1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Прикладная биохимия и микробиология
  4. T. 58, № 6, 2022

Прикладная биохимия и микробиология, 2022, T. 58, № 6, стр. 598-606

Термостабильность нуклеозидфосфорилаз из прокариот. I. Роль первичной структуры n-концевого фрагмента белка в термостабильности уридинфосфорилаз

В. П. Вейко 1, 2, *, А. Н. Антипов 1, Н. Н. Мордкович 1, Н. А. Окорокова 1, Т. Н. Сафонова 1, К. М. Поляков 3

1 Институт биохимии им. А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр “Фундаментальные основы биотехнологии” Российской академии наук
119071 Москва, Россия

2 Медико-генетический научный центр им. академика Н.П. Бочкова
115522 Москва, Россия

3 Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук
119991 Москва, Россия

* E-mail: vladveiko@yahoo.com

Поступила в редакцию 09.06.2022
После доработки 23.06.2022
Принята к публикации 04.07.2022

Полный текст (PDF)

Аннотация

Методом сайт-направленного мутагенеза сконструированы мутантные гены уридинфосфорилазы (SoUDP) из Shewanella oneidensis MR-1 и на основе клеток Escherichia coli получены штаммы-продуценты соответствующих рекомбинантных (F5I и F5G) белков. Белки очищены и изучены их физико-химические и ферментативные свойства. Показано, что N-концевой фрагмент уридинфосфорилазы выполняет важную роль в термостабилизации фермента в целом. Выявлена роль аминокислотного остатка фенилаланина (F5) в формировании термотолерантности уридинфосфорилаз из гамма-протеобактерий.

Ключевые слова: нуклеозидфосфорилаза, сайт-направленный мутагенез, термостабильность, Shewanella oneidensis MR-1

Термостабильность белковых структур подразумевает сохранение способности к неискаженному выполнению их основных природных функций при повышенных (часто непермиссивных для организма или микроорганизма-хозяина) температурах. В случае ферментов, этим функциональным признаком является сохранение структуры его активного центра в неизменном (в пределах допустимого для проявления функциональной активности) виде или способности к быстрому восстановлению белком своей ферментативной активности при возвращении его в “стандартные” буферные, субстратные и температурные условия. Следует отметить, что термостабильность ферментов не всегда сопровождается значительным увеличением температурного оптимума (Топт) функционирования этих белков [1]. Более того, само значение Топт не может служить надежным признаком, указывающим на термостабильность самой белковой молекулы в целом [1, 2]. В цитируемых работах справедливо утверждается, что в настоящее время развитие математических методов надежного предсказания Топт и термостабильности существенно лимитируется отсутствием данных о свойствах мутантных форм одного и того же класса белков.

Действительно, если кратко суммировать расчетные методические подходы к исследованиям термостабильности белков, то можно выделить следующие направления, в числе которых, безусловно, доминируют чисто теоретические:

– разработка компьютерных алгоритмов, анализирующих, в аспекте термостабильности, гидрофобные и электростатические взаимодействия как в самих белках, так и взаимодействия белка с компонентами буферных систем, в которых они находятся [3–6];

– создание компьютерных алгоритмов, анализирующих физико-химические причины проявления термостабильности у белков [7, 8];

– сравнение первичных структур белков из мезофильных и термофильных микроорганизмов с целью определения закономерностей формирования термостабильных белковых структур [9–11] и роли в этом процессе отдельных аминокислотных остатков.

Обозначенные выше подходы математического анализа белковых структур с целью предсказания и искусственного повышения их термостабильности достаточно полно представлены в обзорах [11–16].

Однако предсказательный потенциал этих алгоритмов всякий раз необходимо проверять с помощью широкого спектра достаточно трудоемких экспериментальных подходов (включая и сравнительный рентгеноструктурный анализ исходных и мутантных форм белков), что приводит к определенным ограничениям этой важной информации в научной литературе. В связи с вышеуказанным, для исследования принципов формирования термостабильных белков важно выбрать полипептиды одного класса и, с помощью введения отдельных аминокислотных замен (точечные мутации) или протяженных белковых фрагментов (гибридные белки), выявить вклад этих изменений в придании белкам устойчивости к температурному воздействию.

