Прикладная биохимия и микробиология, 2022, T. 58, № 2, стр. 195-205

МЕТОДИКА

Материалы. В работе использовали хитозан (Хит, M ~ 30 кДа, степень деацетилирования >90%, “Glentham Life Sciences”, Великобритания), феруловую (M = 194.18 г/моль) и кофейную (M = 180.16 г/моль) кислоты, 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид гидрохлорид (EDC), диаммонийную соль 2,2'-азинобис-3-этилбензтиазолин-6-сульфоновой кислоты (АBTS, “Sigma”, США).

Получение конъюгатов хитозана с оксикоричными кислотами. Конъюгаты хитозана с феруловой (Хит-ФК) и кофейной (Хит-КК) кислотами получали карбодиимидным методом [15].

Феруловую (или кофейную) кислоту (5 мг/мл) и EDC растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО). При этом EDC брали в трехкратном мольном избытке по отношению к ФК (КК). В процессе синтеза соотношение масс Хит : ФК (КК) а составляло 5 : 1. Раствор кислоты по каплям добавляли к раствору EDC и оставляли при перемешивании на магнитной мешалке в темноте на 1 ч. Далее раствор, содержащий активированную кислоту, прибавляли по каплям к раствору Хит в 0.5%-ной уксусной кислоте при постоянном перемешивании на магнитной мешалке и оставляли на 20 ч при комнатной температуре в темноте.

Синтезированные конъюгаты Хит-ФК и Хит-КК очищали диализом (целлюлозные диализные трубки, размер пор 14 кДа, Sigma D9277-100FT и D9652-100FT, “Sigma”, США) против воды в течение 1 сут. Полученные конъюгаты хранили в виде лиофилизатов, полученных на лиофильной сушке Freezone 1.0 (“Labconco”, США) при ‒47.0°С в течение 8 ч и давлении 0.04 мбар.

УФ-спектроскопия. Содержание ФК (КК) в синтезированном конъюгате определяли спектрофотометрически. Для этого снимали спектр поглощения конъюгата в области 200–400 нм и рассчитывали количество ФК и КК по предварительно построенному калибровочному графику. Калибровочный график строили в координатах: оптическая плотность (при λ = 316 нм = f(c), где с – концентрация КК. Спектры поглощения записывали на спектрофлуориметре СМ 2203 (“Solar”, Беларусь) в кварцевой кювете 1 см. Степень модификации Хит ФККК (CR, %) рассчитывали по формуле:

где n_к – количество ФК (КК) в конъюгате, моль; ${{n}_{{{\text{N}}{{{\text{H}}}_{{\text{2}}}}}}}$ – моль мономерных звеньев хитозана, содержащих аминогруппы.

ИК-спектроскопия. ИК-спектры синтезированных образцов записывали в диапазоне 400–4000 см^–1 на ИК-Фурье спектрометре Tensor-27 (“Bruker”, Германия).

Метод динамического светорассеивания. Измерения гидродинамического диаметра и величины ζ-потенциала конъюгатов проводили методом динамического светорассеивания и по их электрофоретической подвижности с помощью анализатора Zetasizer Nano-ZS (“Malvern”, Великобритания). Измерения проводили при комнатной температуре. Образцы предварительно разбавляли в 10 раз дистиллированной водой.

Метод кварцевого микровзвешивания. Закономерности чередующейся адсорбции конъюгатов хитозана с оксикоричными кислотами (Хит-OК) изучали с помощью метода кварцевого микровзвешивания. В работе использовали прибор QCM-D компании “Biolin Scientific” (Швеция).

Тонкие пленки получали методом послойного осаждения полиэлектролитов, в качестве поликатиона использовали конъюгат Хит-ОК, в качестве полианиона – высокометоксилированный пектин.

