Радиационная биология. Радиоэкология, 2021, T. 61, № 2, стр. 117-132

ОБОСНОВАНИЕ НАПРАВЛЕНИЯ И ВЫБОР МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Точность копирования ДНК в процессах репликации и репарации зависит не только от активности ферментов, но и определяется сбалансированным синтезом дезоксирибонуклеотид-трифосфатов (dNTP), который обеспечивает ключевой регуляторный компонент в цепи синтеза – тирозильный свободнорадикальный железосодержащий фермент рибонуклеотидредуктаза (RR), идентифицированный нами ex-vivo методом ЭПР в тканях и органах животных [1, 2]. В серии наших работ представлены результаты, свидетельствующие о регулирующей роли изменения активности рибонуклеотидредуктазы в уменьшении пулов четырех типов dNTP и их дисбаланса в условиях метаболической генерации повреждений ДНК в органах кроветворения [3–7]. Вектор ЭПР-исследований был направлен на выяснение потенциально важных, главных звеньев механизмов регуляции активности ферментной системы RR и ее участие в биохимической адаптации и функционировании системы SOS-репарации повреждений ДНК. Современный ЭПР-подход в изучении функциональной роли и анализа временнóй динамики свободнорадикальных метаболических парамагнитных клеточных систем позволил установить факты наличия адаптивного системного SOS-ответа на организменном уровне. Вопрос о многофакторной природе интегрального SOS-ответа системы de novo синтеза дезоксирибонуклеотидов и реакций ДНК, РНК и белков в условиях общего облучения организма млекопитающих в значительной степени остается открытым.

Напомним, что в экспериментах in vitro на изолированных тканевых и клеточных системах гипотеза SOS-репарации в наиболее полном виде была разработана и доказана ранее зарубежными авторами [8, 9]. Открытие энзиматической системы репарации ДНК во многом определило значение SOS-реакции клеточных систем в поддержании стабильности генома. В работах авторы обращали внимание, что в экстремальных условиях SOS-ответ связан с дисбалансом пулов dNTP, нарушением энзиматической системы синтеза и репарации ДНК, нарушением макромолекулярной структуры ДНК, формированием гипермутаций, снижением качества SOS-репарации, появлением двойных разрывов и возможной гибелью клеток системы кроветворения [10, 11]. Установлено, что обеспечение синхронности реакций гидролиза и ресинтеза нуклеотидов лежит в основе эффективной репарации брешей в цепях ДНК, возникающих из-за влияния эндогенных спонтанных или экстремальных экопатогенных факторов внешней среды. Реализация первичного поражения и полноценная репарация метаболических брешей на фоне дисбаланса синтезов dNTP, ДНК и белков замедляются и нарушаются в результате преобладания скорости гидролиза нуклеотидов, вследствие чего быстро развивается деградация ДНК, и может возникнуть опасность для жизни клеток [12, 13]. Изложенные факты касаются клеточной организации и функционирования составной части организма в условиях опытов in vitro, но будущее исследование – за организменным уровнем.

Мы полагаем, что современный биофизический подход к изучению вопросов на уровне целостного организма открывает возможности разработки экспресс-методов тестирования ранних повреждений системы SOS-репарации ДНК, во многом определяющих конечные эффекты радиогенных повреждений организма. В этих условиях необходимо вычленение из общих, взаимосвязанных цитогенетических изменений, реального количественного звена радиационно-индуцированных метаболических показателей, обусловливающих конкретные этапы постлучевого периода у экспериментальных животных.

Комплексную оценку совокупности данных ЭПР-исследований радикального фермента RR, изменения биосинтезов белка и ДНК радиоизотопными методами, биохимических показателей активности ряда ферментов в условиях действия ионизирующих излучений сопоставляли с результатами параллельного цитогенетического анализа крови в тех же экспериментальных моделях. Это и позволило адекватно судить о радиационно-индуцированных первичных поражениях ДНК, формировании и развитии мутационных процессов в пролиферирующих клетках, тканях и органах системы кроветворения млекопитающих [14, 15].

Попытки контролировать в полноценных опытах на организме методом ЭПР режимы биосинтеза внутриклеточных предшественников синтеза ДНК обозначили новые задачи по выяснению роли первичных физико-химических механизмов в повреждающих и восстановительных реакциях синтеза ДНК, РНК и белков в условиях γ-облучения. Как упоминалось выше, изучая динамику метаболических реакций с участием свободных радикалов и парамагнитных металлокомплексов в крови и тканях животных, установили важный феномен: дозозависимый SOS-репарационный организменный ответ гомеостатических систем жизнеобеспечения облученного организма [3–5].

Количественная оценка динамики свободнорадикальной активности фермента RR в тканях кроветворной системы ex-vivo позволила выстроить определенную цепочку логических заключений о значении возникающего дисбаланса нуклеотидов dNTP, служащих субстратами ДНК-полимераз в механизмах индукции радиационного мутагенеза и возникающих перестроек и нарушений в системах SOS-репарации ДНК в экстремальных условиях организменного радиационного окислительного стресса. Очевидно, в защитной SOS-реакции значительная роль принадлежит интегральной оценке последствий дисбаланса пулов нуклеотидов и комплекса молекулярных гомеостатических реакций в системе обеспечивающих синтез ДНК, РНК и белков [16, 17]. Результаты экспериментов позволили заключить, что в неблагоприятной для организма SOS-ситуации следствием дисбалансного мутагенеза является возможная индуцированная мутабильность генома, характеризуемая увеличением частоты спонтанных мутаций, проявляющихся отдаленными эффектами в последующих поколениях клеток и снижении их жизнеспособности. Следует отметить, что последствия резкого и длительного по времени дисбаланса могут быть одним из начальных пусковых звеньев злокачественного перерождения клеток. Известно, что запрограммированное самоубийство клеток (апоптоз) в пролиферирующих тканях млекопитающих также связано с длительным и глубоким нарушением процессов репликации и репарации ДНК.

ЭПР-АНАЛИЗ РАННИХ ФЕНОТИПИЧЕСКИХ РАДИОГЕННЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ

Методология исследований при изучении интегрального SOS-ответа ферментных систем целостного организма нацелена на рассмотрение системного организменного ответа, связанного с нарушением баланса внутриклеточных синтезов ДНК, РНК, белков, dNTP, повышающих вероятность возникновения генных и структурных мутаций в условиях общего γ-облучения. И на этой основе поставлена задача анализа информации о количественной фазно развивающейся взаимной обусловленности динамики энергетических и биосинтетических реакций в организме при развитии радиационного окислительного стресса [17, 18]. Важным результатом работы является выяснение “пороговых эффектов” и резервных возможностей гомеостатических реакций, отражающих изменения состояний организма, в условиях линейно нарастающего по силе и длительности воздействия ионизирующих излучений (ИИ). Кроме того, принципиальное значение имеет предоставление доказательств о роли мутационного процесса и взаимосвязанных механизмов репарации ДНК в радиационно-индуцированных повреждениях генома, а также в возникновении метаболических последствий, приводящих к пролиферативным заболеваниям и опухолевому росту. Использовали комплекс взаимодополняющих методов и оценивали адаптивный системный SOS-ответ ферментных систем защиты на уровне целого организма по динамике радиационно-индуцированных молекулярно-генетических повреждений в тканях и органах при воздействии различных доз γ-радиации.

