Прикладная биохимия и микробиология, 2021, T. 57, № 3, стр. 291-302

Вирусы папилломы человека (ВПЧ) представляют собой семейство двухцепочечных кольцевых ДНК-содержащих вирусов, которые являются интраэпителиальными патогенами и вызывают развитие как доброкачественных, так и злокачественных новообразований (рак шейки матки (РШМ), рак аногенитальной области, носоглотки, головы и шеи) [1, 2]. За развитие более 80% всех цервикальных карцином ответственны ВПЧ высокоонкогенных типов 16 и 18 [3, 4]. Основной путь передачи ВПЧ – половой, но возможны также вертикальный (от инфицированной матери плоду) и горизонтальные пути передачи вируса, в том числе контактно-бытовой [5, 6]. На ранних стадиях ВПЧ-инфекция зачастую протекает бессимптомно, неспецифические клинические признаки появляются лишь на поздних стадиях, что затрудняет выявление и проведение своевременного лечения ВПЧ-ассоциированных онкологических заболеваний.

При ВПЧ-инфекции основную роль в иммортализации, злокачественной трансформации клеток и поддержании их трансформированного фенотипа играют онкобелки E6 и E7 ВПЧ [7]. Они обладают высокой консервативностью, конститутивной экспрессией в опухолевых и предраковых клетках и не вызывают развитие аутоиммунных реакций, поскольку являются чужеродными белками для человека. Благодаря перечисленным свойствам белки E6 и E7 ВПЧ являются наиболее перспективными мишенями для создания терапевтических вакцин против ВПЧ-индуцированных онкологических заболеваний [1, 8].

На сегодняшний день ни одна из терапевтических вакцин против ВПЧ не одобрена авторитетными организациями (FDA, ВОЗ) к использованию в клинической практике. Рекомендованы к применению лишь профилактические вакцины: квадривалентная и нонавалентная вакцины Gardasil^® (“Merck Sharp&Dohme Corp.”, США) и бивалентная вакцина Cervarix^® (“GlaxoSmithKline Biologicals”, Бельгия), направленные на формирование ВПЧ-нейтрализующих антител. В России вакцинация против ВПЧ не входит в национальный календарь профилактических прививок. К сожалению, успешность профилактической вакцинации определяется отсутствием или наличием инфицированности ВПЧ: у индивидов, которые были инфицированы ВПЧ до проведения вакцинации, профилактические вакцины не могут предотвратить развитие неопластических изменений и рака, а также вертикальную и горизонтальную передачу вируса от инфицированных родителей детям [9]. Таким образом, существенная доля населения не защищена от ВПЧ-инфекций, поэтому разработка терапевтических вакцин для стимуляции цитотоксического Т-клеточного ответа, направленного на уничтожение ВПЧ-инфицированных и малигнизированных клеток, представляется крайне актуальной.

В настоящее время ряд кандидатных терапевтических вакцинных композиций, предназначенных для лечения ВПЧ-ассоциированных предраковых поражений и опухолевых заболеваний, в том числе РШМ, проходит доклинические и клинические испытания [10]. В основном в состав иммуногенных композиций входит онкобелок Е7, так как он лучше охарактеризован в доклинических исследованиях [11]. Однако онкобелок Е6 не менее перспективен – в экспериментах Накагава с соавт. [12] излечение от ВПЧ-инфекции коррелировало с цитотоксическим Т-клеточным ответом, индуцированным онкобелком Е6.

Помимо терапевтического применения, мишени E6 и E7 могут также использоваться в диагностике ВПЧ-ассоциированных заболеваний: пациентки с РШМ имеют более высокие уровни анти-E6- и анти-Е7-антител, чем женщины с нормальной цитологической картиной или низкой степенью тяжести дисплазии шейки матки [13].

