1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Прикладная биохимия и микробиология
  4. T. 58, № 1, 2022

Прикладная биохимия и микробиология, 2022, T. 58, № 1, стр. 83-89

Конъюгаты иммуноглобулин-связывающий белок – наночастица золота: определение состава и применение в иммунохроматографическом анализе сульфониламида

Д. В. Сотников 1, Л. В. Баршевская 1, А. В. Жердев 1, Б. Б. Дзантиев 1, *

1 Институт биохимии им. А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр “Фундаментальные основы биотехнологии” Российской академии наук
119071 Москва, Россия

* E-mail: dzantiev@inbi.ras.ru

Поступила в редакцию 12.05.2021
После доработки 30.07.2021
Принята к публикации 02.09.2021

Полный текст (PDF)

Аннотация

Предложена новая методика определения состава конъюгатов белков с наночастицами, основанная на использовании флуорескамина в качестве флуоресцентной метки и позволяющая получать результаты с высокой точностью при минимальной продолжительности и трудоемкости. Охарактеризованы по составу и связыванию иммуноглобулинов конъюгаты наночастиц золота со стрептококковым белком G. Установлены оптимальные концентрации белка G 8 мкг/мл и золотых наночастиц – 2.5 нМ (ОП520 = 5) со средним диаметром 25 нм. Полученные конъюгаты применили для разработанного иммунохроматографического анализа антибиотика сульфониламида – важного контролируемого контаминанта пищевой продукции. Непрямое мечение специфических антител позволило использовать в анализе неочищенную кроличью антисыворотку. Визуальный и инструментальный пределы обнаружения сульфониламида составили 100 и 0.3 нг/мл соответственно. Продолжительность анализа – 10 мин. Проведена апробация тест-систем для характеристики проб мёда.

Ключевые слова: иммунохроматография, наночастицы золота, флуорескамин, сульфонамиды, мед

Уникальные физико-химические и биологические свойства способствовали применению наночастиц золота (НЧЗ) и их модифицированных производных в разнообразных областях науки и техники [1, 2]. Особенно востребованы комплексы НЧЗ с различными белками, используемые для направленного транспорта лекарств [3, 4], иммунизации [5], биоимиджинга [6, 7], в качестве маркерных агентов в аналитических системах [8–10]. Несмотря на накопленный опыт и большое количество работ, посвященных конъюгированию белков с наночастицами, полученные данные остаются неоднозначными и в ряде случаев противоречащими друг другу [11]. Открытым также остается вопрос зависимости функциональной активности конъюгатов от их состава.

Для изучения структуры и состава конъюгатов белок–НЧЗ используются различные методы: дифференциальная центробежная седиментация [12], спектрофотометрия [13–15], флуориметрия [11, 16–18], модификации иммуноферментного анализа [19, 20], высокоэффективная жидкостная хроматография [21], просвечивающая электронная микроскопия [22] и др. Однако у этих методов есть ряд недостатков: недостаточная чувствительность, сложная пробоподготовка, необходимость дорогостоящего оборудования, большое количество манипуляционных стадий и, как следствие, низкая точность и воспроизводимость результатов. Некоторые методы, например, измерение триптофановой флуоресценции, пригодны лишь для белков определенного состава [11], поэтому актуальна разработка универсального и нетрудоемкого метода определения состава конъюгатов наночастиц с белками.

Предлагаемый в данной работе метод основан на мечении белков флуорескамином с последующей регистрацией флуоресценции. Флуорескамин – флуорогенный краситель с длиной волны возбуждения 390 нм, используемый в генетических исследованиях, в тонкослойной и бумажной хроматографии, при измерениях протеолитической активности и др. При взаимодействии флуорескамина с первичными аминогруппами белка образуются интенсивно флуоресцирующие производные [23–25]. Поскольку практически все белки содержат лизин, флурескамин – универсальный реагент для мечения белков. Преимуществом флуорескамина является то, что его исходная форма не флуоресцирует, флуоресценция появляется только после взаимодействия с аминогруппой и поэтому измерения характеризуются низким фоновым сигналом. Реакция с аминогруппами протекает за несколько секунд. К тому же флуорескамин устойчив лишь в органических растворителях, а в воде гидролизуется с выпадением продукта в осадок в течение 1–2 мин, что исключает необходимость отделять продукт реакции от несвязанной метки. Отсутствие дополнительных стадий обусловливает высокую производительность измерений. Разработанная методика обеспечивает инструментарий для простого и быстрого количественного определения белка, сорбированного на поверхности наночастиц. В качестве такого белка в экспериментах использовали иммуноглобулин-связывающий стрептококковый белок G, который часто применяется в иммунохимических методах для непрямого мечения антител [26, 27].