Интенсивность свободнорадикального сигнала радикального фермента RR, регистрируемого ЭПР-методом в системах с высокой пролиферативной активностью, и, в том числе, органах кроветворения, пропорциональна его каталитической активности и изучена нами в динамике при действии на организм ИИ разной мощности дозы и различных экзогенных генотоксикантов [1–5, 14–16]. Спектр ЭПР активной RR представляет собой дублет со значением сверхтонкого расщепления а = 20 Гс и g-фактором 2.005 и регистрируется при значении микроволновой мощности, равной 200 мВт. Образцы измеряли при 77 К на радиоспектрометре “ER-220D” (Bruker, Германия) с использованием стандартной методики накопления и анализа спектров на мини-ЭВМ “Aspect-2000”. В монографии М.К. Пулатовой и соавт. подробно описана методология наших исследований [19]. Для контроля RR-активности использовали быстрозамороженные в жидком азоте образцы крови и ткани кроветворных органов. Биосинтетические реакции систем макромолекулярного синтеза оценивали с помощью радиоизотопных методов по временным и дозозависимым пострадиационным изменениям интенсивности биосинтезов ДНК, РНК и белков. Количественные ЭПР-измерения уровня каталитической активности рибонуклеотидредуктазы ex-vivo позволили анализировать и судить о пострадиационных изменениях синтеза dNTP в активно пролиферирующих тканях системы кроветворения (костный мозг, селезенка, тимус, печень). Кроме того, методом ЭПР контролировали показатели, характеризующие энергетические, детоксицирующие, актиокислительные, свойства крови, антирадикальную активность плазмы, изменения пулов Fe³⁺-трансферрина (Fe³⁺-ТФ) и Cu²⁺-церулоплазмина (Cu²⁺-ЦП) в крови и уровней адреналина и метгемоглобина. Наиболее высокочувствительными и информативными, позволяющими охарактеризовать влияние малых доз облучения и индивидуальную радиочувствительность организма, служили показатели изменения пулов плазменных белков Fe³⁺-ТФ и Cu²⁺-ЦП. Биохимическими методами определяли изменения содержания эстрадиола и тестостерона в плазме, клеточную активность супероксиддисмутазы (СОД) и глутатионредуктазы, антиокислительную активность крови, уровень внеклеточной низкомолекулярной фракции ДНК в плазме (_ВНДНК), ингибиторную активность α₂-макроглобулина в крови мышей и собак.

Особый интерес представляют вопросы ЭПР-анализа механизмов участия фермента RR в SOS-ответе и в репарационных реакциях повреждений ДНК; динамика его каталитической активности при действии на организм ионизирующих излучений разной мощности дозы и различных экзогенных генотоксикантов. Фермент RR контролирует скорость-лимитирующую стадию в синтезе ДНК: синтез 2'-дезоксирибонуклеозид-5'-дифосфатов (dNDP), катализируя замещение OH-группы в положении 2'-рибозного остатка на атом водорода и образуя 2'-дезоксипроизводные. Метаболический путь включения рибонуклеозид-5'-дифосфатов (rNDP) в молекулу ДНК представлен:

Синтез dNTP строго контролируется именно ферментом RR, поскольку NDP-киназа не лимитирует скорость этой реакции. На этапе, катализируемом RR, обеспечивается сбалансированное поступление четырех типов dNTP (аденин, гуанин, тимин, цитозин) для репликации и репарации ДНК, от величины пулов которых и их соотношения зависят как точность копирования, так и скорость синтеза ДНК. Установлено, что в условиях дисбаланса синтеза предшественников (dNTP) нарушается структурная стабильность макромолекул ДНК, образуются метаболические бреши в цепях ДНК и возрастает “нагрузка” на ферментные системы репарации [12, 13, 20].

Мы отмечали, что на активно пролиферирующих клеточных культурах детальная оценка роли фермента RR, как регулятора “качества синтеза” ДНК, продемонстрирована во многих экспериментах in vitro и свидетельствует об универсальном характере SOS-реакций организма на лучевое поражение. Именно в систематических ЭПР-исследованиях получена возможность судить о результативности подхода, позволяющего на организменном уровне контролировать вполне определенные и жизненно важные молекулярно-клеточные процессы. В ходе проведенных нами работ установлено, что SOS-ответ включает раннюю активацию систем синтеза dNTP, длительность которой не более 1 ч после воздействия агента на организм. В течение первого часа после γ-облучения животного максимальная активация синтеза dNTP в тканях сопровождалась мощным повышением интенсивности синтезов РНК, ДНК и белков в радиочувствительных активно пролиферирующих клетках кроветворных органов. Увеличение числа транскрипционных факторов во время SOS-ответа приводит к активации трансляции и накоплению пула фермента RR, что обеспечивает повышенный синтез dNTP. Резкая активация биосинтеза РНК и одновременный рост активности RR однозначно свидетельствуют о стимулирующем эффекте и об интегральном повышении мощности систем синтезов ДНК, РНК и всего белоксинтезирующего аппарата [3, 4]. Экспериментально обнаружено существование зависимости системной ответной реакции на дозы облучения. Из установленных в опыте взаимосвязей функций “селективного эффекта” с генетическими элементами мы пришли к выводу, что основным стимулом для SOS-активации синтеза dNTP в условиях радиационного воздействия является необходимость экстренной репарации увеличенного объема радиационно-индуцированных повреждений ДНК [5].

В ответе клеточных систем на облучение за SOS-активацией синтезов РНК и возрастанием пулов dNTP следовала закономерная стадия ингибирования RR-активности и синтезов РНК, ДНК и белков. Показательно, что в период от 3–24 ч синтезы dNTP и ДНК в селезенке облученных мышей были подавлены на 40 и 80–85% от контроля соответственно. Использование ЭПР в одном эксперименте с радиоизотопными и биохимическими методами позволило заключить, что последствия ингибирования и возникновения ошибок транскрипции и трансляции, дефектный репликативный синтез и неполноценная репарация ДНК при воздействии γ-радиации на организм проходят с участием нарушенного соотношения (дисбаланс) пулов четырех типов dNTP. Эффективная регуляция синтеза ДНК со стороны RR может быть нарушена под влиянием различных факторов, и особенно активных форм кислорода, что нашло подтверждение в ряде работ [11–13].