Одним из наиболее простых способов получения рекомбинантных антигенов в больших количествах с целью разработки иммуногенных композиций является клонирование гена в прокариотический экспрессионный вектор и получение белка в Escherichia coli. Показано, что рекомбинантный белок Е7, полученный микробиологическим синтезом, сохраняет антигенные свойства нативного белка, распознаваемого сыворотками от ВПЧ-инфицированных субъектов, и поэтому он используется в серологических исследованиях. Получение белка Е7 в растворимой форме не представляет собой значительную сложность [14–16]. Напротив, белок Е6 имеет тенденцию образовывать тельца включения при экспрессии в E. coli, по всей видимости, из-за наличия в его составе сильных гидрофобных аминокислотных остатков [17]. Было предложено несколько подходов для преодоления проблем получения рекомбинантного Е6, однако его гидрофобные свойства сохранялись даже при соединении с глутатион-S-трансферазой или мальтозосвязывающим белком, что приводило к частичной агрегации белка [18, 19]. В работе [20] проведена успешная очистка белка E6 двухступенчатым хроматографическим методом, однако он был стабильным только в щелочной среде (рН 10), что значительно ограничивает его применение [20]. Таким образом, актуальной задачей являлось получение в E. coli онкобелков Е6 и Е7 в растворимой форме, сохраняющих стабильность при нейтральных рН.

Цель работы – получение рекомбинантных антигенов Е6 и Е7 ВПЧ 16 типа в гетерологичной системе экспрессии в Escherichia coli, очистка, изучение их иммуногенности и противоопухолевой активности in vivo на мышах линии BALB/c.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Получение генно-инженерных конструкций и штаммов-продуцентов рекомбинантных белков E6-CBD и E7-CBD. На первом этапе работы были спланированы последовательности синтетических генов, кодирующих онкогенные белки Е6 и Е7 ВПЧ16. Нуклеотидные последовательности были оптимизированы за счет вырожденных позиций нуклеотидных остатков таким образом, чтобы в них по возможности присутствовали кодоны, наиболее часто встречающиеся в E. coli. Также была проведена корректировка вторичной структуры транскрибируемой мРНК с целью предупреждения образования шпилек и сложных элементов вторичной структуры, которые могут снижать эффективность трансляции. Последовательности генов фланкировали сайтами эндонуклеаз NcoI и Kpn2I на 5'- и 3'-концах соответственно для последующего клонирования с использованием плазмиды pR1504 на основе вектора pQE-6 в E. coli М15. Далее клонированные гены, кодирующие белки Е6 и Е7, встраивали по сайтам рестрикции BamHI, BglI и BglII в экспрессионные векторы на основе плазмиды pQE-6, содержащие последовательность гена СBD из термофильного микроорганизма Anaerocellum thermophilum, соединенные через глицин-сериновый спейсер. Полученными векторами трансформировали штаммы E. coli BL21 [pRep4] и M15 [pRep4].

Индукция экспрессии обоих рекомбинантных белков с помощью ИПТГ приводила к накоплению соответствующих продуктов ожидаемой молекулярной массы. Содержание белков E6-CBD и E7-CBD составляло 15%.

Выделение и очистка рекомбинантных белков E6-CBD и E7-CBD. Процедура выделения и очистки полученных в данной работе рекомбинантных белков E6-CBD и E7-CBD основана на способности специфически связываться с целлюлозосодержащим сорбентом Perloza MT500 за счет целлюлозосвязывающего домена, что позволяет проводить процедуру связывания и очистки рекомбинантных белков на твердой фазе в одну стадию. Важной особенностью является отсутствие у штаммов E. coli BL21 и M15 собственных белков, специфически взаимодействующих с целлюлозой.

Разработанная методика выделения и очистки рекомбинантных белков E6-CBD и E7-CBD из индуцированных клеток штаммов-продуцентов включает следующие стадии: осаждение клеток из культуральной среды центрифугированием, лизис и разрушение клеток посредством обработки лизоцимом и ультразвуком, разделение методом центрифугирования белков легкорастворимой фракции и нерастворимых белков, очистка рекомбинантных белков с помощью аффинной хроматографии на целлюлозосодержащем сорбенте, стерилизующая фильтрация.