На основании предложенной методики были выбраны препараты золотых наночастиц с иммобилизованным белком G с оптимальной нагрузкой, использованные для разработки иммунохроматографического анализа (ИХА) сульфонамидного антибиотика сульфониламида (СА). Сульфонамиды широко используются в сельском хозяйстве для борьбы с инфекционными заболеваниями. Остаточные количества сульфонамидов в пищевых продуктах животного происхождения могут привести к развитию ряда заболеваний и аллергических реакций у людей, а также к возникновению резистентных штаммов микроорганизмов, что требует постоянного контроля и предотвращения чрезмерного употребления антибиотиков данного класса [28, 29].

Цель работы – разработка методики определения состава конъюгатов белков с наночастицами и ее применение для создания иммунохроматографической тест-системы на сульфониламид.

МЕТОДИКА

Получение наночастиц золота. НЧЗ синтезировали согласно методу Френса [30]. 1 мл 1%-ного водного раствора HAuCl4 (“Sigma-Aldrich”, США) вносили в 97.5 мл воды, нагревали смесь до кипения, а затем при активном перемешивании добавляли 1.5 мл 1%-ного водного раствора цитрата натрия (“Химмед”, Россия). Раствор кипятили 15 мин, затем охлаждали и хранили при 4°C.

Определение размеров наночастиц золота методом просвечивающей электронной микроскопии. Снимки препаратов НЧЗ получали с помощью микроскопа CX-100 (“Jeol”, Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ и увеличении 33 000. Фотографии сканировали и анализировали с помощью программы Image Tool (“UTHSCSA”, США), характеризуя не менее 120 изображений одиночных частиц.

Определение состава конъюгатов НЧЗ–белок. Раствор НЧЗ разливали в 10 пробирок по 2.0 мл, двукратно центрифугировали при 10 000 g, затем отбирали надосадочную жидкость. Осадок взбалтывали (объем оставшейся в пробирке жидкости доводили надосадочной жидкостью до 0.2 мл). Стоковый раствор белка G (“Имтек”, Россия) с концентрацией 240 мкг/мл разводили надосадочной жидкостью для достижения конечных концентраций белка 24, 16, 10, 7, 5 и 3 мкг/мл. По 0.2 мл данных растворов белка в надосадочной жидкости добавляли к 0.2 мл растворов НЧЗ, полученных после центрифугирования, а оставшиеся растворы белка использовали для построения градуировочной зависимости. Белок G инкубировали с НЧЗ 30 мин при комнатной температуре, двукратно центрифугировали при 10 000 g, отбирали 0.2 мл надосадочной жидкости и переносили в микропланшет (“Roskilde”, Дания). Градуировочные растворы также переносили в микропланшет по 0.2 мл. К полученным растворам добавляли по 10 мкл раствора флуорескамина (“Sigma-Aldrich”, США) в ацетоне (100 мг/мл), инкубировали 10 мин при комнатной температуре и измеряли флуоресценцию. Спектры флуоресценции регистрировали с помощью фотометра Perkin Elmer En Spire 2300 (“Waltham”, США) при длине волны возбуждающего света 390 нм в диапазоне длин волн испускаемого света 450–550 нм.

Получение конъюгата НЧЗ с белком G для использования в ИХА. Раствор НЧЗ (оптическая плотность при 520 нм: D520 = 1) доводили карбонатом калия до pH 8.5–9.0, после чего вносили в этот раствор белок G до концентрации 8 мкг/мл. Смесь инкубировали 30 мин при комнатной температуре, затем вносили 10%-ный раствор БСА (“Boval Biosolutions”, США) и выдерживали еще 10 мин при интенсивном перемешивании. Полученный раствор центрифугировали 15 мин при 10 000 g. Осадок отбирали и вносили 1%-ный раствор БСА до конечного объема 1 мл. Полученный раствор хранили при 4°С.