Измерения проводили одновременно в четырех проточных ячейках. Использовали кварцевые резонаторы с золотым напылением и рабочей частотой 5 МГц. Для снижения влияния шероховатости подложки на поверхность резонатора предварительно наносили подслой синтетических полиэлектролитов: полистиролсульфоната натрия (ПСС) и полиэтиленимина (ПЕИ). Растворы полиэлектролитов с рабочей концентрацией 1 мг/мл пропускали через ячейку со скоростью 150 мкл/мин, время адсорбции каждого слоя 10 мин, промежуточную промывку проводили соответствующим растворителем (дистиллированная вода или 0.15 М NaCl). Для расчета массы (m) адсорбированного слоя использовали уравнение Сауэрбрея: Δm = –CΔF/n,

где C – константа, зависящая от свойств кварцевого кристалла, равная 17.7 нг/см² · Гц для 5 МГц резонатора; ΔF – изменение частоты колебаний до и после адсорбции материала, Гц; n – номер гармоники (1, 3, 5 и т.д.). При расчете толщины слоя (h) плотность покрытий принимали равной 1.1 г/см³.

Атомно-силовая микроскопия. Особенности морфологии мультислойных покрытий исследовали методом атомно-силовой микроскопии (АСМ) с помощью Nanoscope IIID (“Veeco”, США). Шероховатость поверхности (R_ms) рассчитывали по формуле:

где σ – среднеквадратичное отклонение значений высоты на участке поверхности 1 × 1 мкм. Значение R_ms усредняли по 10 участкам поверхности.

Определение антиоксидантной активности. Антиоксидантную активность (АА) полученных материалов определяли спектрофотометрическим методом, регистрируя восстановление катион-радикала АBTS⁺ под действием хитозана и конъюгатов на его основе. Реакционная смесь состояла из 1 мл ABTS•⁺ и 100 мкл исследуемого вещества, разведенного ацетатным буфером рН 4.0.

Антирадикальную активность (АА, %) рассчитывали по формуле:

где А_k – оптическая плотность раствора ABTS•⁺, не содержащего исследуемое вещество; А_х – оптическая плотность реакционной смеси.

Также в работе для количественной оценки ингибиторной эффективности веществ путем линейного регрессионного анализа рассчитывали значение величины ЕC₅₀, т.е. концентрации вещества, при которой количество катион-радикала ABTS•⁺ снижалось в 2 раза.

Влияние конъюгатов на продуктивность и качество продукции растений редиса. Влияние обработки семян редиса конъюгатами Хит-ОК оценивали в условиях полевого опыта в оптимальных и неблагоприятных условиях выращивания. В качестве объектов исследования использовали семена редиса сорт “Жара”, которые обрабатывали конъюгатами в концентрации 10 мкМ. Семена обрабатывали путем их механического перемешивания в 1%-ном водном растворе конъюгатов хитозана с оксикоричными кислотами в объеме 140 мкл на 3 г семян до равномерного распределения раствора по поверхности семян. После обработки семена выдерживали при комнатной температуре в течение 24 ч. Контролем служили необработанные семена. Обработанные и контрольные семена перед закладкой опыта имели одинаковую исходную влажность. Растения редиса выращивали в полевых условиях на экспериментальных делянках в трех биологических повторностях. Солевой стресс создавали внесением в почву хлорида натрия из расчета 500 г соли на 2 м². Качество получаемой продукции оценивали по содержанию нитратов [19] и витамина С [20].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Конъюгаты Хит с КК и ФК были синтезированы карбодиимидным методом. При таком способе синтеза карбоксильные группы ОК активируются при помощи 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида, что делает возможным их связывание с аминогруппами хитозана.