В качестве таких белков в данном исследовании были выбраны нуклеозидфосфорилазы (NP) – ферменты катаболизма нуклеозидов, осуществляющие фосфоролиз нуклеозидов до рибозо-(дезоксирибозо)-1-фосфата и соответствующего гетероциклического основания [17]. NP обнаруживаются в клетках практически всех организмов и являются объектом достаточно пристального внимания исследователей что обусловлено, по крайней мере, двумя причинами:

– выяснением роли этих ферментов в генезисе, развитии и протекании различных патологических процессов в клетках млекопитающих (онкология, ревматоидный артрит, подагра, остеоартроз, системная склеродермия и др.) [18–22];

– высоким биотехнологическим потенциалом NP при ферментативном синтезе производных нуклеозидов, применяющихся в практической медицине (противоопухолевые и противовирусные агенты, ингибиторы репликации клеточной ДНК и т.д.) [23–28].

В настоящее время клонировано множество генов NP из различных (включая и экстремофильные) прокариотических микроорганизмов, определены их первичные и пространственные структуры, а также исследованы ферментативные и физико-химические свойства соответствующих белков [29–37].

Этот факт открывает новые возможности в систематическом анализе полученных ранее экспериментальных данных при выяснении роли отдельных аминокислотных остатков (а.о.) и протяженных участков полипептидной цепи как в функционировании самих ферментов, так и формировании признака термотолерантности у этого класса белков.

Цель работы – исследование роли N-концевой части белка и, в частности, высоконсервативного остатка фенилаланина (F5) у уридинфосфорилаз из мезофильных микроорганизмов в формировании термостабильных форм этих ферментов.

МЕТОДИКА

В работе использовали: трис-гидрохлорид (трис-HCl), трис-основание (трис-OH), ДДС-Na, агарозу (Type I, Low EEO), ЭДТА, борную кислоту – (“Sigma”, США), бромистый этидий, аммония персульфат, N, N, N', N'-тетраметилэтилендиамин – “Fluka” (Швейцария). N,N'-метилен-бис-акрилиамид, акриламид – “Serva” (Германия), триптон , агар-агар и дрожжевой экстракт “Bacto” – “Difco” (США), ампициллин (“Appli-Chem”, Германия). Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dNTP) и белковые маркеры молекулярной массы “Unstained Protein Molecular Weight Marker” фирмы “MBI Fermentas” (Литва). Неорганические соли – фирмы “Merck” (Германия), а также реактивы квалификации х. ч. и о. с. ч. (Россия).

Выделение ДНК, очистку, гидролиз эндонуклеазами рестрикции, лигирование фрагментов ДНК, а также трансформацию клеток E. coli плазмидами проводили согласно [38].

Taq-полимеразу и ДНК-лигазу фага Т4 производства “MBI Fermentas” (Литва) использовали в соответствии с рекомендациями фирм-производителей.

Штаммы E. coli JM110 и С600ΔudpRecA-(thi thrB leuB lacY supE tonA recA Tn10) предоставлены Всероссийской коллекцией промышленных микроорганизмов (НИЦ “Курчатовский институт”-ГосНИИгенетика”, Россия).

Источником рекомбинантной SoUDP из S. oneidensis MR-1 служил полученный нами ранее штамм-продуцент этого фермента [39].

При конструировании мутантных форм гена udp в качестве матричной ДНК использовали бактериальный вектор pSUDP [39], содержащий в своем составе полноразмерный ген udp из S. oneidensis MR-1. После проведения, согласно [40–42], сайт-направленного мутагенеза, гены мутантных форм udp клонировали в составе плазмидного вектора pTZ57R/T (“Thermo Scientific”, Литва).

Синтез олигодезоксирибонуклеотидов и сиквенс ДНК проводился фирмой “Синтол” (Россия) на коммерческой основе. Структуры использованных в работе олигодезоксирибонуклеотидов приведены в табл. 1.

Таблица 1.

Структуры синтетических олигодезоксирибонуклеотидов

Наименование Структура
5'—3' 		Функция
F5Ipr ATGGCTGATGTAATTCATTTAGG Замена F5I в SoUDP
F5Irev CCTAAATGAATTACATCAGCCAT
F5Gpr ATGGCTGATGTAGGCCATTTAGG Замена F5G в SoUDP
F5Grev CCTAAATGGCCTACATCAGCCAT
Shud1 TATAGAGCTCTGGCGTACTCCTTGTCGTC Амплификация
фрагментов ДНК при мутагенезе
Shud2 TATAGTCGACTTACGCGAGTAATTTCTTAGCT

Полимеразную цепную реакцию проводили в амплификаторе “Eppendorf Mastercycler gradient” (“Eppendorf”, Германия).