Комплекс факторов радиационного окислительного стресса может определять функциональную роль возникающих метаболических изменений, приводящих к увеличению суммарного выхода спонтанных мутаций и к появлению дефектов в молекуле ДНК. Под действием даже слабо выраженной степени ингибирования фермента RR имеет место значительное подавление синтеза ДНК, что обусловлено установленной в опытах сигмоидальной зависимостью между этими показателями. Поэтому даже незначительное изменение концентрации dNTP или их дисбаланс вызывают возникновение существенного подавления синтеза и репарации ДНК [14, 15]. Опыты свидетельствуют, что разрывы, обнаруживаемые вслед за облучением в ДНК клеток млекопитающих, уже через 1 ч полностью исчезают (репарируются). И, тем не менее, через 3 ч регистрируется новая волна разрывов в делящихся клетках при резком угнетении репликативного синтеза. В рамках адаптивного SOS-каскада взаимозависимых реакций уменьшение RR-активности реально может быть связано с зарегистрированным подавлением синтеза белков на 85% в органах облученных животных [16]. Показано, что регуляция активности RR осуществляется посредством синтеза de novo или деградации его субъединицы B2 – коротко живущего белка М2В, время жизни которого всего 3 ч. Дисфункция и деградация системы RR в условиях подавленного синтеза белков означают, что и пул B2, а также пул фермента RR не восстанавливаются. И это приводит к ингибированию синтеза ДНК [17, 18, 20].

Вторая волна активации синтеза dNTP, ДНК и белков связана с развитием компенсаторно-восстановительных организменных реакций, направленных на репарацию клеточных структур. Интенсивность этих реакций растет линейно с дозой облучения, (вплоть до летальной), при которой ее значение настолько велико, что возникает риск срыва метаболической защитной SOS-реакции организма и, в том числе, – ингибирование скоростей синтеза ДНК, РНК и белков из-за истощения биосинтетического и биоэнергетического потенциалов клеток [3, 4].

Биофизический подход позволил анализировать режимы возникновения индукции мутагенеза по характеру динамических изменений активности RR и изменению пулов плазменных белков Fe³⁺-трансферрина (Fe³⁺-ТФ) и Cu²⁺-церулоплазмина (Cu²⁺-ЦП), используемых в качестве метаболических маркеров SOS-ответа [5].

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЭПР-ПОКАЗАТЕЛЕЙ ДЛЯ ОЦЕНКИ АДАПТАЦИОННЫХ SOS-РЕАКЦИЙ И СТЕПЕНИ ТЯЖЕСТИ РАДИАЦИОННОГО ПОРАЖЕНИЯ ОРГАНИЗМА

В свете приведенной выше оценки системного нарушения цитогеномного гомеостаза и, в частности, этапов индукции репарации ДНК, попытались обосновать свой методический подход к анализу способов оценки радиозащитного действия ряда соединений. В опытах радиозащиты организма использовали концептуальную основу цитогенетических реакций системы SOS-ответа для прогностической оценки способности перспективных радиопротекторов предотвращать переход компенсаторно-восстановительных реакций в период развития постлучевого синдрома в гиперформу [17, 18].

Наличие индикаторов лучевого поражения обеспечивает возможность раннего выявления радиогенных молекулярно-клеточных повреждений, расширения представлений о природе молекулярно-клеточных мишеней и механизмов радиогенных эффектов. Анализ результатов наших опытов о временных изменения клеточных SOS-реакций, индуцированных облучением (в дозах от 0.25 до 16 Гр), свидетельствует, что возрастание частоты генных мутаций и мутаций хромосом, несомненно, в определенной степени, связано с механизмами возникающего дисбаланса нуклеотидов. Подтверждением важной функциональной роли RR в фенотипических мутациях является существование корреляционной связи между активностью этого фермента репарации и фазными изменениями в крови ряда показателей SOS-реакции организма и, в частности, пулов активных плазменных белков Fe³⁺-трансферрина (Fe³⁺-ТФ) и Cu²⁺-церулоплазмина (Cu²⁺-ЦП).

В костном мозге, селезенке, тимусе синтез dNTP и ДНК зависит от колебания содержания железа в клетках, так как субъединица М2 рибонуклеотидредуктазы (Fe³⁺-RR) содержит два иона железа. Обеспечение клеток ионами Fe³⁺ осуществляет железотранспортный белок плазмы крови Fe³⁺-трансферрин. Механизм переноса ионов включает стадию образования комплекса Fe³⁺-TФ с его рецептором. Блокада рецепторов, в ответ на облучение, приводит к уменьшению пулов Fe³⁺-TФ в крови, в зависимости от дозы облучения, и к подавлению синтеза dNTP и ДНК, а также и железозависимых и железосодержащих белков, в том числе митохондриальных [20, 21]. Отметим, что другой важнейший многофункциональный белок плазмы Cu²⁺-церулоплазмин (Cu²⁺-ЦП) окисляет ионы Fe²⁺ до Fe³⁺ и, благодаря этой ферроксидазной активности, способствует включению ионов железа в апотрансферрин. Кроме того, этот транспортный белок обеспечивает клетки ионами Cu⁺. К тому же, Cu²⁺-ЦП, обладая аминоксидазной активностью, регулирует концентрацию биогенных аминов, а также является основным антиоксидантом крови, благодаря его супероксиддисмутазной и пероксидазной активностям [22].

Изменения пулов плазменных белков в крови были использованы для контроля динамики синтезов ДНК, dNTP и белков в качестве маркеров, отражающих развитие фенотипических молекулярно-клеточных компенсаторно-восстановительных реакций. Совокупность биомаркеров позволила судить о временных и дозовых изменениях индивидуальных реакций при действии радиационных факторов на организм. Было обнаружено, что фазные изменения пулов Fe³⁺-ТФ в крови облученных собак однотипны и по времени их регистрации совпадают при всех использованных дозах облучения (0.25–16.0 Гр). Существует мнение, что эти закономерные динамические аспекты клеточных систем находятся под жестким контролем эволюционного отбора, направленного против дестабилизации генома: способствуют “сохранению целостности клеточной организации, предотвращению сбоев и обеспечению контроля за возможными повреждениями” [23].

В ходе наших опытов были зарегистрированы максимальные значения пула Fe³⁺-ТФ на 2-е и 6-е сутки от момента начала γ-облучения. Последующие повышения пулов Fe³⁺-ТФ закономерно регистрировали с 10-х по 15-е, с 20-х по 27-е и с 45-х по 60-е сутки. И они были менее интенсивными и растянутыми во времени. Важно, что в тех же самых опытах регистрировали идентичную динамику и фазовую зависимость изменений пулов Cu²⁺-ЦП и содержания метHb, супероксиддисмутазную активность, антипротеолитическую активность α₂-макроглобулина.

В опытах на собаках, для отражения показателей индивидуальной сложной биологической системы, методом ЭПР оценивали интенсивность организменных интегральных реакций на разные дозы облучения по величине прироста пула Fe³⁺-ТФ на 2-е (или на 6-е) сутки от его минимального значения, которое регистрировали через 9 ч после облучения, т.е. ΔI = I_макс – I_мин. Было обнаружено, что величина ΔI линейно росла с увеличением дозы, вплоть до летальной. Характерно, что при дозах, превышающих летальную, увеличения ΔI не наблюдали. В экстремальных условиях действия больших доз облучения, когда “гиперответ” переводит организм в состояние предельного “биохимического напряжения”, возникает “летальный удар” – срыв реакций адаптации и цитогенетических внутриклеточных процессов. Это неизбежно сопровождается истощением энергетических, синтетических, нейрогуморальных и иммунных резервов, вызывающих репродуктивную гибель клеток, приводящую к необратимым пострадиационным изменениям в организме.