Анализ фракций, полученных на первом этапе очистки, показал, что целевые рекомбинантные белки E6-CBD и Е7-CBD находятся во фракции легкорастворимых белков и частично – во фракции нерастворимых белков (рис. 1 и 2, дорожки 1 и 2). Для дальнейшей очистки рекомбинантных белков E6-CBD и Е7-CBD использовали супернатант (рис. 1 и 2, дорожки 1).

Рис. 1.

Электрофореграмма разделения в 12%-ном ПААГ белковых фракций, полученных при очистке рекомбинантного белка E6-CBD: 1 – супернатант после лизиса биомассы штамма-продуцента E6-CBD; 2 – осадок после лизиса биомассы клеток штамма-продуцента E6-CBD; 3 – белки супернатанта после лизиса биомассы, не связавшиеся с Perloza MT500; 4 – промывка 20 мМ Трис-HCl-буфером (рН 8.0) с 0.1% Тритона Х100; 5 – промывка Трис-HCl-буфером (рН 8.0) без Тритона Х100; 6 – рекомбинантный белок E6-CBD (41.2 кДа), элюированный с сорбента 6 М мочевиной; 7 – белковые маркеры молекулярной массы.

Рис. 2.

Электрофореграмма разделения в 12%-ном ПААГ белковых фракций, полученных в процессе выделения и очистки рекомбинантного белка E7-CBD: 1 – супернатант после лизиса биомассы штамма-продуцента E7-CBD; 2 – осадок после лизиса биомассы клеток штамма-продуцента E7-CBD; 3 – белки супернатанта после лизиса биомассы, не связавшиеся с Perloza MT500; 4 – промывка 20 мМ Трис-HCl-буфером (рН 8.0) с 0.1% Тритона Х100; 5 – промывка Трис-HCl-буфером (рН 8.0) без Тритона Х100; 6–8 –рекомбинантный белок E7-CBD (33.1 кДа), элюированный с сорбента 6 М мочевиной; 10 – белковые маркеры молекулярной массы.

Результаты электрофоретического разделения в ПААГ по Лэммли разных фракций рекомбинантных белков E6-CBD (41.2 кДа) и Е7-CBD (33.1 кДа), полученных в процессе выделения и очистки, приведены на рис. 1 и 2. Очищенные белки представляли собой гомогенные препараты, молекулярные массы полученных белков соответствовали ожидаемым.

Выход рекомбинантных белков E6-CBD и Е7‑CBD после очистки по разработанной методике из 1 г биомассы клеток-продуцентов составил 4.5 мг для каждого из белков, степень очистки полученных рекомбинантных белков – не менее 95%. При изучении стабильности рекомбинантных белков было показано, что образцы обоих белков при хранении в течение трех месяцев при +4°С полностью сохраняли гомогенность и соответствие молекулярным массам, признаки деградации белков или протеолитического гидролиза отсутствовали (данные не приведены).

Таким образом, в результате разработанных схем клонирования, экспрессии, одностадийной очистки и рефолдинга были получены препараты рекомбинантных белков E6-CBD и E7-CBD. В основе использованного подхода лежит технология получения слитных белков с целлюлозосвязывающими доменами, успешно примененная ранее для клонирования, экспрессии и очистки различных белков [22–24]. Целлюлозосвязывающие домены позволяют проводить очистку белков на недорогих целлюлозосодержащих носителях, обеспечивают стабильность целевых белков, а также в ряде случаев позволяют повысить растворимость химерного белка по сравнению с исходным вариантом. В случае онкобелка E7 ВПЧ16 был получен полностью растворимый белок Е7-CBD. Это не удивительно, учитывая накопленный ранее опыт других исследователей, получивших экспрессию растворимого белка E7 при различных вариантах клонирования в клетках E. coli [16, 25, 26]. В случае онкобелка E6 ВПЧ16 за счет присоединения CBD удалось получить химерный белок E6-CBD частично в растворимой форме. Близкий результат описан в работе [20], в которой был получен химерный белок E6, соединенный с глутатион-S-трансферазой, однако в физиологических условиях этот белок оказался нестабильным – выделить его удалось лишь в сильнощелочных условиях, что, безусловно, затруднит использование данного белка. Полученный рекомбинантный белок E6-CBD, выделенный на целлюлозосодержащем сорбенте, характеризовался стабильностью при хранении при значениях pH, близких к нейтральным.