Получение антисывороток против СА. Для синтеза использовали производное СА с карбоксильной группой NH2C6H4SO2NH(CH2)3COOH, предоставленное А.А. Формановским (Институт биоорганической химии РАН, Россия). Конъюгат данного производного и бычьего сывороточного альбумина (СА-БСА) синтезировали карбодиимидным методом [31] и использовали для иммунизации кроликов породы шиншилла массой 3–4 кг согласно [32].

Для первой иммунизации раствор иммуногена в фосфатно-солевом буфере (ФБС; 50 мМ калий-фосфатный буфер, рН 7.4, с 0.1 М NaCl) эмульгировали с равным объемом полного адъюванта Фрейнда до конечной концентрации 1 мг/мл (по белку). Эту смесь (1.0 мл) вводили внутрикожно и подкожно. Впоследствии кролики получали бустерные инъекции, содержавшие 0.5 мг иммуногена на животное, подкожно в ФБС с равным объемом неполного адъюванта Фрейнда и внутривенно в ФБС. Через неделю у кроликов отбирали кровь. Циклы реиммунизации повторяли с 5-недельным интервалом.

Изготовление иммунохроматографических тест-систем. Комплектация тест-полосок включала рабочую мембрану, мембраны для нанесения образца и конъюгата, а также конечную впитывающую мембрану. В качестве рабочей использовали нитроцеллюлозную мембрану UniSart CN95 (“Sartorius”, Германия), впитывающей – мембрану CFSP 223000 (“Millipore”, США), мембраны для нанесения конъюгата – непредобработанную мембрану PT-R5 (“Advanced Microdevices”, Индия). С помощью автоматического диспенсера IsoFlow (“Imagene Technology”, США) на рабочей мембране формировали аналитическую зону с иммобилизованным конъюгатом СА-БСА (3 мг/мл) в ФБС и контрольную зону с иммобилизованным антителами козы против иммуноглобулинов кролика (“Имтек”, Россия) в концентрации 5 мг/мл. Конъюгат НЧЗ с белком G наносили на мембрану для конъюгата (D520 = 10, объем нанесения – 13 мкл/мм). После нанесения реагентов мембраны сушили на воздухе при 20–22°C не менее 20 ч. Собирали мультимембранный композит, из которого получали полоски шириной 3.5 мм, используя автоматический гильотинный нарезчик Index Cutter-1 (“A-Point Technologies”, США). Нарезку и упаковку проводили в помещении с относительной влажностью воздуха не более 30%. Упакованные тест-полоски хранили при комнатной температуре.

Проведение иммунохроматографического анализа СА. ИХА проводили при комнатной температуре. В ФБС, содержащий 1% детергента твин-20 (ФБСТ), или в контаминированные пробы мёда, разбавленные ФБСТ в соотношении 1 : 4, вносили раствор СА для достижения его конечных концентраций в диапазоне 0.8–100 нг/мл, а также антисыворотку в разведении 1 : 800. Тест-полоски вносили в пробы в вертикальном положении, инкубировали 10 мин, а затем извлекали и оценивали результат ИХА визуально. С помощью программного обеспечения TotalLab TL120 (“Nonlinear Dynamics”, Великобритания) проводили оцифровку изображений тест-полосок и определяли интенсивности окрашивания контрольной и аналитической зон.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Размерная характеристика наночастиц золота. Для определения среднего диаметра и гомогенности НЧЗ использовали метод просвечивающей электронной микроскопии. Согласно полученным данным, синтезированные наночастицы характеризовались сферической формой и гомогенным распределением по размерам. Длина большей оси наночастиц составила 25 ± 3 нм, меньшей оси – 23 ± 4 нм, средний диаметр – 25 ± 5 нм.

Характеристика состава конъюгатов белок G–НЧЗ. Для определения состава конъюгатов использовали метод флуоресцентной спектроскопии, вводя флуорескамин в качестве метки в градуировочные и реакционные растворы. Получали зависимости интенсивности флуоресценции при 490 нм от концентрации добавленного белка для градуировочных растворов (рис. 1а) и надосадочных жидкостей (рис. 1б). На основании линеаризованной градуировочной зависимости (R-фактор был больше 0.99) по величинам флуоресценции вычисляли содержание белка в надосадочных жидкостях. Затем рассчитывали количество связанного белка в конъюгатах как разницу между добавленным и несвязавшимся белком.