Отметим, что для оценки методом ЭПР неспецифической компоненты резистентности, определяющей исходное состояние, использовали отношение (Fe³⁺-ТФ/МетHb)_ИСХ, которое учитывает синтез dNTP и других железосодержащих белков и убыль функционального гемоглобина в периферической крови. Для практически здоровых собак контрольной группы величины этого показателя были в пределах 0.9–1.6. Для собак в “активированном” состоянии (например, из-за стресса или приема лекарств) значение (Fe³⁺-ТФ/МетHb)_ИСХ было больше, а в “угнетенном” состоянии – меньше указанных значений. Комплексная оценка этой группы собак в экстремальных опытах характеризовалась наибольшими отклонениями от контроля. Именно у этих животных были зарегистрированы повышенная радиочувствительность и интенсивность организменной адаптивной реакции, неадекватная дозе облучения. Кроме того, во всех случаях индивидуальных отклонений от контроля повышение пула Fe³⁺-ТФ не отвечало линейной зависимости доза/эффект и не предотвращало возникновение сбоев устойчивости к повреждающему действию γ-облучения [24].

Реакции организма остаются неизменными по своей характерной фазовой картине и при облучении в малых дозах (0.25 и 0.5 Гр). Регистрировалось повышение пулов Fe³⁺-ТФ и Cu²⁺-ЦП, адреналина и гемоглобина, активности СОД и глутатионпероксидазы, активности α₂-макроглобулина в крови собак, но только в течение первых 10 суток. Затем пул Fe³⁺-ТФ уменьшался и к 90-м суткам составлял 50% от исходного значения. Эти наблюдения подтверждают развитие адаптивных реакций в условиях γ-облучения малыми дозами и позволяют сделать вывод о динамическом регуляторном организменном SOS-ответе, отражающем единый характер процессов клеточного обновления кроветворной ткани [25].

Анализ динамики величин ЭПР-показателей свидетельствует о колебательном характере биохимической адаптации к пролонгированному радиационному фону и позволяет судить о закономерных реакциях, отражающих феномены цитогенетической индивидуальной радиорезистентности организма. Несомненно, что ЭПР-биомаркеры определяют фенотипические реакции, реально связанные с дозой облучения, вплоть до низких доз. Установлено, что накопление даже малой дозы облучения млекопитающими приводит к уменьшению пула Fe³⁺-ТФ, и это негативно отражается на процессах гемопоэза и эритропоэза, а также не может не сказаться на пролиферативной активности клеток.

Таким образом, на основе пострадиационных индивидуальных изменений пулов Fe³⁺-ТФ в крови подопытных собак в стандартном неспецифическом ответе на γ-облучение можно выделить следующие стадии: 1) SOS-повышение пулов и активности фермента RR, результатом которого является активация синтеза dNTP и ДНК;

2) последующее, в течение первых суток, уменьшение пулов и ингибирование RR-активности, приводящее к подавлению железозависимых, в том числе митохондриальных энергетических процессов, и синтеза dNTP, ДНК, РНК и белков;

3) восстановление RR-активности и ключевых процессов развития компенсаторно-восстановительных реакций организма связано с интегральным повышением мощности систем железозависимых синтезов dNTP, ДНК и всего белоксинтезирующего аппарата.

В течение первых суток после облучения, за счет выраженного ингибирующего эффекта RR и снижения синтеза предшественников ДНК (dNTP), усиливается первичное радиационно-индуцированное поражение – критическое для развития и дальнейших возможных повреждений ДНК. Вторая волна – активация синтезов – обеспечивает развитие компенсаторно-восстановительных реакций клеточных систем органов и тканей, направленных на репарацию клеточных структур и соответствующих адекватных, обеспечивающих защиту организма метаболических реакций. Важно отметить, что установлена зависимость этих репарационных SOS-ответов от исходного состояния организма и его индивидуальной радиочувствительности.

Анализ количественных показателей и их причинная обусловленность в условиях РОС позволяют заключить об инициации резервных возможностей организменного SOS-ответа важнейших систем жизнеобеспечения. Установлены функциональная роль и возможность использовать в качестве биомаркеров плазменные белки крови Fe³⁺-трансферрина (Fe³⁺-ТФ) и Cu²⁺-церулоплазмина (Cu²⁺-ЦП), участвующие в метаболическом контроле синтезов dNTP и изменении режима функционирования систем синтеза ДНК, РНК и белков в условиях действия экопатогенных факторов. Эффективное использование ЭПР-методологии позволяет характеризовать ранние молекулярно-клеточные SOS-реакции и комплексную оценку совокупности параметров, обеспечивающих каскад системных защитных реакций организма в условиях облучения. Обнаруженные в радиобиологических экспериментах закономерности подтверждают, что в тканях и органах главной мишенью радиационного поражения служит система биосинтеза макромолекул ДНК, РНК и белков. Дисбалансная концепция мутагенеза расширила наше понимание круга явлений SOS-адаптации, позволила по-новому объяснить стохастический характер возникновения фенотипических мутаций и прийти к заключению, что “мутагенная репарация управляется сложными эволюционно наработанными механизмами регуляции и не оставляет сомнений относительно физико-химической природы этого процесса [23].

СТРЕСС-АДАПТИВНОСТЬ И ИНДУЦИРОВАННЫЙ МУТАГЕНЕЗ В УСЛОВИЯХ SOS-РЕПАРАЦИИ ФЕНОТИПА ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ИОНИЗИРУЮЩИХ ИЗЛУЧЕНИЙ НА ОРГАНИЗМ

Сложные функциональные взаимоотношения между центральными регулирующими системами (нервная, иммунная, эндокринная, репродуктивная) и субклеточными энзиматическими системами (антиоксидантная и ДНК-репарирующая) в экстремальных условиях могут нарушаться, увеличивать радиационно-индуцированную нестабильность генома, повышать эндогенный мутагенный фон и перестраивать функциональное метаболическое состояние клеток, заметно изменяя их восприимчивость к стресс-фактору. Становится очевидным, что репарация ДНК имеет исключительное значение для поддержания надежности и устойчивости биологических систем при экстремальных воздействиях на организм.

Результаты исследований, проведенных в последние годы, свидетельствуют, что стресс адаптивный SOS-ответ при воздействии различной мощности и дозы ИИ в значительной степени зависит от генетических систем и подсистем клетки и организма. При выяснении физико-химических механизмов радиогенных повреждений существенным моментом для этой оценки служили вышеприведенные факты и феноменология дисбалансного мутагенеза и их роль в возникновении мутабильности и нарушения условий синтеза и репарации ДНК [17, 25].