Структура конъюгатов была подтверждена методом УФ-спектроскопии. Так, в спектрах поглощения гидроксикоричных кислот присутствовали пики с максимумом при 285 и 316 нм (рис. 1, 2), спектры поглощения КК и ФК практически совпадали. Для раствора хитозана характерно незначительное поглощение в области 290 нм (рис. 1, 1). В спектрах поглощения синтезированных конъюгатов наблюдались две полосы с максимумом при 295 и 320 нм (рис. 1, 4). Для механических смесей полимера и ОК ожидаемо регистрировались полосы с максимумами, характерными для индивидуальных соединений (рис. 1, 3). Батохромный сдвиг полос поглощения конъюгатов обусловлен, вероятно, уменьшением энергии n → π* и π → π* переходов, поскольку благодаря ковалентной связи между молекулами ОК и Хит происходило формирование более длинной сопряженной системы. Эффект длинноволнового сдвига полос поглощения в УФ-спектрах в случае ковалентного связывания хитозанов с полифенольными соединениями отмечен в ряде работ [21–23]. Рассчитанная степень модификации для Хит-ФК составляла 3.6 ± 0.4%, для Хит-КК – 4.4 ± 1.3%. Массовая доля пришитых ОК равна 42.7 ± 4.8 и 48.4 ± 14.3 мкг/мг хитозана для ФК и КК соответственно. Выход конъюгатов составлял 70.0 ± 10.0 и 81.0 ± 1.0% от теоретического для Хит-ФК и Хит-КК соответственно.

В ИК-спектрах конъюгатов Хит-КК и Хит-ФК по сравнению с исходным Хит появлялась интенсивная полоса поглощения при 1551 см^–1, обусловленная деформационными колебаниями аминогруппы (амид II) вторичных амидов (рис. 2). Также в спектрах конъюгатов наблюдался сдвиг максимума полосы колебаний карбонила с 1645 до 1638 см^–1 и уменьшение интенсивности частоты колебаний протонированных NH₂-групп Хит при 1423 см^–1. Эти изменения в ИК-спектрах свидетельствовали о формировании ковалентной связи между карбоксильной группой кислоты и аминогруппой хитозана.

Кроме того, в спектрах конъюгатов наблюдался сдвиг (∆ ~ 7 см^–1) в коротковолновую область максимума полосы скелетных колебаний С–О–С-связей глюкопиранозного кольца при 1083 см^–1. При этом гликозидная связь не затрагивалась: полоса ассиметричных колебаний С–О–С при 1154 см^–1 не изменялась. Это подтвердило, что ковалентное связывание происходило с участием боковых аминогрупп кольца полимера, что, вероятно, приводило и к изменению его конформации. Так, в ИК-спектре конъюгатов по сравнению с исходным Хит наблюдался сдвиг (∆ ~ 3 см^–1) в длинноволновую область максимума полосы при 895 см^–1, которая обусловлена колебаниями глюкопиранозного кольца. Это согласуется с данными, полученными методом динамического светорассеяния: введение ОК в структуру Хит приводило к конформационным изменениям полимера за счет формирования новых межмолекулярных взаимодействий с гидрофобным фрагментами ОК.

Макромолекулы исходного хитозана заряжены положительно, значение ξ-потенциала составляет 28.2 ± 0.1 мВ. Заряд поверхности обусловлен протонированными аминогруппами полимера. Гидродинамический диаметр молекулы Хит при оценке методом динамического рассеяния света, равен 66.4 ± 14.2 нм. Гидродинамический диаметр конъюгатов Хит-ОК по сравнению с исходным полимером увеличивался в 6–8 раз, а значение дзета-потенциала – в 1.3 раза и составляло ~40 мВ (табл. 1). Столь существенное различие значения D_H обусловлено гидрофобностью фенольных соединений и их низкой растворимостью в водных растворах, поэтому введение ОК в структуру полимера может приводить к изменению конформации его макромолекул и разрыхлению полимерного клубка. При сравнении значений D_H конъюгатов Хит-ОК существенного различия не наблюдалось. Энергия сольватации ФК в воде на порядок выше по сравнению с КК [24], однако молекулы имеют сопоставимую гидрофобность. Так, согласно данным авторов [24] площадь гидрофобного фрагмента по отношению ко всей молекуле составляет 55 и 62% для КК и ФК соответственно. Также при проведении компьютерного моделирования взаимодействия ОК с Хит показано [24], что в случае молекул КК и ФК связывание с полимером протекает по одинаковым участкам и молекулы претерпевают сходные конформационные изменения. Эти изменения приводят к росту электрокинетического потенциала конъюгатов по сравнению с исходным полимером, что указывает на увеличение агрегативной стабильности хитозана, модифицированного ОК. Таким образом, в результате конъюгирования Хит с КК и ФК происходило изменение конформации полимерной цепи полисахарида и формирование новой системы водородных связей, что приводило к увеличению гидродинамического диаметра и электрокинетического потенциала Хит.