Рис. 1.

Зависимости интенсивности флуоресценции (усл. ед., I) от добавленной концентрации белка G (мг/мл) в калибровочных растворах (а) и в реакционных растворах после центрифугирования (б).

Полученная зависимость между количествами добавленного и связанного с НЧЗ белка G представлена на рис. 2. Пплато на кривой отражает насыщение поверхности НЧЗ иммобилизованным белком.

Рис. 2.

Зависимость концентрации белка G (мкг/мл) в составе конъюгата с НЧЗ от концентрации добавленного белка .

При выборе оптимального состава конъюгата белок G–НЧЗ и протокола его получения исходили из критерия максимального связывания иммобилизуемого белка. Выбор этого критерия определялся использованием непрямой схемы ИХА, в которой рост реакционной способности конъюгата обеспечивал большую интенсивность сигнала и более чувствительное выявление аналита. При этом для других форматов ИХА ранее отмечалась оправданность использования конъюгатов НЧЗ–антитело с меньшей нагрузкой. Так, в сэндвич-ИХА сокращение нагрузки антител в 2–4 раза снижало расход специфических реагентов без значимых изменений аналитических параметров [33], а в конкурентном ИХА приводило к сдвигу рабочего диапазона градуировочных кривых в область более низких концентраций [34]. При выборе оптимальных составов конъюгатов для данных форматов ИХА также может быть использована предложенная в данной работе методика со взаимодействием иммуноглобулинов с флуорескамином.

Следует отметить, что такое решение позволило работать даже с нефракционированной поликлональной антисывороткой. Поскольку иммуноглобулиновая фракция антисыворотки содержит небольшую долю антител против использованного антигена (как правило, менее 5% [35]), то большая часть иммуноглобулинов в сыворотке будет блокировать реакционные центры конъюгата НЧЗ с белком G, препятствуя эффективному связыванию маркера в аналитической зоне. Тем не менее, использование установленной максимальной нагрузки иммобилизуемых антител обеспечило возможность эффективной регистрации результатов анализа и выявления аналита в низких концентрациях.

Выбранная оптимальная концентрация белка G для синтеза конъюгата составила 8 мкг/мл, что соответствовало ранее установленным требованиям для конъюгата белок G–НЧЗ, используемого в серодиагностике [36]. При данной концентрации обеспечивается иммобилизация 133 молекул белка G на одну НЧЗ диаметром 25 нм.

Иммунохроматографический анализ СА. Конкурентный ИХА был реализован в формате с непрямым введением маркера. Ранее для ряда систем отмечалось, что непрямое мечение антител с помощью аффинных взаимодействий (например, с использованием антивидовых антител, стафилококкового белка А, стрептококкового белка G или других иммуноглобулин-связывающих молекул) дает значительное преимущество в иммуноанализе по сравнению с использованием антител, непосредственно иммобилизованных на маркерных частицах [37–40]. Преимущества непрямого мечения состоят в возможности независимо варьировать концентрацию маркера (для интенсивного сигнала) и специфических антител (для эффективной конкуренции), используя для этого два разных реагента. В традиционном же ИХА с прямым мечением изменять концентрации специфических антител и маркера можно только одновременно и однонаправлено.

Для проведения анализа пробу смешивали с препаратом специфических антител, инкубируя в течение 1 мин, после чего в эту смесь погружали тест-полоску. В результате происходило двухступенчатое взаимодействие – образование комплекса специфических антител с антигеном и его выявление сорбированным на подложке конъюгатом белка G с меткой (НЧЗ). Продолжительность иммунохроматографии составляла 10 мин, после чего проводили регистрацию результатов.