Регистрация ЭПР-показателей и комплекса физико-биохимических характеристик указала на возможность оценить количественно жизненно важные цитогенетические эффекты радиационного поражения организма животных и человека. Эмпирическое обобщение фактического материала позволило выявить важную роль активности SOS-каскада механизмов репарации ДНК у млекопитающих в условиях общего облучения. И на этом основании предполагается комплексно отслеживать регулярное поведение и оценку отдаленных последствий мутагенных эффектов, обусловливающих нарушение эффективности SOS-репарации при перестройке режимов центральных функциональных систем организма [18, 25].

Описываемый подход становится расширенной методологической задачей: установить важную конкретику изменения широкого спектра молекулярно-клеточных диагностических параметров с участием центральных организменных систем регуляции метаболизма. Очевидно, предстоит изучать причинно-следственную взаимосвязь и взаимозависимость спектра реакций систем субклеточного метаболизма (энергетической, белоксинтезирующей, генетической, детоксицирующей) в условиях моделирования различных режимов угнетающего или стимулирующего действия процессов облучения.

Физико-химические закономерности, в экстремальных условиях существования, насколько мы проверили в экспериментах с помощью ЭПР-показателей, имеют универсальное значение при изучении сложных биологических систем и во многом определяют перспективы теоретических обобщений и практических предложений. При более глубоком анализе SOS-реакций крупных организмов (и особенно человека) необходимо рассматривать их в сопоставлении со специальными цитогенетическими фактами, отражающими дополнительный аспект описания и интерпретации системных радиогенных изменений в организме.

Стохастический характер изучаемых процессов и индивидуальные различия в чувствительности организма к действию ИИ имеют решающее значение как в биологической статистичности, так и в проявлении неопределенностей изучаемых эффектов. Простое измерение генетического “брутто”-эффекта, пусть даже и дополненное биофизическим анализом молекулярно-клеточных реакций, не обеспечит установление надежного “порога” действия ИИ и вывода о роли критических фенотипических мутаций в возникновении конкретной экопатологии. Решающее значение имеет возможность судить по динамическому характеру комплексного организменного SOS-ответа о вероятности перехода изучаемых биологических систем в экстремальных условиях из одного состояния в другое [25].

Формирование идеологии и выработку концепции мы начинали с изучения последствий высоких доз γ-облучения, снижая их в опытах на животных до реально малых доз. При изучении закономерностей реакций генетических систем и подсистем клетки важно было зарегистрировать комплекс показателей раннего интегрального SOS-ответа. Было показано, что темп и характер возникающего SOS-каскада неспецифической адаптивной активности определяют стартовые точки и количественные реакции систем, чувствительных к отдаленным негативным последствиям, реально связанным с нарушениями эффективности репарационных процессов в системе ДНК кроветворных органов [26]. С этим связано выявление фактов о накоплении мутаций в митохондриальном геноме, где скорость мутаций существенно выше, чем в ядерном. Речь идет о возникновении специальных режимов индукции дополнительных репарирующих систем к широкому спектру возмущений от экопатогенных агентов различной природы и вероятному возникновению злокачественных радиогенных опухолей и лейкозов в облученном организме [27]. Количественная интерпретация и возможность функциональной оценки стохастических звеньев и их системного характера с помощью комплекса цитогенетических критериев SOS-реакций чрезвычайно важны именно в связи с прогностическим анализом возникновения отдаленных последствий в условиях индивидуального организма. Безусловным моментом в реальной оценке индивидуальной радиоустойчивости служит выявление конкретных информационных различий в SOS-ответах с учетом дополнительных факторов внешней среды. Использование эпигенетических механизмов реально определяет итоговые фенотипические реакции млекопитающих на облучение. В этих условиях необходимы оценка (по совокупности параметров) устойчивости организма к общему γ-облучению и вычленение из общих взаимосвязанных изменений главных звеньев ведущих механизмов, обусловливающих определенные негативные радиобиологические эффекты.

Мониторинг состояния здоровья детей, подвергшихся радиационному воздействию в малых дозах, имеет новое и самостоятельное значение также как и установление индивидуальной повышенной радиационной чувствительности в детской популяции с помощью тестов молекулярного и клеточного уровня [28–30]. Первичная реакция детского организма к изменившемуся фону на начальном этапе заключается в повышении уровня Fe³⁺-трансферрина и Cu²⁺-церулоплазмина в крови и плазме, что функционально связано с активацией окислительных и энергетических реакций, обеспечивающих адекватный контроль за скорость-лимитирующей стадией в синтезе ДНК. При проведении длительного динамического обследования было зарегистрировано сохранение закономерного повышенного уровня содержания Fe³⁺-трансферрина и Cu²⁺-церулоплазмина в крови и плазме у детей, что обеспечивает активацию синтеза dNTP и ДНК, т.е. защиту и восстановление кроветворной и репродуктивной систем организма в ответ на длительное радиационное воздействие. У детей, проживающих в регионах с более высоким уровнем загрязнения радионуклидами, установлено устойчивое снижение интенсивности сигналов Fe³⁺-ТФ и Cu²⁺-ЦП в крови и плазме при сохранении динамики фазовозависимых изменений клеточного метаболизма у облученных. Это свидетельствует о снижении включения ионов железа в апотрансферрин, ухудшении антиоксидантных свойств крови, подавлении синтеза dNTP из-за ингибирования свободнорадикальной активности RR. Последнее приводило к подавлению синтеза dNTP, следовательно, – ингибированию скорость-лимитирующей стадии в синтезе ДНК, а также к ингибированию синтеза железосодержащих белков и ферментов. Нарушение работы ЦЭТ приводит к усилению продукции активных форм кислорода и развитию хронического и острого энергетического кризиса, возникающего на уровне целого организма [27, 31].

На фоне изменчивости уровня мутагенеза установлены сведения об увеличении выхода мутаций митохондриальной ДНК по сравнению со спонтанным уровнем этих нарушений. Существуют многочисленные свидетельства того, что окислительный стресс и мутации _МТДНК снижают митохондриальный синтез АТР [27, 33]. Таким образом, возникает хорошо известная ситуация “порочного круга”, когда снижение синтеза АТР под влиянием указанных факторов приводит к снижению активности RR, нарушению баланса dNTP, что чревато снижением эффективности репарации и повышением мутаций в _МТДНК, которые, в свою очередь, вызывают дальнейшее снижением синтеза АТР и т.д. Это позволяет считать уровень активности RR, зависящей от концентрации АТР, важным непосредственным фактором высокой частоты мутаций _МТДНК [34, 35]. Интерпретация результатов позволила заключить, что комплекс ЭПР-биомаркеров радиочувствительности отражает совокупные возможности оценить пороговые и дозовые эффекты, выявить детерминанты адаптивных молекулярных реакций облученного организма детей в критические периоды их роста. Повышенная индуцированная нестабильность генома, мутации в соматических клетках, снижение эффективности репарации увеличивают риск развития молекулярно-геномных повреждений и увеличивают состояние дезадаптации детского организма [35, 36].

Цитогенетические исследования показали увеличение частоты аберраций хромосом, активацию соматического мутагенеза, накопление клеток с дисгеномными эффектами в детском организме [30]. По структуре хромосомных аберраций выявлено увеличение количества делеций, инверсий, колец, изохроматидных и одиночных фрагментов и пробелов, полиплоидии. У детей, проживающих в регионах радионуклидного загрязнения, уровень внеклеточной ДНК (_ВКДНК) статистически значимо превышает таковой показатель в группе сравнения. Установлено, что в группе детей, облученных внутриутробно и рожденных в 1986–1987 гг. (1-е поколение), имеет место значительное повышение _ВКДНК (7.87 ± 0.58 мкг/мл) а в группе сравнения – 4.53 ± 0.23. Повышенный уровень _ВКДНК и увеличение выхода в циркуляцию клеток – предикторов апоптоза (клетки с иммунофенотипом CD95+) характеризуют активность клеточного апоптоза и могут свидетельствовать о наличии склонности к новообразованиям [29, 30]. Отметим, что у детей из регионов радионуклидного загрязнения дисгеномные эффекты сопровождаются закономерным параллелизмом явлений нарушения нуклеотидного обмена: изменения соотношений уровня нуклеотидов и их метаболитов в крови регистрируются чаще, чем в группе сравнения [32].

Все это указывает на регуляторное непостоянство генома, активную элиминацию “поломок” ДНК, высокую скорость процессов катаболизма, т.е. развитие феноптоза. Это связано с комплексной модификацией генной экспрессии, обусловливающей как потенциально обратимые изменения, так и возможное развитие экопатологии. Однако “вклад генома” можно по-настоящему оценить только в контексте взаимодействия организма со средой обитания (эпигеномика в действии).

Существует необходимость в продолжении исследований. И на этом пути могут быть получены результаты для выявления групп повышенного риска на основе изучения молекулярно-клеточных механизмов и использования новых дополнительных научных критериев оценки последствий, приводящих “по факту” к пролиферативным заболеваниям и опухолевому росту. Дальнейшее посемейное изучение индивидуальных генотипических особенностей детских организмов, использование методов аналитического и математического анализа, выявление адекватных индивидуальных оценок наследуемости мультифакториальных заболеваний потребует серьезного компьютерного мониторинга. Это позволит определить неизвестные факты индуцибельной SOS-репарации и “несовершенств” репарации, приводящих к реализации адекватных мутагенных эффектов радиационного воздействия в растущем организме ребенка.

Принципиально важно установление предельно допустимых доз и мощностей облучения для выяснения концепции “пороговости” действия и сведений о влиянии хронического воздействия малых доз ионизирующих излучений. Это может способствовать выявлению групп людей с повышенным риском возникновения различных экопатологий. Научный интерес представляет анализ динамики комплекса показателей: совокупности общепринятых параметров радиочувствительности и количественные сведения об увеличении выхода конкретных видов спонтанных мутаций _МТДНК и _ЯДНК, о фактах экспрессии определенных генов в ядрах и митохондриях, об экзо/эндогенных факторах, обусловливающих нарушение регуляции эффективности SOS-репарации. Это может отражать интегральную устойчивость, зависящую от режимов “поведения” функциональных систем регуляции целостного организма.

Развитие методов анализа и прикладная направленность исследований стали убедительным “руководством к действию”: необходимость изучения механизмов эффективной радиозащиты и модификации лучевого повреждения уникальных структур клетки на основе комплекса цитогенетических количественных показателей репарации повреждения ДНК. Целью является выяснение роли индуцированного мутагенеза и закономерностей возникающих фенотипических изменений при действии экофакторов различной природы на потенциал живых систем. Определяющее значение в экстремальных условиях существования приобретает анализ фактов и физико-химических механизмов радиационной опасности с учетом дополнительных экопатогенных воздействий. Все это связано с перспективами развития современной оценки непосредственных и отдаленных последствий радиоактивных загрязнений для людей и биоценозов.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РЕГУЛЯТОРНЫХ МЕХАНИЗМОВ ИНДУКЦИИ СИНТЕЗА dNTP И ДНК ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ РАДИОРЕЗИСТЕНТНОСТИ ОРГАНИЗМА В УСЛОВИЯХ ОБЩЕГО ОБЛУЧЕНИЯ

Анализ собственных результатов и научных идей, касающихся принципиально важной взаимосвязи фенотипических мутационных повреждений с формированием резистентности организма к ДНК-повреждающим агентам во многом определил методологические подходы к задачам противорадиационной защиты. Напомним, что существует биохимический путь регуляции свободнорадикальной активности RR, который в большей степени нарушается при воздействии радиации и в пострадиационном периоде. Для фермента RR биохимическими регуляторами активности являются редокс-состояние SH-групп в активном центре, пулы АТФ и dNTP, концентрация внутриклеточного кислорода и ионов железа, содержание восстановителей. Инициированные радиацией процессы пироксидного окисления негативно влияют именно на эти факторы, а участие повышенной активности RR помогает снижать летальный удар γ-облучения на синтез и репарацию ДНК. Отметим, что dNTP являются субстратами для ДНК-полимеразы, и ее активность регулируется по субстрат-зависимому механизму, что, безусловно, влияет на скорость синтеза ДНК.

В ряде наших работ были получены сведения, что существует дозозависимая корреляция между степенью ингибирования активности RR и накоплением разрывов в ДНК в УФ-облученной культуре фибробластов человека и других культурах клеток. Повышение активности RR или сохранение ее на уровне нормы обеспечивает пулы dNTP, достаточные для эффективной эксцизионной репарации ДНК. Так называемые “нерепарируемые” повреждения ДНК, составляющие 1–3% от общего количества, одно- и двунитевых разрывов ДНК, регистрировались спустя 6 ч после облучения, когда активность RR была максимально снижена, но стоило добавить dNTP на фоне подавленной активности RR – происходила полная репарация разрывов ДНК уже в течение 1.5 ч [7, 15]. Как показано в этих работах, пострадиационное появление структурных дефектов ДНК, в определенной степени, обусловлено дефицитом и дисбалансом пулов dNTP, которые мобильно осуществляют и определяют неполноценную репликацию и дефектную репарацию.

Новый подход к созданию противолучевых средств различного назначения мы связываем с использованием концепции системного SOS-ответа молекулярно-генетических систем в условиях радиационного окислительного стресса. Роль дисбаланса дезоксирибонуклеотидов в генерации фенотипических мутационных повреждений ДНК и возникновении неспецифической адаптивной реакции клеточных систем на внешние воздействия достаточно очевидна. С этой точки зрения рассматриваем активацию определенных ферментных систем и экспрессию определенных генов, связанных с разного типа репарацией разрывов ДНК и/или накоплением летальных повреждений типа хромосомных аберраций. Важно оценить регуляторный характер молекулярно-клеточной SOS-реакции в поддержании целостности генетических систем и подсистем клетки и попытаться установить критерии повышения резистентности организма в экстремальных условиях.

Примером использования результатов исследования стохастического характера возникновения фенотипических мутаций и взаимосвязанных хромосомных повреждений в условиях радиационно-окислительного стресса является попытка обосновать методологические аспекты ЭПР-анализа радиационных эффектов на основе механизмов, их определяющих. Исходя из расшифровки критических этапов и поиска критериев лучевого поражения на основе динамического SOS-ответа и с учетом закономерностей механизмов интерфазной гибели клеток, правильность нашей концепции была проверена на моделях радиозащиты с использованием радиопротекторов различного класса. В качестве маркеров радиочувствительности для оценки степени эффективности радиопротекторов использовали свободнорадикальную активность RR (в опытах на мышах) и изменения пулов Fe³⁺-ТФ и Cu²⁺-ЦП в крови и содержания _ВНДНК в плазме крови (в опытах на собаках). Изменения пулов позволяют надежно и количественно контролировать линейную зависимость дозовых реакций организменного ответа, степень радиационного поражения и результативность защитного действия перспективных радиопротекторов [15, 16].

Эффективные, по тесту выживаемости животных, радиопротекторы вызывали максимальное повышение RR-активности в сроки, когда у незащищенных облученных животных она была подавлена на 40–50% от контроля. Отметим, что у защищенных животных радиопротектор-обусловленное повышение RR-активности создавало условия для поддержания высоких сбалансированных пулов dNTF во время облучения. Это обеспечивает репликативный синтез ДНК и его эффективную репарацию в костном мозге и в селезенке от повреждений. При этом предотвращается образование новых радиационно-индуцированных повреждений ДНК и обеспечивается более раннее интенсивное развитие компенсаторно-восстановительных реакций. Исследования подтвердили, что радиопротекторы индралин и индометофен защищают синтез АТФ и гликогена в органах животных, повышают активность RR и обеспечивают индукцию синтеза dNTP в радиочувствительных органах [24].

Существование взаимосвязанных фактов и механизмов адекватного взаимодействия между активностью этого ключевого фермента ДНК-репарации и соответствующими изменениями пулов активных плазменных белков Fe³⁺-ТФ и Cu²⁺-ЦП в крови собак свидетельствуют о важной роли ферментной системы RR в эксцизионной репарации ДНК. Очевидно, что механизмы, обеспечивающие клеточную стабильность, закономерно осуществляют адекватную активацию синтеза дезоксирибонуклеотидов – субстратов ферментов синтеза ДНК [8–11]. Радиопротекторы, активируя синтез ДНК, РНК и белков, обеспечивают их защиту и полноценное восстановление в раннем пострадиационном периоде. Именно эти эффекты имеют решающее значение для поддержания жизнедеятельности клетки и определяют высокую выживаемость животных, облученных в смертельных дозах [14, 15]. По сути, дисбалансная концепция мутагенеза позволила подтвердить метаболическую природу мутагенного действия ионизирующих излучений и стохастический характер возникновения фенотипических мутаций и большого количества разнообразных хромосомных повреждений в условиях окислительного радиационного стресса. Экспериментально доказано, что активация синтеза dNTP к моменту облучения и в критические сроки лучевого поражения может быть реально использована в опытах радиозащиты организма с помощью радиопротекторов.

Именно на основе использования ЭПР-технологий удалось разработать рациональные унифицированные принципы отбора перспективных радиозащитных средств широкого назначения, обосновать дозы препаратов, установить режимы их введения для получения оптимальной защиты по тесту выживаемости животных и развитию восстановительных процессов в крови и органах [14–18]. Предложена схема радиозащиты при остром облучении, в которой на этапе I используется модификатор радиорезистентности индометофен, повышающий на протяжении нескольких часов общую неспецифическую резистентность в группе животных. На этапе II используется радиопротектор экстренного действия – адреномиметик индралин. Установленный противолучевой эффект достигался введением половинной радиозащитной дозы препарата индралин, что, несомненно, уменьшало токсические эффекты и накопление продуктов деградации ДНК в условиях острого облучения [24, 25].

В опытах на собаках доказано, что индукторами синтеза dNTP могут быть вещества, являющиеся β-блокаторами адреналиновых рецепторов, а также вещества, обладающие эстрогеноподобным действием. Вещества, известные как антиоксиданты, также вызывают индукцию синтезов дезоксирибонуклеотидов, способствуют эффективной репарации ДНК и содействуют развитию метаболического радиоадаптивного ответа организма при нарушениях дыхательной цепи митохондрий. Использование ЭПР-биомаркеров позволило впервые обнаружить активацию синтезов дезоксирибонуклеотидов, ДНК, РНК и белков в органах при введении животным лекарственных веществ с антирадикальными свойствами (ионол и α-токоферол). Установлено, что эта активация является обязательной стадией в механизме протекторного действия этих веществ [26]. Приоритетными являются и данные, позволяющие выявлять и анализировать по динамике пулов плазменных белков Fe³⁺-ТФ и Cu²⁺-ЦП периферической крови изменение резистентности организма крупных животных и человека, что необходимо при проведении клинических испытаний препаратов. Эти тесты использовались нами для выявления метаболических изменений у лиц, работающих на радиационно опасных объектах, и у населения, в том числе у детей от облученных родителей, проживающих на загрязненных радио-нуклидами территориях [28–30, 32]. Впервые нами были разработаны и апробированы критерии отбора и формирования групп лиц с повышенной исходной индивидуальной резистентностью для проведения работ в условиях радиационного и химического риска. Несомненно, методы анализа индивидуальной чувствительности к воздействию γ-радиации еще требуют продолжения поиска, многое из феноменологического описания следует рассматривать как начало нового объекта дальнейших актуальных исследований [31].

В ходе биофизических исследований постепенно решается задача поисков ЭПР-маркеров периферической крови, позволяющих судить об изменении индивидуальной радиорезистентности организма. Это открывает практические перспективы целенаправленного выбора физиологически активных соединений, повышающих устойчивость организма к действию ДНК-тропных агентов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате аналитического обобщения фактического материала и выводов об индуцированном облучением мутагенезе как причине начала метаболико-физиологических реакций сложились представления о вероятностном характере возникновения спектра повреждений важнейших систем жизнеобеспечения. В условиях повышенного уровня непостоянства генома, возрастания частоты мутаций в соматических клетках можно прогнозировать возникновение отдаленных эффектов ионизирующих излучений и в последующих поколениях облученных клеток. В междисциплинарном исследовании ЭПР-технологии позволили обосновать, в рамках нашей задачи, биодозиметрические подходы на основе анализа закономерностей развития SOS-реакции клеток тканей и органов в ответ на γ-облучение.

Фундаментальные исследования in vitro и на организменном уровне выявили сложный и нетривиальный характер молекулярно-клеточного SOS-ответа системы репарационного синтеза ДНК, обеспечивающего раннее и интенсивное развитие типичного радиоадаптивного ответа организма. Анализ физико-химических механизмов и количественное обоснование специализированных ЭПР-баз данных из радиобиологических опытов позволили выработать систему взглядов на природу организменного SOS-ответа на повреждающие воздействия. Эксперименты показали, что существует взаимосвязь и взаимозависимость фенотипических молекулярно-клеточных характеристик, обеспечивающих и сохраняющих стохастический результат жизнеобеспечения.

На новом этапе накопления фактов открываются перспективы изучения природы и количественных интерпретаций физико-химических механизмов репарации лучевых повреждений, возможности их модификации и повышения жизнеспособности облученного организма. Несомненно, свободнорадикальный фермент RR активно участвует в клеточном SOS-ответе системы de novo синтеза dNTP и играет ключевую роль в реакциях систем репликации и репарации ДНК, РНК и белков на действие γ-радиации. Экспериментально подтверждено, что дисбаланс скоростей синтеза ДНК и белка, как и дисбаланс нуклеотидов, усугубляют ошибки репликации и репарации ДНК. Именно объективным результатом SOS-ответов и, в том числе, последствиями дисбаланса пулов нуклеотидов являются факты возрастания частоты генных мутаций и мутаций хромосом при действии экопатогенных факторов. Существенно, что по величине SOS-ответа и последующей динамике адаптивных молекулярно-клеточных реакций можно судить о силе действующих стресс-агентов различной природы и, применяя модификаторы и протекторы, влиять на SOS-реакцию. Удовлетворительным результатом экспериментов является вывод: пулы Fe³⁺-ТФ и Cu²⁺-ЦП в периферической крови могут быть использованы в качестве высокочувствительных маркеров действия генотоксических агентов.

Биофизический подход к анализу фактов о природе фенотипических радиогенных повреждений дает возможность судить о характере и степени возникающих физиологических изменений в индивидуальном облученном организме. Удается тестировать развитие процессов во времени в зависимости от исходного состояния организма и осуществлять количественный контроль молекулярно-клеточных результатов радиационных воздействий. Фазные изменения определяемых ЭПР-показателей их сопоставление и качественное соответствие с цитогенетическими характеристиками способствуют прогностическому пониманию и оценке стохастически возникающих радиогенных повреждений метаболизма, достигающих уровня необратимых, в условиях использования высоких доз γ-облучения. Можно предполагать, что в условиях влияния разнообразных экопатогенных факторов среды обитания живых систем существует базисный универсальный механизм SOS-ответа, сформировавшийся как “высшая реальность” у млекопитающих в результате эволюционного развития.

Согласно развиваемой концепции, именно мобилизацией природного компенсаторного цитогенетического механизма может быть обусловлена репарация лучевых повреждений и, в том числе, закономерное увеличение вероятности мутаций в условиях γ-облучения. Предлагаемая концепция требует дальнейшего анализа и конкретного наполнения динамического SOS-ответа количественными оценками внутриклеточных сдвигов энергетического метаболизма, классификации “качества” процессов репаративного синтеза ДНК, новыми молекулярными критериями радиационных повреждений (системными по значению) и совокупных характеристик индивидуальных реакций фенотипа в экстремальных условиях. Это означает, что на первое место выходит признание важности и необходимости фундаментальных идей и, в том числе, изучения фактов и понимания критериев эпигенетических изменений в системе наследственности в условиях внешней среды.

Результаты аналитического обзора убеждают в необходимости современного изучения и понимания фундаментальных механизмов клеточного гомеостаза, обеспечивающего стабильность живых систем в условиях загрязнения биосферы. Упреждающий эффект мутаций с выраженными фенотипическими проявлениями, обеспечивающий защитный потенциал, может заключаться в активации процессов репарации в митохондриальной RR и способствовать выживанию организма без существенных повреждений генома. Аппарат SOS-репарации и мутагенеза в организме под воздействием радиации в малых дозах может содействовать привлечению стресс-индуцированных репарационных ферментов к поврежденным участкам ДНК и временно поднять частоту мутаций именно в генах репарации [27, 31, 37].

Использование современного эмпирического знания недостаточно для понимания сути сложного защитного явления в его реальной природной самонастраивающейся биологической завершенности. Однако, на основе исследовательских фактов об эффектах целого ряда радиомодифицирующих соединений, была установлена возможность расширить перспективы поиска новых антиканцерогенных, антирадикальных, антиоксидантных и противолучевых средств в биомедицинских экспериментах и в клинике. Результаты работы могут оказаться необходимыми для будущего достижения цели познать роль SOS-репарационных реакций повреждений ДНК, обеспечивающих вероятностный характер выживания индивидуальных млекопитающих в экстремальных для организма условиях [38, 39].

Метод ЭПР оказался абсолютно необходим в междисциплинарном комплексе для научного рассмотрения и адекватной оценки возможностей и причин возникновения генных мутаций из-за дисбаланса пулов dNTP в тканях кроветворных органов в условиях острого облучения в опытах на крупных млекопитающих (собаки) и мониторинга разновозрастных когорт детского населения из регионов радионуклидного загрязнения. Неоднозначность анализа интегральных процессов и интерпретаций их механизмов, тем не менее, имеют смысл как попытка судить о феномене радиорезистентности организма и стратегии его выживания в условиях не только радиационного фона Земли, но и околоземного пространства.

Для ретроспективной биодозиметрии все большее значение приобретает возможность количественного мультикомпонентного анализа повреждений ДНК и продуктов ее деградации; нарушение нуклеотидного обмена и систем репарации _МТДНК; комплексная оценка экспрессии отдельных конкретных генов; регистрация метилирования ДНК и индукции микроРНК; оценка совокупности параметров, характеризующих антиоксидантный статус организма, и степени дестабилизации иммунной системы; наличие закономерного функционального сдвига к апоптозу у поврежденных клеток. Очевидно, что это и есть будущие системные эмпирические факты, позволяющие выстраивать определенную цепочку логических заключений, отражающих влияние условий окружающей среды, запускающих мутагенез и обеспечивающих адаптацию к факторам стресса.

Эмпирическое обобщение дает основание предположить существование “высшей реальности” – базисного универсального адаптивного защитного SOS-ответа на экстремальные экопатогенные факторы, сформировавшегося в результате эволюционной парадигмы сложной системы живой жизни. Необходимость использовать механизм целенаправленного выживания на основе собственного гомеостаза определяет для организма жесткий выбор: среди множества критериев его жизнеобеспечения следует ограничиться рамками экологического императива. Для организма стратегическим приоритетом является выбор эффективных режимов системной регуляции и адекватного уровня управления репликацией и репарацией ДНК. В рамках этого понимания предстоит выяснить функциональную взаимосвязь возникающей мутационной нагрузки и адекватного репарационного SOS-ответа, обеспечивающего повышение резистентности и жизнеспособности организма в условиях экстремальной экопатогенной нагрузки. Результаты работы свидетельствуют о необходимости научного и практического контроля биофизико-генетических механизмов для анализа и понимания сути фенотипических молекулярно-клеточных характеристик и, в том числе, интерпретации и возможного повышения эффективности индуцированных SOS-реакций систем репарации ДНК в условиях действия экофакторов различной природы.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Работа выполнена за счет субсидии, выделенной ФИЦ ХФ РАН на выполнение государственного задания № 48.19, тема 0082-2019-0015 “Изучение принципов структурно-функциональной организации биомолекулярных систем, разработка методов дизайна их физико-химических аналогов и создание на этой основе биологически активных препаратов нового поколения”, № АААА-А20-120031490003-7.