Для оценки антиоксидантной активности в качестве характерного показателя использовали степень восстановления катион-радикала ABTS•⁺ за определенный временной интервал. Значение показателя отражает долю, на которую снижается концентрация свободных радикалов в системе под действием антиоксиданта. Для КК и ФК значения величины EC₅₀ составляли 19.4 и 11.9 мкг/мл соответственно. Эти значения согласуются с теоретическими расчетами по АА, приведенными в литературе. Tак, рассчитанный авторами [25, 26] потенциал ионизации (отражающий восстановительную активность соединения – его способность легко отдавать электрон) для ФК несколько выше, чем для КК. Кроме того, экспериментальные данные тех же авторов позволили установить, что наличие двух гидроксильных групп в м- и п-положениях КК значительно понижает ЕC₅₀ по сравнению с кумаровыми кислотами, имеющими всего одну гидроксогруппу. В то время как для ФК, которая имеет одну гидроксильную и одну метоксильную группу, авторы регистрировали большую АА (степень ингибирования ABTS⁺ радикала) по сравнению с КК [25, 27]. В то же время при оценке АА методом циклической вольтамперометрии авторы установили, что меньший потенциал анодного пика, а значит и способность быстрее отдавать электрон, характерна для КК 265 мВ, по сравнению с феруловой (470 мВ) [13]. Однако стоит учитывать, что в настоящей работе измерения АА проводились при рН 4.0, и в таких условиях происходит протонирование гидроксилов и карбонилов ОК, уменьшение отрицательного заряда молекулы, что усложняет отрыв электрона от молекулы и, в конечном счете, приводит к уменьшению антирадикальной активности антиоксиданта. С учетом строения используемых в работе ОК снижение рН оказывало большее влияние на АА КК (две –OH группы и одна COOH) по сравнению с ФК (один карбоксил и одна гидроксигруппа).

Для Хит характерны незначительные значения АА по сравнению с оксикоричными кислотами, которые можно отнести к классическим антиоксидантам. Степень ингибирования ABTS⁺-радикала Хит не превышала 5% и практически не изменялась в диапазоне концентраций от 0.1 до 0.6 мг/мл.

Конъюгаты Хит-ОК проявляли гораздо более сильную антиоксидантную активность, чем исходный Хит (рис. 3). При восстановлении катион-радикалов конъюгатами наблюдалась концентрационная зависимость: с увеличением концентрации действующего вещества от 0.1 до 0.6 мг/мл степень ингибирования радикала линейно возрастала в среднем от 20 до 90% и существенно не зависела от типа конъюгата. Значение величины EC₅₀ для конъюгата с КК составляло 276 мкг/мл, а с ФК – 288 мкг/мл. Эти значения на порядок выше по сравнению с исходными оксикоричными кислотами. С учетом степени модификации и в пересчете на массу КК или ФК в конъюгате, становится очевидным, что основной вклад в АА конъюгатов вносят химически пришитые к полимеру фрагменты ОК. Причем антирадикальная активность ФК в составе конъюгата близка к 100% по сравнению с исходной. В то время как для КК наблюдалось повышение активности в среднем на 30%. В основе механизма реакции ингибирования ABTS•⁺ лежит перенос электронов (ЕТ процесс) от гидроксилов и карбоксилов ОК. После конъюгирования COOH-группы кислоты ковалентно связаны с NH₂-группами хитозана и вклад в АА конъюгатов вносят лишь гидроксилы кольца ОК. При этом согласно авторам [24] гидроксилы пирокатехинового кольца КК связаны водородными взаимодействиями с гидроксилами и кислородом хитозана. В то время как фенольный гидроксил ФК не вовлечен в образование водородных или полярных связей с хитозаном. Возможно, именно этим можно объяснить повышение антирадикальной активности КК в составе конъюгата. Таким образом, ингибирующий эффект уменьшался в ряду Хит-КК > Хит-ФК > Хит. Подобный эффект увеличения АА конъюгатов по сравнению с немодифицированным хитозаном наблюдался в работах [21, 28, 29].

Для оценки потенциала практического применения синтезированных конъюгатов, в том числе и для различных типов обработки семян растений, были изучены их пленкообразующие свойства. Для этого использовали метод кварцевого микровзвешивания, который позволял in situ изучать закономерности адсорбции веществ на планарной поверхности. Адсорбцию конъюгатов Хит-ФК и Хит-КК проводили из воды и солевого раствора (физиологический раствор хлорида натрия). В качестве отрицательно заряженного полианиона использовали полисахарид пектин. При чередующейся адсорбции конъюгата Хит-ОК и пектина из их водных растворов наблюдался линейный рост (y = 10.607x и y = 14.905x для Хит-КК и Хит-ФК соответственно) массы пленки вплоть до 10 бислоев (рис. 4, 1, 2): величина достоверности апроксимации (R²) экспериментальных данных линейной функцией составляет 0.99 и 0.98 для Хит-КК и Хит-ФК соответственно). При адсорбции компонентов из 0.15 М растворов NaCl масса покрытия возрастала экспоненциально (рис. 4, 3, 4). В этом случае зависимость частоты колебаний резонатора от числа адсорбированных бислоев описывалась уравнением:

где ƒ₁ и ƒ₂ – кинетические масштабные коэффициенты роста пленки и они обычно равны, а β – характеристический параметр силы экспоненциального роста. Значение β близкие к 0 указывают на линейный рост массы пленки, чем выше значение β, тем интенсивнее экспоненциальный рост массы пленки [30]. Пленки адсорбированные из солевых растворов характеризовались слабым экспоненциальным ростом: параметр β составлял 0.22 и 0.23 для (Хит-ФК/пектин)_n и (Хит-КК/пектин)_n соответственно. Таким образом, характер зависимости ΔF от n не зависел от типа конъюгата Хит-ОК, а определялся главным образом ионной силой раствора. Характеристики мультислойных пленок (Хит-ОК/пектин)_n приведены в табл. 2. Толщина мультислойных покрытий (Хит-ОК/ пектин)₁₀, сформированных в водных растворах, не превышала 26 нм, в солевых растворах – 61 нм (табл. 2). Толщина бислоя формируемых из водных растворов покрытий составляла 2.6 ± 0.1 и 2.4 ± 0.2 нм для Хит-ФК/пектин и Хит-КК/пектин, в солевых растворах– 4.8 ± 0.1 нм и 6.1 ± 0.1 нм соответственно. Рассчитанное значение величины модуля сдвига (µ) для биополимерных покрытий на основе конъюгатов хитозана находилось в диапазоне 0.9–1.3 МПа (табл. 2).

Для мультислойных покрытий $({\text{Хит - ФК/}}$ ${\text{пектин}}{{)}_{{n{{{\text{H}}}_{{\text{2}}}}{\text{O}}}}}$ характерна однородная мелкозернистая поверхность (рис. 5а). С увеличением числа слоев от 1 до 10 существенного изменения структуры поверхности пленки не наблюдалось. На поверхности присутствовали аморфные округлые образования (“зерна”). Латеральный размер “зерна” для бислойной системы равен ~20–50 нм. С увеличением числа бислоев до 4 диаметр “зерна” незначительно увеличивался и составлял ~30–60 и 40–60 нм для поверхности покрытий (Хит-ФК/пектин)₄ и (Хит-ФК/пектин)₁₀ соответственно (рис. 5а).

Пленки (Хит-ФК/пектин)_n, сформированные из 0.15 M NaCl были неоднородными, на их поверхности наблюдали агрегаты неправильной формы (рис. 5б). Следует отметить, что с увеличением числа слоев количество агрегатов уменьшалось, а размер “зерна” увеличивался от 40–60 до 90–100 нм (рис. 5б).

Морфология поверхности покрытий на основе пленок (Хит-КК/пектин)_n, сформированных из воды, сходна с пленками (Хит-ФК/пектин)_n. Поверхность пленок бездефектная однородная, хорошо структурированная (рис. 6а). Размер “зерна” составлял 40–50 нм и не зависел от числа слоев покрытия. В случае адсорбции компонентов из солевых растворов с увеличением числа слоёв (Хит-КК/пектин) на поверхности пленок наблюдалось формирование доменов неправильной формы с размером до ~500 нм (рис. 6б), что могло быть связано с конформационными изменениями молекулы Хит-КК в 0.15 M NaCl и/или формированием объемных аморфных комплексов Хит-КК/пектин. Сходную морфологию имели мультислойные пленки на основе немодифицированного хитозана (рис. 7).

Полученные данные согласуются с данными литературы. Так, ранее было показано [30], что при чередующейся адсорбции высокомолекулярного хитозана и пектина в водных растворах наблюдался линейный рост толщины пленки, а сформированные многослойные покрытия (хитозан/пектин)₁₀ имели гладкую однородную бездефектную поверхность.

Образование аморфных агрегатов на поверхности пленок при адсорбции компонентов из солевых растворов связано с экранированием заряда протонированных аминогрупп хитозана и карбоксильных групп пектина низкомолекулярным электролитом, что приводило к снижению электростатического отталкивания полимерных цепей в растворе и переходом макромолекул полииона в “свернутое” конформационное состояние. Это обуславливает уменьшение количества контактов макромолекул и поверхности, в результате чего при адсорбции происходило формирование рыхлого слоя за счет образования полимерными цепями так называемых “петель” и “хвостов”. При адсорбции последующих слоев полиионов формируются покрытия с развитой удельной поверхностью, в том числе за счет образования объемных полиэлектролитных комплексов (жидких коацерватов) [31]. Менее выражен этот эффект на поверхности пленок (Хит-ФК/пектин)₁₀ по сравнению с морфологией покрытий (Хит/пектин)₁₀ и (Хит-КК/пектин)₁₀. Это можно объяснить большей гидрофильностью конъюгата Хит-ФК и, как следствие, лучшей его растворимостью в водных растворах по сравнению с исходным Хит и Хит-КК. Так, согласно работе [28] конъюгаты Хит с ФК имели лучшую растворимость по сравнению с исходным Хит, а в работе [32] показали, что под влиянием соли в растворе макромолекулы синтетических полиэлектролитов претерпевают конформационные изменения, что приводило к формированию покрытий с высоким значением R_ms и экспоненциальным ростом толщины.

Значения шероховатости поверхности для всех покрытий (Хит-ОК/пектин)_n не превышали 6 нм (табл. 3). Наблюдалось относительное сглаживание поверхности 4-бислойных пленок. Так, для всех типов пленок (Хит-ОК/пектин)_n за исключением (Хит-КК/пектин)_NaCl в ряду n = 1, n = 4, n = 10 минимальное значение R_ms характерно для 4-бислойных пленок (табл. 3). Увеличение ионной силы раствора приводило к формированию пленок с большей шероховатостью по сравнению покрытиями, сформированными из водных растворов. Причем наибольший эффект характерен для покрытий на основе немодифицированного хитозана. Вероятно, это связано с увеличением локального электростатического заряда макромолекулы хитозана после его химической модификации, усилению отталкивания одноименно заряженных групп и адсорбции макромолекул на поверхности в вытянутой конформации, что уменьшает степень шероховатости поверхности. Это согласуется с данными, полученными методом динамического светорассеивания и кварцевого микровзвешивания.