Аналитические параметры тест-системы были установлены по результатам определения СА в ФБСТ и в искусственно контаминированных пробах мёда. На рис. 3 представлены отсканированные изображения тест-полосок после анализа. При цифровой регистрации предел обнаружения СА, определявшийся по статистически достоверному снижению интенсивности окрашивания относительно окрашивания в отсутствии СА, был равен 0.3 нг/мл, рабочий диапазон – 0.6–1.0 нг/мл в ФБСТ. Предел обнаружения в мёде составил 0.37 нг/мл, рабочий диапазон – 0.37–1.5 нг/мл. Визуальный предел обнаружения СА, соответствовавший исчезновению окрашивания в аналитической зоне, составил 100 нг/мл, что связано с сохранением относительно стабильного низкого сигнала в широком диапазоне концентраций (от 3 до 50 нг/мл) за рамками рабочего диапазона количественного анализа.

Рис. 3.

Иммунохроматографическое определение СА: внешний вид тест-полосок при тестировании проб в ФБСТ (а), в меде (б) и градуировочные кривые (в; 1 – в меде, 2 – в ФБСТ).

Полученные результаты соответствуют установленным нормам по максимально допустимому содержанию сульфонамидов в пищевой продукции (0.1 мг/кг) [41, 42]. Использование в тест-системе конъюгата наночастиц золота с белком G подтверждает его эффективность для обеспечения высокочувствительного анализа, а универсальность данного маркера позволяет его использовать для детекции различных соединений.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 20-76-10033).

Список литературы

  1. Dykman L.A., Khlebtsov N.G. // Biomed. Opt. Express. 2019. V. 10. № 7. P. 3152–3182.

  2. Mieszawska A.J., Fayad Z.A., Cormode D.P. // Mol. Pharm. 2013. V. 10. № 3. P. 831–847.

  3. Han G., Ghosh P., Rotello V.M. // Nanomedicine. 2007. V. 2. № 1. P. 113–123.

  4. Arvizo R., Bhattacharya R., Mukherjee P. // Expert. Opin. Drug. Deliv. 2010. V. 7. № 6. P. 753–763.

  5. Dykman L.A. // Expert Rev. Vaccines. 2020. V. 19. № 5. P. 465–477.

  6. Klein S., Petersen S., Taylor U., Rath D., Barcikowski S. // J. Biomed. Opt. 2010. V. 15. № 3. Article 036015. doi.org/https://doi.org/10.1117/1.3461170

  7. Mahan M.M., Doiron A.L. // J. Nanomater. 2018. V. 2018. Article 5837276https://doi.org/10.1155/2018/5837276

  8. Baptista P., Pereira E., Eaton P., Doria G., Miranda A. et al. // Anal. Bioanal. Chem. 2008. V. 391. № 3. P. 943–950.

  9. Bailes J., Mayoss S., Teale P., Soloviev M. // Methods Mol. Biol. 2012. V. 906. P. 45–55.

  10. Li, Z., Sheng W., Liu Q., Li S., Shi Y. et al. // Anal. Methods. 2018. V. 10. № 28. P. 3506–3513.

  11. Sotnikov D.V., Zherdev A.V., Dzantiev B.B. // Int. J. Mol. Sci. 2015. V. 16. P. 907–923.

  12. Wang R., Chen L., Li D., Liu R., Ge G. // Part. Part. Syst. Charact. 2017. V. 34. № 12. Article 1700134. https://doi.org/10.1002/ppsc.201700134

  13. Iosin M., Toderas F., Baldeck P.L., Astilean S. // J. Mol. Struct. 2009. V. 924–926. P. 196–200.

  14. Kaur K., Forrest J.A. // Langmuir. 2012. V. 28. № 5. P. 2736–2744.

  15. Oliverio R., Liberelle B., Murschel F., Garcia-Ac A., Banquy X., De Crescenzo G. // ACS Appl. Nano Mater. 2020. V. 3. № 10. P. 10497–10507.

  16. Duan Y., Liu Y., Shen W., Zhong W. // Anal. Chem. 2017. V. 89. № 22. P. 12160–12167.

  17. Kozlowski R., Ragupathi A., Dyer R.B. // Bioconjug. Chem. 2018. V. 29. № 8. P. 2691–2700.

  18. Zhang L., Hu D., Salmain M., Liedberg B., Boujday S. // Talanta. 2019. V. 204. № 8. P. 875–881.

  19. Sotnikov D.V., Radchenko A.S., Zherdev A.V., Dzantiev B.B. // Eurasian J. Anal. Chem. 2016. V. 11. № 3. P. 169–179.

  20. Tripathi K., Driskell J.D. // ACS Omega. 2018. V. 3. № 7. P. 8253–8259.

  21. Liu S., Horak J., Höldrich M., Lämmerhofer M. // Anal. Chim. Acta. 2017. V. 989. P. 29–37.

  22. Busch R.T., Karim F., Weis J., Sun Y., Zhao C., Vasquez E.S. // ACS Omega. 2019. V. 4. № 12. P. 15269–15279.

  23. Udenfriend S., Stein S., Böhlen P., Dairman W., Leimgruber W., Weigele M. // Science. 1972. V. 178. № 4063. P. 871–872.

  24. Weigele, M., De Bernardo S., Leimgruber W., Cleeland R., Grunberg E. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1973. V. 54. № 3. P. 899–906.

  25. Duan Y., Liu Y., Shen W., Zhong W. // Anal. Chem. 2017. V. 89. № 22. P. 12160–12167.

  26. Choe W., Durgannavar T.A., Chung S.J. // Materials. 2016. V. 9. № 12. Article 994. doi.org/https://doi.org/10.3390/ma9120994

  27. Nezlin R. In: The Immunoglobulins. Academic Press: N.Y., 1998. P. 219.

  28. Baran W., Adamek E., Ziemiańska J., Sobczak A. // J. Hazard. Mater. 2011. V. 196. P. 1–15.

  29. Jiang J., Wang G. // IOP Conf. Ser. Earth Envir. Sci. 2017. V. 100. Article 012040. https://doi.org/10.1088/1755-1315/100/1/012040

  30. Frens G. // Nat. Phys. Sci. 1973. V. 241. № 105. P. 20–22.

  31. Eremin S.A., Murtazina N.R., Ermolenko D.N., Zherdev A.V., Martianov A.A. et al. // Anal. Lett. 2005. V. 38. № 6. P. 951–969.

  32. Mart’ianov A.A., Zherdev A.V., Eremin S.A., Dzantiev B.B. // Int. J. Envir. Anal. Chem. 2004. V. 84. № 13. P. 965–978.

  33. Byzova N.A., Safenkova I.V., Slutskaya E.S., Zherdev A.V., Dzantiev B.B. // Bioconjugate Chem. 2017. V. 28. № 11. P. 2737–2746.

  34. Zvereva E.A., Byzova N.A., Sveshnikov P.G., Zherdev A.V., Dzantiev B.B. // Anal. Methods. 2015. V. 7. № 2. P. 6378–6384.

  35. Radunz A. // Zeitschrift fur Naturforschung. Section C, Biosciences. 1983. V. 38. № 3–4. P. 297–301.

  36. Sotnikov D.V., Zherdev A.V., Dzantiev B.B. // Biointerface Res. Appl. Chem. 2020. V. 10. № 2. P. 4988–4992.

  37. Urusov A.E., Petrakova A.V., Zherdev A.V., Dzantiev B.B. // Biosens. Bioelectron. 2016. V. 86. P. 575–579.

  38. Берлина А.Н., Бартош А.В., Сотников Д.В., Жердев А.В., Ху Ч., Дзантиев Б.Б. // Российские нанотехнологии. 2018. Т. 13. № 7–8. С. 80–87. (Berlina A.N., Bartosh A.V., Sotnikov D.V., Zherdev A.V., Xu C., Dzantiev B.B. // Nanotechnologies in Russia. 2018. V. 13. № 7–8. P. 430–438.)

  39. Majdinasab M., Zareian M., Zhang Q., Li P.W. // Food Chem. 2019. V. 275. P. 721–729.

  40. Di Nardo F., Cavalera S., Baggiani C., Giovannoli C., Anfossi L. // ACS Appl. Mater. Interfaces. 2019. V. 11. № 36. P. 32758–32768.

  41. Технический регламент Таможенного Союза “О безопасности пищевой продукции” ТР ТС 021/2011. М.: Центрмаг, 2021. 261 с.

  42. European Union Council Regulation 2377/90/EEC, C.R. // Off. J. Eur. Commun. 1990. V. L224. P. 1–8.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Прикладная биохимия и микробиология

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал