-523

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА

Изучены морфологические характеристики пневмофиброза (ПФ) на материале аутопсий 125 работников предприятия атомной промышленности. При этом учитывались суммарная поглощенная доза в печени внутреннего α-облучения от инкорпорированного ²³⁹Pu и доза внешнего γ-облучения. Исследованы три группы биологических образцов ткани легкого (парафиновые блоки). 1-ю группу составили биологические образцы 56 работников с диагнозом плутониевого пневмофиброза (ППФ), 2-ю группу – 34 биологических образца работников с пневмофиброзом другого генеза (в исходе хронических воспалительных заболеваний легких) (ПФДГ); контрольную группу – 35 биологических образцов работников без легочной патологии.

Характеристика изучаемых групп работников представлена в табл. 1.

С целью проведения обзорной микроскопии образцы ткани легкого окрашивали гематоксилином и эозином. Для определения соединительнотканного каркаса легочной стромы и очагов пневмофиброза парафиновые срезы окрашивали по методу ван Гизона (выявление общего объема фиброза), по Гомори (на ретикулиновый каркас легочной стромы), по Вейгерту (на эластические волокна).

Во всех случаях было проведено углубленное морфологическое изучение аутопсийного материала с применением метода иммуногистохимии (ИГХ). Для иммунного окрашивания использовали пероксидазный метод с полимерной системой детекции (Histofine® Simple Stain MAX PO MULTI, Япония). Срезы инкубировали с моноклональными антителами к каспазе 3, антигену ядер пролиферирующих клеток Ki-67, рецепторам онкопротеина bcl-2, лейкемия-ингибирующему фактору LIF во влажной камере 60 мин при температуре 37°С (табл. 2).

Для количественной оценки результатов ИГХ-реакции получали микрофотографии образцов ткани с помощью системы фиксации микроскопических изображений, состоящей из микроскопа “Сarl Zeiss Axioskop 40”, цифровой камеры “Jenoptik ProgRes CT3”, персонального компьютера на базе Intel® Core™ i7, программного обеспечения “ProgRes CapturePro 2.5”. Из фотосъемки исключали поля зрения, содержащие дефекты ткани, дефекты окрашивания и артефакты.

Количественное исследование проводили с помощью программы компьютерного анализа изображений “Морфология 5.1” (ВидеоТест, Россия). При этом рассчитывали относительную плотность изучаемых структур по отношению к общей площади исследуемого образца по методике, описанной нами ранее [12].

Статистическую обработку полученных данных производили с использованием пакета прикладных программ “STATISTICA”. В расчетах использовали метод наименьших квадратов для определения параметров нелинейных моделей [13]. Для аппроксимации эмпирических данных использовали модель Вейбулла [14].

РЕЗУЛЬТАТЫ

В образцах легочной ткани 1-й группы очаги ПФ обнаруживались преимущественно в периферических и срединных отделах легочной паренхимы. В большинстве случаев ПФ был представлен крупными очагами разрастания соединительной ткани, местами сливающимися в обширные поля. Между фиброзными очагами определялись прослойки относительно сохраненной легочной альвеолярной ткани (рис. 1). Во всех случаях в препаратах образцов определялся воспалительный клеточный инфильтрат разной степени выраженности, полиморфный по составу. В частности, инфильтрат был представлен лимфоцитами, плазматическими клетками, сегментоядерными нейтрофилами, макрофагами.

Рис. 1.

Очаги фиброза при плутониевом (a–c) и неплутониевом пневмофиброзе (d–f), в сравнении с легочной стромой в контрольной группе (g–j). Окраска гематоксилином и эозином (a, d, g); по Вейгерту на выявление эластических волокон (b, e, i); по Гомори на выявление ретикулярных волокон (c, f, j). Увеличение ×12.5. Маркер 2.5 мм.

Fig. 1. Foci of plutonium-induced (a–c) and non-plutonium-induced (d–f) lung fibrosis compared to lung stroma in specimens of the control group (g–j). Hematoxylin and eosin staining (a, d, g); Wiegert’s staining to identify elastic fibers (b, e, i); Gomori’s staining to identify reticular fibers (c, f, j). Magnification ×12.5 (scale bar 2.5 mm).

В образцах 2-й группы очаги ПФ наиболее часто определялись в прикорневых областях, перибронхиально и периваскулярно. Очаги сохранившейся легочной паренхимы в основном занимали менее распространенную площадь, чем в 1-й группе, при этом легочная гистоархитектоника подвергалась меньшей трансформации. Также, во всех случаях в препаратах определялся полиморфноклеточный воспалительный инфильтрат разной степени выраженности. Состав инфильтрата в целом не отличался от 1-й группы и был представлен лимфоцитами, плазматическими клетками, полиморфноядерными нейтрофилами, макрофагами.

В образцах 3-й группы ПФ был выражен незначительно или отсутствовал. В отличие от 1-й и 2-й группы в легочном каркасе превалировали ретикулярные, а не коллагеновые волокна. Клеточный инфильтрат в легочной ткани определялся в единичных случаях и был представлен в основном интрамукозальными лимфоцитами и альвеолярными макрофагами.

Наибольшая площадь фиброза отмечалась в препаратах первой группы наблюдений. По сравнению с группой ПФДГ фиброз был более выражен на 11%, а с группой контроля – на 40%. При анализе состава соединительной ткани во всех исследованных группах, за исключением третьей, отмечено снижение плотности ретикулярной стромы. В то же время в группах ППФ и ПФДГ отмечено повышение содержания эластических волокон, выраженное их огрубение и повышение содержания при плутониевом и поствоспалительном ПФ. При этом строение эластических волокон в образцах этих групп было резко нарушено. Эластические волокна отличались нарушенной архитектоникой, были деформированы, резко утолщены, неоднородной толщины. Таким образом, при пневмофиброзе, обусловленном внутренним α-облучением от инкорпорированного плутония, изменения легочного соединительно-тканного каркаса имели отличия от таковых при пневмофиброзе, развивающемся при хронических воспалительных заболеваниях легких и только в объеме и локализации процесса.

При исследовании пролиферативной активности клеток легочной паренхимы было выявлено превышение экспрессии белка Ki-67 в образцах первой группы по сравнению с образцами группы контроля на 33% (рис. 2). При этом уровень пролиферативной активности в очагах ПФДГ (2-я группа) снижался по сравнению с третьей группой на 17%, что хорошо согласуется с литературными данными [15].

Рис. 2.

Экспрессия в очагах пневмофиброза маркеров системы клеточного обновления и лейкемия-ингибирующего фактора при ППФ и ПФДГ. Иммуногистохимический метод с антителами против bcl-2, caspase 3, Ki67, LIF, полимерная тест-система. Увеличение ×400. Маркер 50 мкм. ППФ – плутониевый пневмофиброз; ПФДГ – пневмофиброз другого генеза; ГС – группа сравнения (ПФДГ).

Fig. 2. Expression of markers of cellular turnover and leukemia inhibitor factor in fibrotic foci in PuPF and non-PuPF specimens. Immunohistochemistry with antibodies for bcl-2, caspase 3, Ki67, LIF, polymer test-system. Magnificantion ×400 (scale bar 50 μm). PuLF denotes plutonium-induced pulmonary fibrosis; nonPuPF denotes pulmonary fibrosis of a different origin; GC denotes group of comparison (nonPuPF).

В развитии пневмофиброза наряду с изменениями клеточной пролиферации важнейшая роль отводится системе клеточного обновления. В нашем исследовании было изучено содержание регуляторов апоптоза каспазы 3 и bcl-2, а также маркера пролиферативной активности Ki-67 в очагах ППФ и ПФДГ.

Данные исследования экспрессии биомолекулярных маркеров клеточной пролиферации, апоптоза и лейкемия-ингибирующего фактора в легочной ткани образцов исследуемых групп представлены в табл. 3–4.

Результаты настоящего исследования свидетельствуют о том, что при ППФ в легочной ткани отмечено снижение экспрессии онкопротеина bcl-2, в отличие от 2-й группы наблюдений, в которой отмечена выраженная сверхэкспрессия данного маркера. Аналогично более высокий уровень экспрессии маркера апоптоза каспазы 3 обнаруживался во 2-й группе наблюдений, при этом незначительно отличаясь от уровня контрольной группы. Наименее выраженная экспрессия каспазы 3 определялась в группе ППФ.

Также результаты исследования показали разницу в экспрессии маркера клеточной пролиферации Ki-67. Наиболее высокий индекс пролиферации (экспрессия Ki-67) был отмечен в образцах с ППФ, особенно в сравнении с группой ПФДГ. Экспрессия LIF определялась в цитоплазме пневмоцитов в альвеолах и очагах пневмофиброза. Уровень экспрессии LIF в 1-й и 2-й группах был значительно ниже, чем в контрольной группе.

Проведен корреляционный анализ полученных данных.

В первой группе (ППФ) статистически значимых корреляционных взаимосвязей между суммарной поглощенной в легких дозой внешнего γ-излучения, суммарной поглощенной в легких дозой внутреннего α-излучения и экспрессией маркеров клеточной пролиферации и апоптоза в очагах пневмофиброза не выявлено. В то же время в группе ППФ обнаружена значимая положительная корреляционная зависимость умеренной степени выраженности между экспрессией каспазы 3 и антиапоптотического белка bcl-2 (r = = 0.55). В группе ПФДГ эта взаимосвязь также определялась, но была значительно слабее (r = = 0.34). Но в группе ПФДГ выявлены положительные корреляционные связи между суммарной поглощенной в легких дозой внутреннего α-излучения с экспрессией каспазы 3 (r = 0.47) и LIF (r = 0.39).

В результате регрессионного анализа выявлены статистически значимые линейные зависимости указанных выше показателей от суммарной поглощенной в легких дозы внутреннего α-излучения. Результаты регрессионного анализа показали, что в группе ПФДГ показатели экспрессии каспазы 3 и LIF значимо возрастали с увеличением дозы облучения в диапазоне суммарных поглощенных в легких доз внутреннего α-излучения от 0 до 0.7 Гр (рис. 3–4). Дополнительные расчеты с помощью моделей нелинейного регрессионного анализа не дали положительных результатов.

Рис. 3.

Зависимость LIF от суммарной поглощенной в легких дозы внутреннего α-излучения (Dp): группа 2, линейная регрессия (r = 0.395), LIF = (0.53 ± 0.247) + (2.467 ± 1.031) Dp.

Fig. 3. LIF association with cumulative lung absorbed dose of internal α radiation (Dp): group 2, Linear regression (r = 0.395), LIF = (0.953 ± 0.247) + (2.467 ± 1.031) Dp.

Рис. 4.

Зависимость cpp32 от суммарной поглощенной в легких дозы внутреннего α-излучения (Dp): группа 2, линейная регрессия (r = 0.466), cpp32 = (0.853 ± 0.217) + (2.654 ± 0.904) Dp.

Fig. 4. cpp32 association with cumulative lung absorbed dose of internal α radiation (Dp): group 2, Linear regression (r = 0.466), cpp32 = (0.853 ± 0.217) + (2.654 ± 0.904) Dp.

ОБСУЖДЕНИЕ

Легочный фиброз – это хроническое заболевание легких, морфологически характеризующееся чрезмерным накоплением внеклеточного матрикса (ВКМ) и ремоделированием архитектуры легких. Патологические изменения при легочном фиброзе (чрезмерное накопление ВКМ и ремоделирование архитектуры легких) являются следствием нарушений двух физиологически сбалансированных процессов: пролиферации и апоптоза фибробластов, а также накопления и разрушения ВКМ. Когда нормальный баланс между отложением и удалением ВКМ смещается в сторону отложения, излишек ВКМ накапливается. Когда баланс между пролиферацией фибробластов и апоптозом смещается в сторону ускоренной пролиферации или замедления апоптоза, фибробласты (первичные продуценты ВКМ) накапливаются. Большое количество исследователей описывают склонность различных цитокинов стимулировать и усиливать фиброзный процесс. В то же время в некоторых случаях показана роль определенных цитокинов в ингибировании фиброза [1].

Одним из цитокинов, играющим важную роль в фиброгенезе, является LIF, который способствует активации стромальных фибробластов [6]. Одновременно цитокины группы интерлейкина-6 участвуют в регуляции апоптоза за счет индукции bcl-2 [8]. Активация каспаз является ключевым моментом в промежуточных и терминальных стадиях апоптоза [16]. Механизм действия каспаз реализуется через инактивацию белков, которые защищают клетку от апоптоза, в частности белка bcl-2. Уменьшение количества этого белка индуцирует развитие апоптоза [17].

В нашем исследовании отмечено, что при внутреннем облучении от инкорпорированных α-активных радионуклидов у лиц с пневмофиброзом, возникающим в исходе хронической обструктивной болезни легких и застойной сердечной недостаточности (ПФДГ), обнаруживается содружественное возрастание экспрессии LIF и проапоптотической каспазы 3 при увеличении дозы облучения в диапазоне суммарных поглощенных в легких доз внутреннего α-излучения от 0 до 0.7 Гр. В то же время в группе ППФ подобные связи не обнаружены. Однако в предыдущих работах были установлены значимые корреляционные связи выраженности фиброза в легочной ткани и накопления в очагах фиброза коллагенов III и V типов с суммарной поглощенной в легких дозой внутреннего α-излучения при ППФ [12]. Полученный результат можно объяснить тем, что высокие (>1.0 Гр) суммарные поглощенные в легких дозы внутреннего α-излучения, при которых развивается ППФ, вызывают детерминированный эффект в легочной ткани с развитием фатального повреждения эпителиальных клеток, лучевого пневмонита и лучевого пневмофиброза в исходе события. Поэтому взаимосвязи между дозой внутреннего α-облучения и нарушением системы клеточного обновления при ППФ методами, которые применяются в настоящем исследовании, достоверно установить не удается.

При обоих изучаемых видах пневмофиброза у лиц, подвергшихся радиационному воздействию, отмечена положительная корреляция между экспрессией проапоптотических и антиапоптотических маркеров, что подтверждает данные о повреждающем действии ИИ на элементы системы клеточного обновления в легочной ткани.

В развитии плутониевого и поствоспалительного пневмофиброза структурные изменения соединительной ткани были статистически значимо взаимосвязаны с суммарной дозой и продолжительностью внутреннего α-излучения от инкорпорированных радионуклидов.

Обнаружена значимая связь между внутренним α-облучением от инкорпорированного плутония и особым типом пневмофиброза, отличающегося от пневмофиброза, возникающего в исходе хронической обструктивной болезни легких и застойной сердечной недостаточности [12, 18].

Содержание белков-регуляторов системы апоптоза в очагах плутониевого пневмофиброза значительно отличалось от очагов поствоспалительного фиброза, что хорошо согласуется с литературными данными [19].

Таким образом, выявлена зависимость нарушений процессов клеточного обновления и пролиферации от суммарной поглощенной в легких дозы внутреннего α-излучения в очагах легочного пневмофиброза, что хорошо согласуется с литературными данными [15]. Кроме того, при суммарной поглощенной в легких дозе внутреннего α-излучения до 0.7 Гр выявлена значимая линейная зависимость между экспрессией цитокина LIF и проапоптотической каспазой 3, что, вероятно, имеет значение в развитии и прогрессировании плутониевого пневмосклероза.