Таким образом, полученные тонкие пленки на основе конъюгатов Хит-ОК имели свойства (шероховатость, модуль сдвига, толщина), сопоставимые с мультислойными пленками на основе синтетических полиэлектролитов [33 ] . Пленкообразующие свойства конъюгатов Хит-ОК зависят в большей степени от ионной силы раствора (присутствия низкомолекулярного электролита), чем от типа химически пришитой кислоты (ФК или КК). С учетом высокой антиоксидантной активности синтезированных конъюгатов полученные ультратонкие покрытия на их основе имеют потенциал использования в качестве защитных пленок для продуктов питания, а также для модификации изделий биомедицинского применения.

В дальнейшем изучали влияние обработки семян конъюгатами на продуктивность и качество продукции растений редиса, выращенных в условиях полевого мелкоделяночного опыта в оптимальных и неблагоприятных условиях роста. Визуальная оценка полученного урожая в оптимальных условиях роста растений показала, что при обработке семян редиса конъюгатами большая часть корнеплодов имела ровную и округлую форму с меньшим количеством повреждений, наблюдалось увеличение количества нестандартных крупных плодов (рис. 8). В стрессовых условиях выращивания растений отмечали изменение корнеплодов с округлой формы на более удлиненно-эллиптическую, в урожае редиса повышалось количество мелких корнеплодов. При обработке конъюгатами в стрессовых условиях в урожае сохранялось повышенное количество нестандартных крупных плодов, также заметно увеличивалась длина хвостовой части относительно стрессового контроля (рис. 8). Таким образом, в стрессовых условиях выращивания корневая система у растений редиса удлинялась в контрольном и опытных вариантах, что свидетельствует об адаптивной реакции растений. В вариантах обработки конъюгатами увеличение длины хвостовой части корнеплода относительно стрессового контроля может указывать на более эффективную адаптацию к засолению.

При обработке семян конъюгатами Хит-ФК и Хит-КК отмечали повышение содержания витамина С в корнеплодах редиса в среднем в 1.5 раза относительно контроля в оптимальных условиях выращивания (рис. 9а). При действии стрессового фактора в контроле возрастал уровень витамина С (на 50% относительно оптимальных условий) и достигал уровня в корнеплодах из обработанных конъюгатами семян. Воздействие солевого стресса не приводило к изменению содержания витамина С в корнеплодах редиса в вариантах обработки конъюгатами (рис. 9а).

Содержание нитрат-ионов в корнеплодах редиса, полученных в оптимальных условиях роста, снижалось на 17% в варианте Хит-КК относительно контроля (рис. 9б). В неблагоприятных условиях выращивания отмечалась тенденция к снижению нитрат-ионов относительно оптимальных условий во всех вариантах. При обработке Хит-ФК снижение нитратов было наиболее существенным – на 37% относительно оптимальных условий и на 25% относительно стрессового контроля (рис. 9б).

Химическая модификация Хит-ОК позволила значительно увеличить его антиоксидантную активность. Ковалентное связывание ФК и КК с хитозаном не снижало их антирадикальную активность. Синтезированные конъюгаты пригодны для формирования ультратонких (менее 100 нм) моно- и мультислойных покрытий. Характеристики (морфология, шероховатость, масса, толщина, модуль сдвига) LbL-пленок на основе конъюгатов Хит-КК и Хит-ФК зависели, главным образом, от природы исходного полимера. При этом химическая модификация Хит приводила к увеличению ξ-потенциала молекулы полимера, что позволило стабилизировать его в растворах низкомолекулярного электролита. Формируемые ультратонкие пленки конъюгатов Хит-ОК и пектина были эластичными и имели модуль сдвига равный 0.9–1.3 МПа. Обработка семян редиса конъюгатами не оказала значительного влияния на продуктивность корнеплодов в полевых условиях. Однако применение конъюгатов Хит-ОК имело положительный воздействие на качество получаемой продукции, что выражалось в повышении содержания витамина С в корнеплодах и снижении количества нитратов.

Работа выполнена при финансовой поддержке Белорусского республиканского фонда фундаментальных исследований (договор №Б21УЗБГ-019/01).