Вестерн-блоттинг. С целью проверки сохранности иммунореактивных эпитопов у полученных рекомбинантных антигенов E6-CBD и E7‑CBD после процедур выделения и очистки был проведен вестерн-блоттинг с использованием специфических коммерческих антител к белкам E6 и E7 ВПЧ16 и ВПЧ16-положительных клеточных линий карцином шейки матки SiHa и Ca Ski (ATCC, США).

Результаты вестерн-блоттинга представлены на рис. 3. Были выявлены полосы размером ~41.2 и ~33.1 кДа, что соответствовало теоретическим молекулярным массам рекомбинантных белков E6-CBD и E7-CBD.

Рис. 3.

Результаты вестерн-блоттинга, полученные с использованием коммерческих антител к антигенам Е6 (1–3) и Е7 ВПЧ16 (4–6), ВПЧ16-положительных клеточных линий карцином шейки матки SiHa (1, 4) и Ca Ski (2, 5), а также препаратов рекомбинантных белков E6-CBD (3) и E7-CBD (6).

Таким образом, методом вестерн-блоттинга было подтверждено наличие антигенных свойств у обоих рекомбинантных белков E6-CBD и E7-CBD.

Создание иммуногенных композиций на основе рекомбинантных белков Е6-СBD и E7-СBD. На основе полученных рекомбинантных антигенов Е6-СBD и E7-СBD были разработаны три варианта иммуногенных композиций (табл. 1), в состав которых входят оба рекомбинантных антигена либо один антиген, а также дополнительный иммуномодулирующий компонент – иммобилизованные на ДЭАЭ-декстране CpG-олигонуклеотиды, используемые в качестве адъюванта для индукции цитотоксического Т-клеточного иммунного ответа на опухолевые антигены.

Разработана схема трехэтапной иммунизации с подкожным введением иммуногенных композиций в объеме 150 мкл в холку животного с интервалом в 5 сут.

Оценка иммуногенности in vivo на мышах линии BALB/c. Опытным группам мышей линии BALB/c (n = 10) производили инъекции иммуногенной композиции CBD1 (табл. 1), содержащей рекомбинантные антигены E6-CBD и E7-CBD, трехкратно с интервалом в 5 сут. Животным контрольной группы (n = 10) по описанной схеме вводили физиологический раствор. Для потенциальной активации гуморального иммунного ответа мышей содержали в течение 14 и 42 сут после последней инъекции иммуногенной композиции CBD1. Затем животных терминировали, проводили забор крови и определяли титр антител в сыворотке крови методом непрямого ИФА.

Результаты исследования представлены на рис. 4. Титр специфичных к Е6-СBD и E7-СBD антител достигал значений ~1 : 128 000, который сохранялся на высоком уровне в течение 14 и 42 сут после последней инъекции иммуногенной композиции CBD1 (рис. 4а, 4б).

Рис. 4.

Титр антител к рекомбинантным антигенам Е6-CBD (а) и E7-CBD (б), наблюдаемый через 14 (1) и 42 (2) сут после трехкратного введения иммуногенной композиции CBD1 мышам линии BALB/c (состав CBD1 см. в табл. 1). К – контроль.

Таким образом, исследование гуморального иммунного ответа на трехкратное введение иммуногенной композиции CBD1 показало, что специфические компоненты иммуногенных композиций – рекомбинантные антигены Е6-СBD и E7-СBD ВПЧ16 – являются высокоиммуногенными и вызывают повышение гуморального иммунного ответа у мышей линии BALB/c in vivo. Высокий титр специфических антител к рекомбинантным антигенам Е6-СBD и E7-СBD сохранялся как минимум в течение 42 сут.

Исследование противоопухолевого эффекта на модели мышей линии BALB/c с ВПЧ-16-ассоциированными опухолями. Противоопухолевый эффект трех вариантов иммуногенных композиций на основе рекомбинантных антигенов Е6-СBD и E7-СBD (табл. 1) изучали in vivo с использованием созданной в данной работе экспериментальной модели мышей линии BALB/c с ВПЧ-ассоциированными опухолями, развитие которых было индуцировано подкожным введением модифицированных клеток рака молочной железы мыши 4T1 (ATCC CRL-2539™) со стабильной экспрессией полноразмерных онкобелков E6 и E7 ВПЧ16.

После формирования аутографтов (опухолевых узелков) (на 5-е сут после введения клеток 4Т1 Е6/Е7) мышам опытных групп (n = 10; группы CBD1–CBD3, табл. 1) была сделана первая инъекция иммуногенной композиции подкожно в холку и далее – еще две инъекции с интервалом в 5 сут (трехэтапная иммунизация). Животным контрольной группы (n = 10) по описанной схеме вводили физиологический раствор.

После каждой инъекции иммуногенных композиций у животных опытных групп наблюдалось снижение активности и аппетита, длящееся не более суток, без нарушения прочих физиологических функций. По окончании иммунизации такие состояния больше не отмечались. На 21–24-е сут после инъекции туморогенных клеток 4Т1 Е6/Е7 мыши контрольной группы имели нездоровый внешний вид, начали проявляться признаки истощения и потери массы тела, снижение активности, потускнение и пожелтение волосяных покровов, незначительное увеличение регионарных (относительно произведенной инъекции клеток) лимфоузлов. На 27-е сут после инъекции клеток 4Т1 Е6/Е7 в контрольной группе мышей были зафиксированы три случая летального исхода, наиболее вероятной причиной которых послужило активное разрастание аутографтов с инвазией в брюшную полость и последующим поражением внутренних органов.

На 18-е сут после инъекции клеток 4Т1 Е6/Е7 была детектирована статистически значимая разница между аутографтами контрольной и опытных групп. На основании дальнейших произведенных измерений линейных параметров аутографтов (“ширина” и “длина”) был рассчитан объем аутографтов по формуле (1) и построен график зависимости объема аутографтов от количества суток после инъекции клеток 4Т1 Е6/Е7 (рис. 5а). На 30-е сут после инъекции клеток 4Т1 Е6/Е7 объем аутографтов опытных групп был в среднем в 5 раз меньше, чем объем аутографтов контрольной группы, причем наименьшим объемом среди опытных групп характеризовались аутографты группы CBD1 – до 11 раз меньше, а наибольшими – аутографты группы CBD3 – до 5.2 раз меньше по сравнению с животными контрольной группы.

Рис. 5.

Оценка эффективности иммуногенных композиций CBD1–CBD3 in vivo на экспериментальной модели мышей линии BALB/c с ВПЧ16-ассоциированными опухолями: a – динамика роста аутографтов после трехкратного введения иммуногенных композиций (указаны сутки после инъекции туморогенных клеток 4Т1 Е6/Е7); К – контроль, 1 – CBD-1, 2 – CBD-2, 3 – CBD-3; б – объем терминальных аутографтов: 1 – объем, рассчитанный с использованием двух линейных параметров по формуле (1); 2 – объем, рассчитанный с использованием трех линейных параметров по формуле (2); в – вес терминальных аутографтов; г – динамика появления очагов некроза у аутографтов мышей контрольной и опытных групп (цифры под столбцами – сутки после инъекции туморогенных клеток 4Т1 Е6/Е7); д – внешний вид типичных для каждой группы терминированных животных со сформированными аутографтами (указаны стрелками) и извлеченных аутографтов. *p < 0.05 (статистически значимая разница между контрольной и опытными группами по t-критерию Стьюдента).

По окончании исследований (на 30-е сут после инъекции клеток 4Т1 Е6/Е7) сформированные аутографты извлекали и измеряли третий линейный параметр (“высоту”), с использованием которого был рассчитан их терминальный объем по аппроксимированной формуле объема эллипсоида (2). Благодаря использованию данной формулы было выявлено, что объем аутографтов мышей опытных групп меньше аутографтов мышей контрольной группы в среднем в 8.5 раз; аутографтов группы CBD1– до 18.2 раз, а CBD3– до 8.8 раз (рис. 5б).

По результатам взвешивания терминальных аутографтов было установлено, что аутографты опытных групп легче аутографтов контрольной группы в среднем в 5.7 раз; аутографты группы CBD1 – до 11.5 раз, а CBD3 – до 6 раз (рис. 5в).

Для комплексной оценки противоопухолевого эффекта иммуногенных композиций также следует учитывать внешний вид аутографтов как в процессе мониторинга in vivo, так и после их извлечения по окончании эксперимента. На 18-е сут после инъекции клеток 4Т1 Е6/Е7 по результатам визуального осмотра было детектировано наличие очагов некроза в зоне формирования аутографтов у животных опытных групп в 30–40% случаев, в то время как у аутографтов контрольной группы очаги некроза полностью отсутствовали. На момент завершения эксперимента у аутографтов опытных групп явно детектировался центральный некроз в 60–90% случаев. У аутографтов контрольной группы очаги некроза появились только к 27-м сут после инъекции клеток 4Т1 Е6/Е7, число случаев появления которых возросло до 40% к моменту терминирования (рис. 5г, 5д).

На основании данных, полученных в ходе мониторинга животных, и анализа кривых роста, терминального объема и веса аутографтов можно сделать вывод о наличии потенциального противоопухолевого эффекта у исследуемых иммуногенных композиций CBD1–CBD3. Иммуногенные композиции CBD2 и CBD3, содержащие рекомбинантные антигены Е6-СBD и E7-СBD по отдельности, обладали противоопухолевым эффектом. Однако противоопухолевый эффект композиции CBD1 был выше, следовательно, для достижения наибольшей противоопухолевой активности в состав иммуногенной композиции должны входить оба рекомбинантных антигена Е6-СBD и E7-СBD (композиция CBD1).

Таким образом, в результате проведенных исследований синтезом в E. coli впервые были получены препараты рекомбинантных белков, представляющих собой антигены E6 и E7 ВПЧ 16 типа, соединенные с помощью глицин-серинового спейсера с целлюлозосвязывающим доменом из Anaerocellum thermophilum. Использование данного домена в составе слитных рекомбинантных белков позволило разработать простую и эффективную одностадийную технологию выделения и очистки белковых препаратов.

Наличие антигенных свойств у полученных рекомбинантных белков E6-CBD и E7-CBD подтверждено методом вестерн-блоттинга с использованием коммерческих антител к антигенам Е6 и Е7 ВПЧ16.

Анализ активации гуморального ответа и противоопухолевого эффекта иммуногенных композиций на основе рекомбинантных антигенов E6-CBD и E7-CBD ВПЧ16 в условиях 3-этапной иммунизации мышей линии BALB/c показал, что специфические компоненты иммуногенных композиций – рекомбинантные антигены E6-CBD и E7-CBD – являются высокоиммуногенными и обладают противоопухолевым эффектом in vivo.

Приведенные характеристики позволяют считать полученные в работе новые рекомбинантные антигены E6-CBD и E7-CBD перспективными для изучения возможности их медицинского применения в двух направлениях: 1) в клинической практике – в качестве основных специфических компонентов разрабатываемых терапевтических вакцин для лечения ВПЧ16-ассоциированных неопластических поражений различных локализаций (рак шейки матки, карциномы аногенитального тракта, ротоглотки); 2) в диагностике – при разработке диагностических наборов для выявления антител к белкам Е6 и Е7 у пациентов с ВПЧ16-ассоциированными злокачественными новообразованиями.

Работа выполнена в рамках государственного задания федерального государственного бюджетного учреждения “Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью” Федерального медико-биологического агенства № 388-00102-20-01.