Выделение плазмид проводили с использованием набора “GeneJet™ Plasmid Miniprep Kit” (“MBI Fermentas”, Литва).

Клетки E. coli, содержащие плазмиду, культивировали в течение 16–18 ч в стеклянных пробирках (или колбах) со средой LB (ампициллин – 150 мкг/мл) при 37°С и 250 об./мин в шейкере-инкубаторе “Excella E25” (“New Brunswick Scientific”, США).

Выделение и очистку рекомбинантных NP и их мутантных форм проводили, как описано нами ранее для SoUDP [39].

Электрофоретическое разделение белков проводили согласно Леммли [43].

Концентрацию белка определяли по методу Бредфорда [44] с окраской реагентом “Bio-Rad Protein Assay” (“Bio-Rad”, США). В качестве стандарта использовали раствор бычьего сывороточного альбумина (“Sigma”, США).

Ферментативную активность рекомбинантных SoUDP и ее мутантных форм определяли в К-фосфатном буфере согласно [45, 46].

Численное значение констант Михаэлиса (KМ) по уридину и неорганическому фосфату определяли как описано ранее [42].

Термостабильность белков определяли согласно [1, 47]. В качестве показателя термостабильности использовали Т50 – значение температуры, при которой наблюдали 50%-ное снижение ферментативной активности белка при указанной температуре [48].

Четвертичную структуру рекомбинантных NP подтверждали методом аналитической гель-фильтрации на колонке Tricorn 10/300 c сорбентом Superdex 200 с использованием прибора AKTA FPLC (“GE Healthcare”, Великобритания) как описано ранее [42]. В качестве белков-маркеров использовали набор “Gel Filtration Calibration Kits” (GE Healthcare Life Sciences”, Великобритания), а также рекомбинантную SoUDP из S. oneidensis MR-1 [39].

Первичную структуру выделенных рекомбинантных белков дополнительно подтверждали методом MALDI-TOF/TOF-масс-спектрометрического анализа их триптических гидролизатов.

Построение пространственных структур осуществляли с использованием программы PyMol (www.pymol.org).

Статистическую обработку результатов серии измерений проводили с использованием программы StatPlus2007 (http://analystsoft.com).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование природы формирования термостабильных белков в настоящее время является одним из наиболее актуальных направлений белковой инженерии, что обусловлено как стремлением выяснить молекулярные основы формирования и функционирования термотолерантных белков, так и практической целью – применением ферментов для биокатализа при синтезе [32, 49] различных органических соединений (“зеленая химия”), включая и модифицированные нуклеозиды [23, 24, 37, 50]. Использование ферментативного синтеза этих соединений имеет ряд преимуществ по сравнению с химическим вариантом их получения: практически полное исключение токсичных органических реагентов и растворителей, а также высокий уровень стерео- и регио-селективности. Последнее практически недостижимо при химическом синтезе и существенно затрудняет выделение целевого изомера из реакционной смеси.

Для увеличения растворимости исходных соединений и повышения выхода целевого вещества часто требуется проведение ферментативного синтеза при повышенной температуре [28, 51]. Соответственно, сам белок-катализатор должен быть устойчив к воздействию повышенной температуры, что может быть достигнуто внесением в структуру белка-катализатора множественных или точечных аминокислотных замен, улучшающих или даже меняющих его субстратную специфичность [52], а также повышающих его термостабильность [1, 5, 36, 48, 53].

Сравнительный анализ первичных структур UDP из различных микроорганизмов (рис. 1), опирающийся на выравнивание по функциональным участкам, например, PGDP – часть фосфат-связывающего сайта [1, 54] фермента, показал, что в первичной структуре уридинфосфорилаз обнаруживается инвариантный остаток гистидина, принимающий участие в формировании активного центра фермента [54–56]. Этот остаток локализуется в составе малоструктурированного N-концевого участка полипептидной цепи (рис. 1, рис. 2), которому предшествует также инвариантный у уридинфосфорилаз из мезофилов остаток фенилаланина (рис. 1а, рис. 2). Ранее была исследована роль остатка гистидина (H8) в функционировании UDP из E. coli и было обнаружено, что замена H8N практически полностью отменяла ферментативную активность этого белка [55]. Эти данные во многом были подтверждены в работе [56].

Рис. 1.

Функциональное выравнивание первичных структур N-концевых частей уридинфосфорилаз из различных микроорганизмов. Желтым цветом выделен фрагмент полипептидной цепи, принимающий участие в формировании сайта связывания иона неорганического фосфата [1, 42], а красным – инвариантные аминокислотные остатки FH и YH у уридинфосфорилаз из мезофильных (а) и термофильных (б) микроорганизмов соответственно. (*Термофильные микроорганизмы).

Рис. 2.

Совмещение пространственных структур (субъединица А) мономеров UDP (а) из S. oneidensis MR-1 (ID PDB: 4R2W, зеленый цвет), E. coli (ID PDB: 1RXS, красный цвет), S. typhimurium (ID PDB: 1SJ9, бирюзовый цвет). Для ферментов приведены значения времени (Т50) их термальной полуинактивации [1]. Pi – ион неорганического фосфата в активном центре фермента. Увеличенное представление пространственного расположения остатков фенилаланина (б). Стрелками указаны взаимные расстояния боковых радикалов.

К сожалению, в настоящее время в научной литературе практически отсутствуют данные по пространственной организации уридинфосфорилаз из термофильных микроорганизмов, что затрудняет прямой сравнительный кристаллографический анализ структур этих белков в ряду мезофилы – термофилы. Однако, если предположить общность строения активных центров у нуклеозидфосфорилаз [42, 56], то инвариантный остаток гистидина UDP из термофилов (рис. 1б) также может выполнять функцию связывания углеводного остатка нуклеозида в активном центре фермента. Обращает на себя внимание, что в UDP из термофильных микроорганизмов этому остатку (рис. 1б) предшествует существенно более протяженный, по сравнению с уидинфосфорилазами из мезофилов, N-концевой фрагмент полипептидной цепи.

Этот фрагмент может вносить значительную роль в стабилизацию вторичной структуры N-концевого участка полипептидной цепи UDP, обеспечивая устойчивое и наиболее благоприятное для катализа конформационное состояние рассматриваемого остатка гистидина. Такая своеобразная “защитная” функция этого фрагмента полипептидной цепи может проявляться и в повышенной устойчивости уридинфосфорилаз из термофилов при температурном воздействии на них.

Сравнительный анализ первичных структур N-концевых частей UDP из мезофильных и термофильных микроорганизмов (рис. 1) также показывает, что рассматриваемому остатку гистидина у мезофилов предшествует остаток фенилаланина, в то время как у термофилов – остаток тирозина. Учитывая большую гидрофильность остатка тирозина по сравнению с остатком фенилаланина, а также его расположение в непосредственной близости к функционально важному остатку гистидина, можно предположить существенную роль именно этого остатка в придании уридинфосфорилазам термальной устойчивости. Следует также отметить, что, по результатам анализа, проведенном в работе [9], поверхность белков из термофильных микроорганизмов в большей степени, по сравнению с мезофилами, обогащена именно заряженными аминокислотными остатками. Эти данные также привлекали внимание к рассматриваемому гидрофобному остатку фенилаланина, расположенному на поверхности уридинфосфорилаз и осуществляющему прямой контакт с окружающим белок раствором (ID PDB: 4R2W, 1RXS, 1SJ9, 6EYP, 4NY1 и др.).

Высказанные выше предположения о роли структуры N-концевых частей UDP в термальной стабилизации во многом основываются и на ранее полученных и исследованных авторами нуклеозидфосфорилазах, в которых проводились точечные и протяженные аминокислотные замены в составе этого класса гомологичных белков [1, 41]. Анализ суммарных результатов, приведенных в цитируемых работах, показал, что именно структура N-концевых частей нуклеозидфосфорилаз является одним из факторов, во многом определяющим термальную устойчивость у этого класса ферментов.

Кроме того, в работе [1] было обнаружено, что термостабильность (Т50) нативных уридинфосфорилаз изменяется в ряду S. typhimurium $ \gg $ E. coli > > S. oneidensis MR-1. В настоящее время известны рентгеноструктурные данные кристаллических форм указанных UDP, что позволило провести сравнительный анализ их пространственных структур (рис. 2).

Обращает на себя внимание (рис. 2) существенное различие в пространственном расположении остатка фенилаланина в составе N-концевых частей рассматриваемых нуклеозидфосфорилаз. Такого рода локальные изменения расположения остатка фенилаланина могут сказываться на свойствах белка в растворе, в том числе и его термостабильности, что достаточно убедительно отмечалось в обзорной работе [57]. В случае уридинфосфорилаз прослеживается определенная корреляция удельной активности [42] и термостабильности [1] этих ферментов в зависимости от первичной структуры анализируемого фрагмента полипептидной цепи белков (рис. 2).

Вышеуказанный анализ литературных данных предопределил необходимость экспериментального исследования, на примере UDP из S. oneidensis MR-1, роли остатка фенилаланина (F5) в термостабилизации бактериальных уридинфосфорилаз.

С этой целью в структурной части гена уридинфосфорилазы из S. oneidensis MR-1 методом сайт-направленного мутагенеза [42] с использованием синтетических праймеров (табл. 1) была произведена замена кодона фенилаланина (F5) на кодоны глицина (F5G) и изолейцина (F5I). Выбор типа замещающих аминокислотных остатков был предопределен следующими причинами: остаток изолейцина обладает относительно гидрофобным боковым радикалом, частично моделирующим свойства остатка фенилаланина, несущего ароматический боковой радикал, в то время как остаток глицина вообще лишен бокового радикала.

Полученные мутантные формы гена udp были клонированы в составе вектора pTZ57R/T (“Thermo Scientific”, Литва) и нуклеотидную последовательность целевых генов подтверждали сиквенсом. Рекомбинантными плазмидами были трансформированы клетки E. coli C600Δudp (см. “Методика”). Оценку накопления мутантных форм UDP проводили с помощью денатурирующего полиакриламидного гель-электрофореза (рис. 3).

Рис. 3.

Электрофоретический анализ рекомбинантных белков в клетках E. coli C600Δudp в 12.5%-ном ПААГ с ДСН-Na. М – маркеры молекулярной массы белков (116, 66, 45, 35, 27, 18 кДа); 1, 2, 5, 6 – белки растворимых фракций штамма-реципиента и штаммов-продуцентов, полученные после разрушения ультразвуком клеток E. сoli; 3, 4, 7, 8 – очищенные рекомбинантные ферменты: F5I, F5G, 3 и 5 мкг соответственно; 9 – SoUDP из S. oneidensis MR-1, 5 мкг. Целевые рекомбинантные белки обозначены стрелкой.

Из рис. 3 следует, что целевые мутантные формы SoUDP в условиях гетерологичной экспрессии накапливаются в клетках E. coli в значительном количестве: на электрофорезе они представлены в виде мажорной полосы с примерной молекулярной массой 27.5 кДа. Мутантные формы SoUDP выделяли и очищали согласно [39], после чего с помощью ультрафильтрации (мембрана PM30, “Millipore”, США) переводили в 5.0 мМ раствор Трис-HCl, рН 8.0 и хранили при –70°С.

В настоящее время в литературе опубликованы данные по изучению свойств ряда нуклеозидфосфорилаз, включая их термостабильные и мутантные формы [1, 36, 37, 58].

Исследование термостабильности этих белков проводили с использованием не только различных буферных систем, но и часто в присутствии хотя бы одного (например, неорганический фосфат) из субстратов [58, 59]. Однако ранее было показано [1, 60], что в присутствии субстратов происходит термостабилизация нуклеозидфосфорилаз. Более того, присутствие чужеродного белка (например, БСА [60]), также повышает устойчивость нуклеозидфосфорилаз к температурному воздействию. При этом эффективность такой стабилизации малопрогнозируема как для исходной формы исследуемых белков, так и мутантов на их основе. Отдельные аспекты конформационных изменений в бактериальных уридинфосфорилазах при связывании с субстратами описаны нами ранее в работе [61]. Чтобы исключить влияние субстрата на термостабилизацию исследуемых SoUDP и ее мутантных форм (рис. 4) в настоящей работе ферменты инкубировали аналогично [1, 62] в 20 мM Трис-HCl буфере, pH 8.0.

Рис. 4.

Сравнительный анализ термостабильности уридинфосфорилазы (%) из S. oneidensis MR-1 (SoUDP) и ее мутантных (F5G и F5I) форм. Каждая точка на графике соответствует среднему значению трех независимых экспериментов.

Приведенные на рис. 2 и 4 результаты свидетельствуют о том, что пространственное расположение бокового радикала остатка фенилаланина может влиять на конформацию малоструктурированного N-концевого участка в целом, вследствие чего, вероятно, изменяется его доступность для окружающего белок буфера, что и выражается в повышении термостабильности рекомбинантных мутантных форм исследуемой SoUDP. При этом конформационные изменения N-концевого фрагмента могут быть и незначительными, но при этом оказывать существенное влияние на устойчивость белка к термальному воздействию [32, 57].

Четвертичная структура ряда ферментов, включая и нуклеозидфосфорилазы, представлена в растворе в виде гомоолигомеров (димеры, тримеры, гексамеры). Такого рода олигомеризация важна не только для проявления ферментативной активности этих белков, но и для увеличения их термостабильности [6, 63, 64]. В связи с этим, методом аналитической гель-фильтрации было экспериментально подтверждено сохранение мутантными формами SoUDP гексамерной четвертичной структуры (табл. 2).

Таблица 2.

Сравнительная характеристика свойств SoUDP и ее мутантных форм

Белок Tопт., °С T50, 50°С,
мин 		T50, 60°С, мин KМ Vвых, мл
Urd, ммоль Pi, ммоль
SoUDP 60 ± 4 240 ± 4 14 ± 2 0.49 ± 0.05 5.5 ± 0.3 13.85 ± 0.05
F5I 58 ± 3 Стабилен
1200 ± 9 		15 ± 3 0.77 ± 0.04 9.3 ± 0.2 14.03 ± 0.04
F5G 61 ± 2 Стабилен
1200 ± 10 		18 ± 2 0.84 ± 0.08 8.9 ± 0.1 13.98 ± 0.06

Обращает на себя внимание (табл. 2) уменьшение сродства (KМ) у мутантных форм уридинфосфорилазы к субстратам по сравнению с исходной формой дикого типа. При этом указанное изменение сопровождалось существенным увеличением термостабильности мутантных белков (табл. 2, рис. 4). Этот факт во многом совпадает со сделанными ранее выводами об определяющей роли архитектурного строения фосфат-связывающей области в приобретении NP термостабильности [1]. В настоящее время получены кристаллические формы исследуемых мутантных белков и проводится их рентгеноструктурный анализ, который может существенно прояснить молекулярную природу наблюдаемого явления.

Таким образом, на основании сравнительного анализа литературных данных и полученных в настоящей работе экспериментальных результатов выявлена важная роль, как отдельного аминокислотного остатка F5, так и в целом N-концевого фрагмента полипептида, в формировании термостабильности у уридинфосфорилаз.

При проведении исследований использовали оборудование Центра коллективного пользования “Промышленные биотехнологии” Федерального исследовательского центра “Фундаментальные основы биотехнологии” Российской академии наук.

Список литературы

  1. Мордкович Н.Н., Антипов А.Н., Окорокова Н.А., Сафонова Т.Н., Поляков К.М., Вейко В.П. // Прикл. биохимия и микробиология. 2020. Т. 56. № 6. С. 577–586.

  2. Pucci F., Dhanani M., Dehouck Y., Rooman M. // PLoS ONE. 2014. V. 9. № 3. e91659.https://doi.org/10.1371/journal.pone.0091659

  3. Xiao L., Honig B. // J. Mol. Biol. 1999. V. 289. № 5. P. 1435–1444.

  4. Zhu S., Elcock A. // J. Chem. Theory Computat. 2010. V. 6. № 4. P. 1293–1306.

  5. Spector S., Wang M., Carp S.A., Robblee J., Hendsch Z.S., Fairman R., Tidor B., Raleigh D.P. // Biochemistry. 2000. V. 39. P. 872–879.

  6. Tanaka Y., Tsumoto K., Yasutake Y., Umetsu M., Yao M., Fukada H., Tanaka I., Kumagai I. // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. № 31. P. 32957–32967.

  7. Seeliger D., De Groot B. // Biophys. J. 2010. V. 98. № 10. P. 2309–2316.

  8. Dehouck Y., Grosfils A., Folch B., Gilis D., Bogaerts P., Rooman M. // Bioinformatics. 2009. V. 25. № 19. P. 2537–2543.

  9. Szilagyi A., Zavodszky P. //Structure. 2000. V. 8. № 5. P. 493–504.

  10. Kumar S., Tsai C., Nussinov R. // Prot. Engineering. 2000. V. 13. № 3. P. 179–191.

  11. Grishin D.V., Pokrovskaya M.V., Podobed O.V., Gladilina J.A., Pokrovsky V.S., Aleksandrova S.S., Sokolov N.N. // Biomed. Khim. 2017. V. 63. № 2. P. 124–131.

  12. Matthews B. //Annu. Rev. Biochem. 1993. V. 62. № 1. P. 139–160.

  13. Scandurra R., Consalvi V., Chiaraluce R., Politi L., Engel P. // Biochimie. 1998. V. 80. № 11. P. 933–941.

  14. Fang X., Huang J., Zhang R., Wang F., Zhang Q., Li G., Yan J., Zhang H., Yan J., Xu L. // J. Chem. Inf. Model. 2019. V. 59. V. 11. P. 4833–4843.

  15. Modarres H.P., Mofrad M.R., Sanati-Nezhad A. // PLos ONE. 2018. V. 13. № 1. e0191222. doi.org:https://doi.org/10.1371/journal.pone.0191222

  16. Xu Z., Cen Y.K., Zou S.P., Xue Y.P., Zheng Y.G. // Crit. Rev. Biotechnol. 2020. V. 40. № 1. P. 83–98.

  17. Hammer-Jespersen K. //Metabolism of Nucleotides, Nucleosides and Nucleobases in Microorganisms / Ed. A. Munch-Petersen London, N.Y., San Francisco: Acad. Press, 1983. P. 203–258.

  18. Liekens S., De Clercq E., Neyts J. //Biochem. Pharmacol. 2001. V. 61. № 3. P. 253–270.

  19. Carmeliet P. //Nature. 2005. V. 438. № 7070. P. 932–936.

  20. Furukawa T., Tabata S., Yamamoto M., Kawahara K., Shinsato Y., Minami K., Shimokawa M., Akiyama S. // Pharmacol. Res. 2018. V. 132. P. 15–20.

  21. Yan R., Wan L., Pizzorno G., Cao D. // Front. Biosci. 2006. V. 11. P. 2759–2766.

  22. Yu E.J., Lee Y., Rha S.Y., Kim T.S., Chung H.C., Oh B.K. et al. // Mol. Cancer Res. 2008. V. 6. № 10. P. 1554–1556.

  23. Михайлопуло И.А., Мирошников А.И. // Acta Naturae. 2010. Т. 2. № 2. С. 38–61.

  24. Gordon G.E.R., Visser D.F., Brady D., Raseroka N., Bode M.L. // J. Biotechnol. 2011. V. 151. № 1. P. 108–113.

  25. Hori N., Watanabe M., Yamazaki Y., Mikami Y. // Agr. Biol. Chem. 1989. V. 53. № 1. P. 197–202.

  26. Luo W., Liu Y., Zhu X., Zhao W., Huang L., Cai J., Xu Z., Cen P. // Enzyme Microb. Tech. 2011. V. 48. № 6–7. P. 438–444.

  27. Zhu S., Ren L., Wang J., Zheng G., Tang P. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2012. V. 22. № 5. P. 2102–2104.

  28. Zhu S., Song D., Gong C., Tang P., Li X., Wang J., Zheng G. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2013. V. 97. P. 6769–6778.

  29. Kumar S., Nussinov R. // Cell. Mol. Life Sci. 2011. V. 58. P. 1216–1233.

  30. Karshikoff A., Ladenshtein R. // Prot. Engineering. 1998. V. 11. № 10. P. 867–872.

  31. Gianese G., Bossa F., Pascarella S. // Proteins. 2002. V. 47. P. 236–249.

  32. Vieille C. Zeikus G.J. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2001. V. 65. P. 1–43.

  33. Brock T.D. // Science. 1967. V. 158. P. 1012–1019.

  34. Trivedi S., Gehlot H.S., Rao S.R. // Gen. Mol. Res.2006. V. 5. № 4. P. 816–827.

  35. Sawle L., Ghosh K. // Biophys. J. 2011. V. 101. P. 217–227.

  36. Visser D.F., Hennessy F., Rashamuse J., Pletschke B., Brady D. // J. Mol. Cat. B: Enzymatic. 2011. V. 68. P. 279–285.

  37. Kamel S., Thiele I., Neubauer P., Wagner S.A. // BBA Prot. Proteom. 2020. V. 1868. № 2. 140304. https://doi.org/10.1016/j.bbapap.2019.140304

  38. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. 545 p.

  39. Мордкович Н.Н., Манувера В.А., Вейко В.П., Дебабов В.Г. // Биотехнология. 2012. № 1. С. 21–30.

  40. Ho S.N., Hunt H.D., Horton R.M., Pullen J.K., Pease L.R. // Gene. 1989. V. 77. № 1. P. 51–59.

  41. Чеботаев Д.В., Гулько Л.Б., Вейко В.П. // Биоорг. химия. 2001. Т. 27. № 3. С. 184–190.

  42. Мордкович Н.Н., Сафонова Т.Н., Антипов А.Н., Манувера В.А., Поляков К.М., Окорокова Н.А., Вейко В.П. // Прикл. биохимия и микробиология. 2018. Т. 54. № 1. С. 16–25.

  43. Laemmli U.K. // Nature. 1970. V. 227. № 5259. P. 680–685.

  44. Bradford M.M. // Anal. Biochem. 1976. V. 2. P. 248–254.

  45. Вейко В.П., Сипрашвили З.З., Ратманова К.И., Гулько Л.Б., Андрюхина Р.В., Дебабов В.Г. // Биотехнология. 1994. № 4. С. 2–4.

  46. Leer J.C., Hammer-Jespersen K., Schwartz M. // Eur. J. Biochem. 1977. V. 75. № 1. P. 217–24.

  47. Cacciapuoti G., Bertoldo C., Brio A., Zappia V., Porcelli M. // Extremophiles. 2003. V. 7. P. 159–168.

  48. Mansfeld J., Vriend G., Dijkstra B.W., Veltman O.R., Van den Burg B., Venema G. et al. // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. № 17. P. 11152–11156.

  49. Straathof A.J.J., Panke S., Schmid A. //Curr. Opin. Biotechnol. 2002. V. 13. № 6. P. 548–556.

  50. Li N., Smith T.J., Zong M.H. // Biotechnol. Adv. 2010. V. 28. № 3. P. 348–366.

  51. Yeoman C.J., Han Y., Dodd D., Schroeder C.M., Mackie R.I., Cann I.K.O. // Adv. Appl. Microbiol. 2010. V. 70. P. 1–55.

  52. Han R., Liu L., Shin H.D., Chen R.R., Li J., Du G., Chend J. // Appl. Environ. Microbiol. 2013. V. 79. № 24. P. 7562–7568.

  53. Reetz M.T., Carballeira J.D., Vogel A. // Angew. Chem. Int. 2006. V. 45. № 46. P. 7745–7751.

  54. Safonova T.N., Mikhailov S.N., Veiko V.P., Mordkovich N.N., Manuvera V.A., Alekseev C.S. et al. // Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 2014. V. 70. № 12. P. 3310–3319.

  55. Вейко В.П., Сипрашвили З.З., Ратманова К.И., Гулько Л.Б. // Биоорган. химия. 1995. Т. 21. № 11. С. 834–837.

  56. Oliva I., Zuffi G., Barile D., Orsini G., Tonon G., De Gioias L., Ghisotti D. // J. Biochem. 2004. V. 135. № 4. P. 495–499.

  57. Koshland E.D. // Nat. Med. 1998. V. 4. № 10. P. 1112–1114.

  58. Szeker K., Zhoua X., Schwab T., Casanuevac A., Cowanc D., Mikhailopulo I.A., Neubauer P. // J. Mol. Cat. B: Enzymatic. 2012. V. 84. P. 27–34.

  59. Liu K., Zhou Y., Zhang J., Chu J., Zhang Y., He B. // Biotechnol. Lett. 2017. V. 39. № 12. P. 1903–1910.

  60. Koszalka G.W., Vanhooke J., Short S.A., Hall W.W. // J. Bacteriol. 1988. V. 170. № 8. P. 3493–3498.

  61. Поляков К.М., Мордкович Н.Н., Сафонова Т.Н., Антипов А.Н., Окорокова Н.А., Дороватовский П.В., Вейко В.П. // Кристаллография. 2021. Т. 66. № 5. С. 759–764.

  62. Saunders P.P., Wilson B.A., Saunders G.F. // J. Biol. Chem.1969. V. 244. № 13. P. 3691–3697.

  63. Ali M.H., Imperiali B. // Bioorg. Med. Chem. 2005. V. 13. № 17. P. 5013–5020.

  64. Bertosa B., Mikleusevic G., Wielgus-Kutrowska B., Narczyk M., Hajnic M., Aster I.L., Tomic S., Luic M., Bzowska A. // FEBS J. 2014. V. 281. P. 1860–1871.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Прикладная биохимия и микробиология

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал