1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Прикладная биохимия и микробиология
  4. T. 57, № 2, 2021

Прикладная биохимия и микробиология, 2021, T. 57, № 2, стр. 117-126

Оптимизация биосинтеза (S)-3-гидроксимасляной кислоты из глюкозы по обращенному пути β-окисления жирных кислот рекомбинатными штаммами Escherichia coli

А. Ю. Гулевич 1, *, А. Ю. Скороходова 1, В. Г. Дебабов 1

1 Федеральный исследовательский центр “Фундаментальные основы биотехнологии” Российской академии наук
117312 Москва, Россия

* E-mail: andrey.gulevich@gmail.com

Поступила в редакцию 01.10.2020
После доработки 26.10.2020
Принята к публикации 02.11.2020

Полный текст (PDF)

Аннотация

Исследован микроаэробный синтез 3-гидроксимасляной кислоты штаммом Escherichia coli BOX3.1 ∆4 PL-atoB PL-tesB (MG1655 lacIQ, ∆ackA-pta, ∆poxB, ∆ldhA, ∆adhE, ∆fadE, PL-SDphi10-atoB, Ptrc-ideal-4-SDphi10-fadB, PL-SDphi10-tesB), ранее направленно сконструированным для биосинтеза целевого соединения из глюкозы по обращенному пути β-окисления жирных кислот. Достигнут выход целевого продукта 0.12 моль/моль. Инактивация в штамме гена неспецифичной тиоэстеразы YciA приводила к росту выхода 3-гидроксимасляной кислоты до 0.15 моль/моль. Для оптимизации биосинтеза продукта был сконструирован штамм MGΔ4 PL-tesB (MG1655 ∆ackA-pta, ∆poxB, ∆ldhA, ∆adhE, PL-SDphi10-tesB), в котором была дополнительно обеспечена экспрессия генов, кодирующих ключевые ферменты β-окисления жирных кислот в составе плазмиды pMW118m-atoB-fadB. Уровень микроаэробного синтеза 3-гидроксимасляной кислоты из глюкозы штаммом MGΔ4 PL-tesB (pMW118m-atoB-fadB) в тестовых условиях достигал 0.35 моль/моль. Инактивация в штамме гена неспецифичной тиоэстеразы YciA приводила к незначительному снижению побочной продукции ацетата. Последующая инактивация в штамме гена неспецифичной тиоэстеразы YdiI практически не влияла на уровень синтеза побочных продуктов. Контролируемые условия культивирования сконструированного штамм MGΔ4 PL-tesB ΔyciA (pMW118m-atoB-fadB) в биореакторе позволили достичь выхода 3-гидроксимасляной кислоты из глюкозы, составляющего 0.75 моль/моль.

Ключевые слова: 3-гидроксимасляная кислота, β-окисление жирных кислот, метаболическая инженерия, Escherichia coli

Полезные свойства многих промышленно значимых и физиологически активных веществ, обладающих высокой добавленной стоимостью, определяются наличием в составе соответствующих молекул хиральных центров, обуславливающих существование оптических изомеров химически идентичных соединений. Получение оптически чистых энантиомеров в рамках стереоселективного органического синтеза зачастую является нетривиальной задачей, требующей использования дорогостоящих катализаторов, жестких физических условий и агрессивных растворителей. Использование в качестве стартового материала удобных хиральных синтонов значительно упрощает задачу эффективного синтеза целевого продукта.

В частности, энантиомеры 3-гидроксимасляной кислоты (3-ГМК) могут служить в качестве удобного стартового материала для получения таких значимых оптически активных соединений, как лекарственные препараты, феромоны, косметические средства, душистые вещества и агрохимикаты [1–4]. В норме стереоизомеры 3-ГМК не секретируются известными микроорганизмами при утилизации сахаров. Тем не менее, их микробиологический синтез из дешевого возобновляемого сырья может служить экономически оправданной альтернативой энерго- и ресурсозатратному [5] химическому способу получения соответствующих соединений при использовании направленно сконструированных высокоэффективных микробных штаммов-продуцентов. Действительно, в последние годы была продемонстрирована принципиальная возможность рациональной инженерии такой традиционной для промышленной биотехнологии бактерии как Escherichia coli для биосинтеза из глюкозы как (R)- [6, 7], так и (S)-3-ГМК [7, 8].

Соответствующий биохимический путь, ведущий к формированию целевого соединения, представляет собой последовательность реакций, включающих начальную конденсацию двух молекул предшественника, ацетил-КоА в ацетоацетил-КоА, дальнейшее восстановление ацетоацетил-КоА в 3-гидроксибутирил-КоА и финальный гидролиз тиоэфирной связи последнего с образованием 3-ГМК. Данные реакции катализируются ацетил-КоА-С-ацетилтрансферазой (КФ 2.3.1.9), НАДФН-зависимой (R)-3-гидроксиацил-КоА-дегидрогеназой (КФ 1.1.1.36) либо НАДН-зависимой (S)-3-гидроксиацил-КоА-дегидрогеназой (КФ 1.1.1.35), и тиоэстеразой (КФ 3.1.2.20). Таким образом, основные реакции образования ключевого хирального интермедиата, 3-гидроксибутирил-КоА, могут рассматриваться как аналогичные таковым биосинтеза 3-гидроксибутирата, в первую очередь у ралстоний, в случае (R)-стереоизомера и биосинтеза 1-бутанола у клостридий в случае (S)-стереоизомера. Этим объясняется выбор определенных гетерологичных ферментов, использованных для достижения синтеза того или иного стереоизомера 3-ГМК в рекомбинантных штаммах, (R)-3-гидроксиацил-КоА-дегидрогеназы PhaB из Ralstonia eutropha [6, 7] и (S)-3-гидроксиацил-КоА-дегидрогеназы Hbd из Clostridium acetobutylicum [7, 8]. Вместе с тем, клостридиальные реакции биосинтеза 1-бутанола с биохимической точки зрения подобны обращенным реакциям цикла β-окисления жирных кислот (БОЖК), биохимического пути существующего у множества микроорганизмов. Экспериментально, функциональная обратимость БОЖК была показана в ряде исследований, демонстрирующих продукцию по данному пути рекомбинантными штаммами E. coli из глюкозы или глицерина различных алифатических карбоновых кислот с различной длиной цепи, а также спиртов [9–12]. Следовательно, (S)-3-ГМК может быть синтезирована E. coli из глюкозы в результате частичного однократного обращения БОЖК при оверэкспрессии подходящей тиоэстеразы без необходимости использования каких-либо чужеродных генов.

Действительно, ранее был сконструирован штамм BOX3.1 ∆4 PL-atoB PL-tesB, производный от штамма E. coli дикого типа MG1655, способный к энантиоселективному биосинтезу из глюкозы (S)-3-ГМК по обращенному БОЖК [13]. В данном штамме нативные AtoC и FadR-зависимые регуляторные области генов atoB и fadB, кодирующих ацетил-КоА С-ацетилтрансферазу и бифункциональную (S)-3-гидроксиацил-КоА-дегидрогеназу/еноил-КоА-гидратазу (КФ 1.1.1.35/КФ 4.2.1.17), были заменены искусственными регуляторными элементами, включающими эффективный сайт связывания рибосом гена φ10 из фага Т7, а также промоторы PL фага лямбда и Ptrc-ideal-4 [14], соответственно. Кроме того, в штамме были инактивированны, за счет делеций генов ackA-pta, poxB, ldhA и adhE, основные пути смешано-кислотного брожения, конкурирующие с обращенным БОЖК за восстановленные эквиваленты и ключевые метаболиты-предшественники, пируват и ацетил-КоА. Множественные раунды обращения БОЖК в штамме были предотвращены вследствие делеции гена fadE, кодирующего ацил-КоА дегидрогеназу (КФ 1.3.99.3), а формирование 3-ГМК из прямого КоА-предшественника было обеспечено в результате оверэкспрессии гена тиоэстеразы II, tesB.

Тем не менее, несмотря на способность штамма BOX3.1 ∆4 PL-atoB PL-tesB синтезировать (S)-3-ГМК стереоселективно с относительно высоким выходом, достигающим в определенных условиях 66% от теоретического максимума, наблюдаемая секреция штаммом уксусной кислоты в качестве основного побочного продукта утилизации глюкозы предполагала возможность дальнейшей метаболической инженерии штамма либо его реконструированных аналогов для оптимизации синтеза целевого вещества.

Цель работы – оптимизация биосинтеза (S)-3-гидроксимасляной кислоты из глюкозы по обращенному пути β-окисления жирных кислот рекомбинатными штаммами Escherichia coli.

МЕТОДИКА

Реактивы. В работе использовали рестриктазы, ДНК полимеразу Taq, Т4 ДНК лигазу (“Thermo Scientific”, Литва), высокоточную ДНК полимеразу Phusion (“Thermo Scientific”, Финляндия), набор для сборки по Гибсону HiFi Builder и высокоточную ДНК полимеразу Q5 (“New England Biolabs”, США) и набор для сайт-направленного мутагенеза QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit (“Agillent Technologies”, США). ПЦР-продукты очищали электрофорезом в агарозном геле и выделяли с помощью QIAquick Gel Extraction Kit (“Qiagen”, США). Олигонуклеотиды (“Евроген”, Россия) представлены в табл. 1. Компоненты питательных сред, соли и другие реактивы были произведены фирмами “Panreac” (Испания) и “Sigma” (США).

Таблица 1.  

Олигонуклеотидные праймеры, использованные в работе

№ Последовательность
P1 5'-catgtctacaacacataacgtccctcagggcgatctcgctcaagttagtataaaaaagctgaac-3'
P2 5'-ttactcaacaggtaaggcgcgaggttttccttcaggtgaagcctgcttttttatactaagttgg-3'
P3 5'-aatgatatggaaacggaaaatcaccctggaagcactcgctcaagttagtataaaaaagctgaac-3'
P4 5'-tcacaaaatggcggtcgtcaatcgtgacgaacagctgaagcctgcttttttatactaagttgg-3'
P5 5'-cgtgaaggtgtcagtgcgttc-3'
P6 5'-gtgacggtcatggtcactacagc-3'
P7 5'-gatattcctgccgtagccagg-3'
P8 5'-caagttgagtagacatagcatcctcg-3'
P9 5'-ctatttcttccagaattgccatgattttttc-3'
P10 5'-gctcacgctgtaggtatctcagttc-3'
P11 5'-aatcatggcaattctggaagaaataggcggccgccggttctgaaatttctgaaatgagctgttgacattgtgagcgctcacaattat-3'
P12 5'-gcaaaggtaccctcgaggatgtcgactcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacattataattgtgagcgctcacaatgtc-3'
P13 5'-gtcgacatcctcgagggtacctttgcctggcggcagtagcg-3'
P14 5'-cgaactgagatacctacagcgtgagcgcatgcaagagtttgtagaaacgcaaaaaggc-3'
P15 5'-gaatcaaagctgccgacaacac-3'
P16 5'-gcttggagcgaacgacctac-3'
P17 5'-attagtcgacatggctagatctaaaaattgtgtcatcgtcagtgc-3'
P18 5'-attaggtacctcgagctccttaggatccattcaaccgttcaatcaccatcg-3'
P19 5'-attagtcgacatggctagatctctttacaaaggcgacaccctgta-3'
P20 5'-tccatgatgatggtgatgatgagccgttttcaggtcgccaacc-3'
P21 5'-attaggtacctcgagctccttaggatccatgatgatggtgatgatg-3'
P22 5'-ctggaacagcaatcagacctaaaagggctgctgc-3'
P23 5'-gcagcagcccttttaggtctgattgctgttccag-3'
P24 5'- gtttaatcgcctggaagacctgccggtgccgaccattg-3'
P25 5'-caatggtcggcaccggcaggtcttccaggcgattaaac-3'

Бактериальные штаммы, плазмиды и среды. Штамм E. coli K-12 MG1655 (ВКПМ B-6195), ранее сконструированный штамм E. coli MGΔ4 [15], являющийся производным штамма MG1655 лишенным путей смешанно-кислотного брожения, и ранее сконструированный штамм E. coli BOX3.1 ∆4 PL-atoB PL-tesB [13], с измененной регуляцией экспрессии генов, кодирующих ферменты аэробного β-окисления жирных кислот и тиоэстеразу II, также лишенный путей смешанно-кислотного брожения, были использованы в качестве исходных для конструирования всех полученных в работе штаммов. Использованные в работе бактериальные штаммы и плазмиды представлены в табл. 2. Для культивирования бактерий применяли полноценные среды LB, SOB, SOC и минимальную среду М9 [16], при необходимости в них добавляли ампициллин (100 мкг/мл) или хлорамфеникол (30 мкг/мл).

Таблица 2.  

Штаммы и плазмиды

Объект Генотип Ссылка
Штамм    
MG1655 Штамм E. coli дикого типа (ВКПМ B-6195) ВКПМ
DH5alpha F-, Δ(argF-lac)169, φ80dlacZ58(M15), phoA8, glnX44(AS), λ–, deoR481, rfbC1, gyrA96(NalR), recA1, endA1, thiE1, hsdR17 CGSC#: 14231
BOX3.1 ∆4 PL-atoB PL-tesB E. coli MG1655 lacIQ, ∆ackA-pta, ∆poxB, ∆ldhA, ∆adhE, ∆fadE, PL-SDphi10-atoB, Ptrc-ideal-4-SDphi10-fadB, PL-SDphi10-tesB [13]
BOX3.1 Δ4 PL-atoB PL-tesB ΔyciA E. coli MG1655 lacIQ, ∆ackA-pta, ∆poxB, ∆ldhA, ∆adhE, ∆fadE, PL-SDphi10-atoB, Ptrc-ideal-4-SDphi10-fadB, PL-SDphi10-tesB, ∆yciA Данная работа
MGΔ4 E. coli MG1655 ∆ackA-pta, ∆poxB, ∆ldhA, ∆adhE [15]
MGΔ4 PL-tesB E. coli MG1655 ∆ackA-pta, ∆poxB, ∆ldhA, ∆adhE, PL-SDphi10-tesB Данная работа
MGΔ4 PL-tesB ΔyciA E. coli MG1655 ∆ackA-pta, ∆poxB, ∆ldhA, ∆adhE, PL-SDphi10-tesB, ∆yciA Данная работа
MGΔ4 PL-tesB ΔyciA ΔydiI E. coli MG1655 ∆ackA-pta, ∆poxB, ∆ldhA, ∆adhE, PL-SDphi10-tesB, ∆yciA, ∆ydiI Данная работа
Плазмида    
pMW118-(λattL-Cm-λattR) pSC101, bla, cat, λattL-cat-λattR [18]
pKD46 pINT-ts, bla, ParaB-λgam-bet-exo [17]
pMWts-Int/Xis pSC101-ts, bla, PR-λxis-int, cIts857 [19]
pMW118 pSC101, bla GenBank
AB005475
pMW118m pMW118, NotI-Ptrc-ideal-2-SDlacZ-SalI-XhoI-KpnI-TrrnB-SphI Данная работа
pMW118m-atoB-fadB pMW118, Ptrc-ideal-2-SDlacZ-atoB-fadB-TrrnB Данная работа

Конструирование штаммов. Инактивацию генов yciA и ydiI в хромосоме E. coli осуществляли с использованием методики, описанной ранее [17].

Линейные фрагменты ДНК для инактивации целевых генов, содержащие маркер устойчивости к хлорамфениколу (ген cat), получали при помощи ПЦР с использованием пар праймеров P1 и P2, P3 и P4, и плазмиды pMW118-(λattL-Cm-λattR) [18] в качестве матрицы. Полученные фрагменты ДНК были индивидуально интегрированы в хромосому штамма E. coli MG1655, несущего плазмиду-помощник pKD46. Факт соответствия предполагаемых и полученных экспериментально структур хромосом отобранных штаммов, с индивидуально инактивированными генами yciA и ydiI, подтверждали ПЦР-анализом с помощью пар локус-специфичных праймеров P5 и P6, P7 и P8.

Штаммы BOX3.1 Δ4 PL-atoB PL-tesB ΔyciA, MGΔ4 PL-tesB, MGΔ4 PL-tesB ΔyciA и MGΔ4 PL-tesB ΔyciA ΔydiI были получены при введении индивидуальных модификаций в хромосомы целевых штаммов с помощью P1-зависимых трансдукций [16]. В случае штамма MGΔ4 PL-tesB использовали ранее полученный препарат трансдуцирующего фага, несущего соответствующую генетическую модификацию [13]. Удаление маркера, фланкированного att-сайтами фага лямбда, из хромосом целевых штаммов, проводили с использованием плазмиды pMWts-Int/Xis, как описано ранее [19]. Трансформацию штаммов плазмидами осуществляли по стандартной методике.

Конструирование плазмид. Плазмида pMW118m, производная низкокопийного вектора pMW118, содержащая генетическую конструкцию NotI-Ptrc-ideal-2-SDlacZ-SalI-XhoI-KpnI-TrrnB-SphI, была получена методом сборки по Гибсону. Необходимые линейные фрагменты ДНК, обладающие требуемыми областями фланговой гомологии, были получены ПЦР с использованием пар специфичных праймеров. Линеаризованный вектор pMW118mod получали в результате ПЦР с плазмидой pMW118, использованной в качестве матрицы, и комплементарными ее целевым областям праймерами P9 и P10. Фрагмент ДНК, содержащий 5'-концевую область гомологии с фланговым участком линеаризованного вектора pMW118mod, сайт узнавания NotI, промотор Ptrc-ideal-2 (Olac-ideal-Ptrc/Olac-ideal) [14], SD гена lacZ, сайты узнавания SalI, XhoI, KpnI и короткую 3'-концевую область гомологии с 5'-концевым участком терминатора rrnB оперона, был получен с помощью ПЦР с праймерами P11 и P12, обладающими областями взаимной комплементарности. Фрагмент ДНК, включающий сайты узнавания SalI, XhoI, KpnI, терминатор rrnB оперона E. coli, сайт узнавания SphI и последовательность, гомологичную фланговому участку линеаризованного вектора pMW118mod, получали в результате ПЦР с использованием праймеров P13 и P14 и хромосомной ДНК E. coli в качестве матрицы.

ПЦР фрагменты очищали и добавляли к реакционной смеси набора NEB HiFi Builder, содержащей экзонуклеазу, высокоточную ДНК-полимеразу и ДНК-лигазу. Для отбора целевых ковалентно-замкнутых плазмидных ДНК, полученной реакционной смесью трансформировали клетки E. coli DH5alpha, с последующей селекцией трансформантов на среде, содержащей ампициллин. Соответствие запланированных и экспериментально полученных структур искусственного генетического элемента NotI-Ptrc-ideal-2-SDlacZ-SalI-XhoI-KpnI-TrrnB-SphI в серии плазмид, выделенных из отобранных ApR-трансформантов, подтверждали секвенированием с использованием праймеров P15, P16.

Гены atoB и fadB первоначально были клонированы в составе вектора pUC18. С этой целью кодирующие области соответствующих генов были амплифицированы с помощью ПЦР с использованием пар праймеров P17, P18, в случае гена atoB, а также P19, P20, и затем P19, P21, в случае гена fadB, и хромосомной ДНК штамма E. coli MG1655 в качестве матрицы. Дизайн праймеров предполагал, что в результате подобной амплификации кодирующие области генов будут дополнительно содержать на флангах сайты узнавания BglII и BamHI, расположенные, соответственно, непосредственно после старт- и непосредственно перед стоп-кодоном, а также сайты узнавания SalI, расположенные на 5'-концах и сайты узнавания XhoI и KpnI, расположенные на 3'-концах ампликонов. Полученные фрагменты ДНК были, впоследствии, клонированы в составе вектора pUC18 по сайтам SalI и KpnI и секвенированы. Природные сайты узнавания BglII, расположенные в кодирующей области гена fadB, были далее элиминированы в результате двухэтапного сайт-направленного мутагенеза с использованием QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit (“Agillent Technologies”, США). Для этого плазмида с клонированным геном fadB была амплифицирована в ходе ПЦР с использованием локус-специфичных праймеров P22 и P23, обработана рестриктазой DpnI, и подвержена второму раунду ПЦР с праймерами P24 и P25. После трансформации полученной реакционной смесью клеток штамма E. coli DH5alpha, последующей селекции ApR клонов и выделения из них кольцевых плазмидных ДНК, последние были секвенированы и отобрана плазмида, содержащая корректную последовательность гена fadB. В дальнейшем гены atoB и fadB были переклонированы из соответствующих pUC-производных плазмид в состав плазмиды pMW118m-atoB-fadB под контроль промотора Ptrc-ideal-2 и SDlacZ с использование рестрикционных сайтов AatII, SalI и XhoI.

Культивирование штаммов. Рекомбинантные штаммы выращивали в течение ночи в среде М9, содержащей 2 г/л глюкозы, при 37°C. Для первичного микроаэробного культивирования по 5 мл полученных ночных культур разбавляли в 10 раз, добавляя 45 мл среды М9, содержащей 10 г/л глюкозы и 10 г/л дрожжевого экстракта. Полученные культуры инкубировали в колбах объемом 750 мл, закрытых невентилируемыми пробками на роторной качалке при 250 об./мин в течение 8 ч при 37°C. Насыщение среды кислородом оценивали в контрольных колбах с соответствующими культурами при инкубации в присутствии резазурина. Для индукции экспрессии генов, находящихся под контролем LacI-зависимых промоторов Ptrc-ideal-2 и Ptrc-ideal-4, спустя 3 ч от начала инкубации в среды культивирования добавляли изопропил-β-D-тиогалактозид (ИПТГ) до конечной концентрации 1.0 мМ. При выращивании штаммов, содержащих pMW118-производные плазмиды, в среды дополнительно вносили 100 мкг/мл ампициллина (ООО “Синтез”, Россия).

Контролируемое микроаэробное культивирование проводили в биореакторе, как описано ранее [13]. Использовали комбинированную среду, содержащую (г/л): триптон – 10, дрожжевой экстракт – 5.0, Na2HPO4 ⋅ 12H2O – 15.1, KH2PO4 – 3.0, NH4Cl – 1.0, NaCl – 0.5, CaCl2 ⋅ 2H2O – 0.015, MgSO4 ⋅ 7H2O – 0.5 и 5 мг/л тиамина. Аэробную фазу накопления биомассы проводили в течение 7 ч при 37°C и 850 об./мин с потоком воздуха 0.5 л/мин. Индуцировали экспрессию генов, находящихся под контролем LacI-зависимых промоторов через 3 ч инкубации. Микроаэробную продуктивную фазу инициировали добавлением в среду глюкозы до концентрации 25 г/л, изменением оборотов мешалки до 250 об./мин, и снижением потока воздуха до 0.1 л/мин.

Собранные для анализа клеточные суспензии центрифугировали при 10 000 g в течение 10 мин. В полученных супернатантах определяли концентрации секретированных метаболитов и остаточной глюкозы. Все эксперименты повторялись не менее трех раз.

Аналитические методы. Концентрации органических кислот в культуральных жидкостях, освобожденных от биомассы центрифугированием, определяли методом ВЭЖХ с использованием системы “Waters” HPLC system (США). Применяли ион-эксклюзионную колонку Rezex ROA-Organic Acid H+ (8%) (“Phenomenex”, США) с детекцией при длине волны 210 нм. В качестве подвижной фазы использовали водный раствор серной кислоты (2.5 мМ) со скоростью потока 0.5 мл/мин. Для измерения концентрации глюкозы, система была укомплектована рефрактивным детектором “Waters” 2414 и колонкой Spherisorb-NH2 (“Waters”, США). Подвижной фазой служила смесь ацетонитрил/вода (объемное соотношение 75/25) при скорости потока 1.0 мл/мин.

Идентификацию и количественный анализ содержания 3-ГМК в культуральных жидкостях осуществляли методом хромато-масс-спектрометрии по ранее разработанным методикам [13]. Использовали газовый хроматограф Agilent 6890N, оснащенный автосамплером 7683B и масс-селективным детектором Agilent 5975, укомплектованный капиллярной колонкой DB-5MS (“Agilent”, США) длиной 30 м, внутренним диаметром 0.25 мм и толщиной пленки 0.25 мкм. В качестве газа носителя использовался гелий со скоростью потока 1.0 мл/мин. Пробу 1 мкл вводили в испаритель в режиме деления потока 1 : 50. Температура испарителя составляла 230°C. Использовали следующую температурную программу термостата колонки: начальная изотерма 1 мин при 60°C, последующий градиент до 120°C со скоростью 3°C/мин, затем до 220°C со скоростью 20°C/мин, финальная изотерма 1 мин при 220°C. Применяли ионизацию электронами (электронный удар, 70 eV) при режиме работы масс-селективного детектора с контролем заданных ионов (117.10 m/z, 131.10 m/z, 147.10 m/z, 191.10 m/z). Температура ионного источника была установлена на 230°C. Пробоподготовка включала экстракцию аналита из культуральной жидкости, упаривание экстрактов в токе азота и дериватизацию с получением триметилсилильных производных. Полученные данные обрабатывали с помошью Agilent MSD ChemStation Software. Для идентификации целевого аналита использовались библиотечные данные (индекс удерживания и масс-спектр). Количественный анализ осуществляли с использованием соответствующего стандарта.

Энантиомерную форму синтезированной штаммами 3-ГМК определяли с помощью хиральной газовой хроматографии с пламенно-ионизационным детектором, используя колонку “Agilent” CP-Chirasil-Dex CB (длина 25 м, 0.25 мм внутренний диаметр, толщина пленки 0.25 мкм). Проводили предварительную дериватизацию аналита с получением метилового эфира 3-ацетоксимасляной кислоты. В качестве стандартов использовали ацетилированные коммерчески доступные метиловые эфиры (R)- и (S)-3-ГМК (“Sigma-Aldrich”, США). Использовали газовый хроматограф Shimadzu GC-2010 (Япония), оснащенный автосамплером AOC-5000. В качестве газа-носителя использовали гелий со скоростью потока 1.0 мл/мин. Применяли режим ввода с делением потока (1 : 20, объем пробы 1 мкл). Температура инжектора составляла 200°C, термостата колонки – 110°C, детектора – 250°C. Обработку данных осуществляли с использованием программы GCsolution (“Shimadzu”, Япония).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Биосинтез 3-ГМК по обращенному БОЖК из двух молекул ацетил-КоА требует расхода одного восстановленного эквивалента НАДН. Гликолитическая утилизация глюкозы приводит к формированию двух молекул пирувата и сопровождается генерацией двух НАДН. Анаэробная конверсия пирувата в ацетил-КоА под действием пируватформиатлиазы (КФ 2.3.1.54) не сопровождается образованием НАДН, в то время как при аэрации действие пируватдегидрогеназы (КФ 1.2.4.1/2.3.1.12/1.8.1.4) приводит к формированию дополнительной молекулы НАДН на каждый образующийся ацетил-КоА. Соответственно, у штаммов E. coli лишенных способности к брожению уровень анаэробного формирования НАДН будет превосходить необходимый для эффективного биосинтеза 3-ГМК. Кроме того, известно, что клетки E. coli с инактивированными генами pta, ldhA и adhE не способны к анаэробному росту [20]. В результате, при анаэробиозе гликолиз у подобных штаммов, сконструированных для продукции 3-ГМК, будет подавляться не только повышенным внутриклеточным пулом НАДН, но и избыточной генерацией АТФ [21]. С другой стороны, в присутствии кислорода, внутриклеточная доступность НАДН, требующегося для биосинтеза 3-ГМК, будет лимитироваться активностью дыхательной цепи переноса электронов. Таким образом, ни полностью анаэробные, ни аэробные условия не могли рассматриваться как оптимальные для биосинтеза 3-ГМК из глюкозы по обращенному БОЖК ранее сконструированным штаммом BOX3.1 ∆4 PL-atoB PL-tesB.

Действительно, при первичной характеристике, штамм BOX3.1 ∆4 PL-atoB PL-tesB в аэробных условиях не синтезировал из глюкозы заметных количеств 3-ГМК, а при анаэробиозе продукция целевого вещества была довольно низкой [13]. В настоящей работе биосинтетический потенциал штамма исходно оценивали при микроаэробном культивировании. В таких условиях штамм, в зависимости от индукции экспрессии гена fadB, находящегося под контролем LacI-зависимого промотора, синтезировал из глюкозы от 2.9 до 4.9 мМ 3-ГМК с молярным выходом 0.07–0.12 моль/моль (табл. 3). При этом основную часть потребленной глюкозы штамм секретировал в виде пировиноградной и уксусной кислот. Формирование штаммом 3-ГМК, наблюдаемое в отсутствии индукции экспрессии гена fadB, могло объясняться определенной “протечкой” промотора Ptrc-ideal-4 [14], тогда как мало зависящий от индукции синтеза 3-ГМК уровень секреции пировиноградной и уксусной кислот мог являться следствием ряда причин. В первую очередь, к повышенной секреции данных предшественников в синтезе 3-ГМК мог приводить недостаток в штамме внутриклеточного НАДН. Однако, накопление штаммом заметных количеств сукцината и малата указывало на то, что условия культивирования штамма были достаточно “безкислородными” для формирования соответствующих дикарбоксилатов в результате функционирования восстановительной ветви цикла трикарбоновых кислот, обычно активной в условиях анаэробиоза. Повышенный уровень синтеза штаммом ацетата, при относительно невысоком формировании 3-ГМК, мог быть следствием как недостаточной активности оверэкспрессированных в штамме ферментов БОЖК, так и результатом активности неспецифичных тиоэстераз, отличных от направленно сверхэкспрессированной тиоэстеразы II (TesB). Действительно, клетки E. coli природно обладают как минимум восемью тиоэстеразами, способными гидролизовать тиоэфирную связь КоА-производных с образованием соответствующих карбоксилатов. Среди них тиоэстеразы YciA, YbgC и YdiI демонстрируют довольно широкую субстратную специфичность в отношении ацил-производных кофермента А [10, 22, 23]. При этом YciA проявляет максимальную активность в отношении ацетил-КоА [10].

Таблица 3.

Концентрации и молярные выходы метаболитов секретированных сконструированными штаммами при микроаэробной утилизации глюкозы*

Штамм ИПТГ Пируват Ацетат Малат Сукцинат 3-ГМК
мМ моль/моль мМ моль/моль мМ моль/моль мМ моль/моль мМ моль/моль
BOX3.1 Δ4 PL-atoB PL-tesB – 23.2 ± 1.6 0.57 19.2 ± 1.2 0.47 0.9 ± 0.1 0.02 1.1 ± 0.1 0.03 2.9 ± 0.2 0.07
+ 20.6 ± 1.3 0.49 20.4 ± 1.3 0.49 0.9 ± 0.1 0.02 0.9 ± 0.1 0.02 4.9 ± 0.3 0.12
BOX3.1 Δ4 PL-atoB PL-tesB ΔyciA – 24.4 ± 1.7 0.60 16.0 ± 1.0 0.39 1.0 ± 0.1 0.02 1.0 ± 0.1 0.02 3.5 ± 0.2 0.09
+ 21.6 ± 1.5 0.51 16.8 ± 1.2 0.40 0.9 ± 0.1 0.02 0.9 ± 0.1 0.02 6.1 ± 0.4 0.15
MGΔ4 PL-tesB
(pMW118m-atoB-fadB) 		– 6.7 ± 0.4 0.16 18.7 ± 1.3 0.44 1.0 ± 0.1 0.02 1.3 ± 0.1 0.03 13.9 ± 0.8 0.32
+ 4.6 ± 0.3 0.11 17.6 ± 1.1 0.41 0.8 ± 0.1 0.02 1.4 ± 0.2 0.03 14.9 ± 0.9 0.35
MGΔ4 PL-tesB ΔyciA
(pMW118m-atoB-fadB) 		– 8.5 ± 0.6 0.19 13.6 ± 0.9 0.31 1.0 ± 0.1 0.02 1.3 ± 0.1 0.03 15.6 ± 1.0 0.36
+ 6.5 ± 0.5 0.15 12.1 ± 0.7 0.27 0.9 ± 0.1 0.02 1.2 ± 0.1 0.03 17.0 ± 1.2 0.38
MGΔ4 PL-tesB ΔyciA ΔydiI
(pMW118m-atoB-fadB) 		– 8.1 ± 0.6 0.18 14.2 ± 1.0 0.32 0.9 ± 0.1 0.02 1.3 ± 0.1 0.03 15.3 ± 0.9 0.35
+ 6.3 ± 0.4 0.15 12.4 ± 0.8 0.28 1.0 ± 0.1 0.02 1.0 ± 0.1 0.02 16.9 ± 1.1 0.38

* Приведены стандартные отклонения для трех независимых экспериментов.

Для оценки эффективности потенциальных подходов к улучшению синтеза 3-ГМК в штамме BOX3.1 ∆4 PL-atoB PL-tesB был первично инактивирован ген yciA. В результате данной модификации выход 3-ГМК и уровень синтеза соответствующего соединения производным штаммом BOX3.1 Δ4 PL-atoB PL-tesB ΔyciA возросли практически на 20%, тогда как выход и уровень синтеза ацетата снизились на то же значение (табл. 3). Тем не менее, уровень секреции штаммом пирувата был неизменным, а ацетат оставался основным продуктом секретированным штаммом в ходе утилизации глюкозы. Данный факт свидетельствовал о том, что, по-видимому, именно внутриклеточный уровень белков катализирующих реакции БОЖК лимитировал продукцию 3-ГМК сконструированным штаммом. Несмотря на то, что промотор PL фага лямбда, контролирующий в штамме экспрессию гена ацетил-КоА С-ацетилтрансферазы atoB, является одним из “сильнейших” для E. coli, а промотор Ptrc-ideal-4, расположенный перед геном 3-гидроксиацил-КоА дегидрогеназы (fadB) мало уступает ему по “силе” [14], хромосомная экспрессия единичных копий соответствующих генов не могла, очевидно, обеспечить в штамме форсированного протекания реакций обращенного БОЖК, способствующего повышенному синтезу целевого соединения.

Для проверки правомочности данной гипотезы гены atoB и fadB были клонированы в составе экспрессионного вектора pMW118m-atoB-fadB, под контролем промотора Ptrc-ideal-2, и первоначально экспрессированы в специально сконструированном штамме MG∆4 PL-tesB. За исключением уровня экспрессии соответствующих генов, кодирующих ферменты БОЖК, полученный штамм MG∆4 PL-tesB (pMW118m-atoB-fadB) был практически изогенен штамму BOX3.1 ∆4 PL-atoB PL-tesB. Отличия заключались в отсутствии в штамме MG∆4 мутации lacIQ и в наличии интактного гена fadE. Однако, в отсутствии в среде жирных кислот экспрессия генов fad-регулона, в том числе fadE, репрессируется в E. coli транскрипционным регулятором FadR и активность соответствующих ферментов в клетке отсутствует [24]. Также, наблюдаемая в LacIQ штамме BOX3.1 ∆4 PL-atoB PL-tesB “протечка” промотора Ptrc-ideal-4 не позволяла ожидать строгой репрессии, за счет данного свойства штамма, аналогичного по характеристикам промотора Ptrc-ideal-2 [14] при его расположении в составе плазмиды.

Действительно, в ходе микроаэробной утилизации глюкозы штамм MG∆4 PL-tesB (pMW118m-atoB-fadB) секретировал сходные количества метаболитов вне зависимости от присутствия в среде ИПТГ (табл. 3). Вместе с тем, количество синтезированной штаммом MG∆4 PL-tesB (pMW118m-atoB-fadB) 3-ГМК и выход этого соединения возросли практически в 3 раза, до 14.9 мМ и 0.35 моль/моль, по сравнению с соответствующими показателями, 4.9 мМ и 0.12 моль/моль, демонстрируемыми штаммом BOX3.1 ∆4 PL-atoB PL-tesB при индукции. Рост синтеза штаммом 3‑ГМК произошел, в первую очередь, за счет резкого снижения секреции пирувата, тогда как уровень образования ацетата снизился незначительно. Таким образом, повышение формирования 3-ГМК штаммом MG∆4 PL-tesB (pMW118m-atoB-fadB) являлось результатом интенсификации потока углерода через ацетил-КоА и вовлекающие его последующие реакции обращенного БОЖК. Это было следствием увеличенного синтеза в клетке белков AtoB и FadB, достигнутого при плазмидной экспрессии соответствующих генов. Тем не менее, выход 3-ГМК синтезированной штаммом MG∆4 PL-tesB (pMW118m-atoB-fadB) был далек от теоретического максимума, 1 моль/моль, а секреция ацетата оставалась значительной.

Делеция гена, кодирующего основную неспецифичную тиоэстеразу YciA, не привела, однако, к выраженному падению секреции ацетата соответствующим производным штаммом MGΔ4 PL-tesB ΔyciA (pMW118m-atoB-fadB) (табл. 3). Можно предположить, что за гидролиз тиоэфирной связи ацетил-КоА с образованием ацетата в штамме MGΔ4 PL-tesB ΔyciA (pMW118m-atoB-fadB) были ответственны другие неспецифичные тиоэстеразы. В качестве такой тиоэстеразы, в первую очередь, могла быть рассмотрена YdiI, обладающая заметно меньшей активностью по отношению к ацетил-КоА, нежели YciA (0.222 мкг/мг/мин), составляющей 0.036 мкг/мг/мин, но сравнимой с таковой для оверэкспрессированной в штамме TesB (0.030 мкг/мг/мин) [10]. В дальнейшем ген ydiI был инактивирован в штамме MGΔ4 PL-tesB ΔyciA (pMW118m-atoB-fadB). При микроаэробной утилизации глюкозы полученный штамм MGΔ4 PL-tesB ΔyciA ΔydiI (pMW118m-atoB-fadB) синтезировал, вне зависимости от присутствия в среде ИПТГ, количества 3-ГМК и ацетата аналогичные таковым родительского штамма MGΔ4 PL-tesB ΔyciA (pMW118m-atoB-fadB) (табл. 3). Таким образом, секреция ацетата штаммом MGΔ4 PL-tesB ΔyciA ΔydiI (pMW118m-atoB-fadB) была обусловлена, по-видимому, побочной активностью оверэкспрессированой тиоэстеразы II.

Известно, что анаэробная утилизация жирных кислот клетками E. coli по БОЖК невозможна без наличия в среде внешнего акцептора электронов [25]. Таким образом, несмотря на отсутствие прямых свидетельств, можно было предположить, что активность ферментов БОЖК, нуждающихся в участии кофакторов НАДН/НАД+, может, в той или иной степени, подавляться высоким внутриклеточным пулом НАДН. Поддержание оптимального внутриклеточного окислительно-восстановительного баланса по этой причине, очевидно, является ключевым условием эффективного синтеза целевых продуктов по обращенному БОЖК. При микроаэробном культивировании в колбах, насыщение среды кислородом не может поддерживаться на постоянном уровне и, как отмечалось выше, достигаемые в итоге условия инкубации штаммов были анаэробными. Ранее было показано, что оптимальные условия для биосинтеза 3-ГМК из глюкозы штаммом BOX3.1 ∆4 PL-atoB PL-tesB достигались при проведении продуктивной фазы в биореакторе с поддержкой постоянного насыщения среды низким уровнем кислорода [13], поэтому биосинтетические характеристики штамма MGΔ4 PL-tesB ΔyciA (pMW118m-atoB-fadB) оценивали при реализации процессов роста и биосинтеза 3-ГМК в ферментере, как описано в разделе Методика.

В биореакторе штамм MGΔ4 PL-tesB ΔyciA (pMW118m-atoB-fadB) к концу инкубации синтезировал из глюкозы ~104 мМ 3-ГМК с выходом, достигающим 0.75 моль/моль (рис. 1) и энантиомерным избытком (S)-стереоизомера >99.5%. Финальный уровень секреции штаммом ацетата составлял ~51.8 мМ при выходе ~0.38 моль/моль, на фоне относительно низкого накопления пирувата. В аналогичных условиях штамм BOX3.1 ∆4 PL-atoB PL-tesB синтезировал из глюкозы 3-ГМК с выходом 0.66 моль/моль при заметно большей, по сравнению со штаммом MGΔ4 PL-tesB ΔyciA (pMW118m-atoB-fadB), побочной продукции ацетата [13].

Рис. 1.

Концентрации метаболитов (мМ): пирувата (1), ацетата (2) и 3-ГМК (3), секретированных штаммом MGΔ4 PL-tesB ΔyciA (pMW118m-atoB-fadB) при микроаэробной утилизации глюкозы в биореакторе в присутствии ИПТГ.

Таким образом, в результате реконструкции штамма-продуцента в сочетании с проведением процесса биосинтеза целевого вещества в условиях способствующих его эффективному формированию удалось оптимизировать продукцию 3-ГМК из глюкозы направленно сконструированными штаммами E. coli.

Вместе с тем, результаты исследования свидетельствовали о том, что биосинтетические характеристики полученного штамма-продуцента 3-ГМК могут быть в дальнейшем улучшены за счет обеспечения в клетке четкой координации активностей ключевых ферментов, ответственных за конверсию ацетил-КоА в целевой продукт. Такая координация может быть обеспечена в результате тонкой регуляции уровня экспрессии соответствующих генов. Кроме того, оптимизация условий культивирования штамма-продуцента, направленная на достижение в клетке выгодного окислительно-восстановительного баланса также может способствовать достижению повышенного уровня конверсии глюкозы в 3-ГМК.

Авторы выражают благодарность сотруднику НИЦ “Курчатовский институт”-ГосНИИгенетика Губайдуллину И.И. за помощь в клонировании генов atoB и fadB, а также конструировании экспрессионной плазмиды, несущий данные гены.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 18-29-08059).

Список литературы

  1. Blacklock T.J., Sohar P., Butcher J.W., Lamanec T., Grabowski E. J. J. // J. Org. Chem. 1993. V. 58. № 7. P. 1672–1679.

  2. Chiba T., Nakai T. // Chem. Lett. 1985. V. 161. P. 651–654.

  3. Mori K., Sugai T. // Synthesis. 1982. V. 9. P. 752–753.

  4. Mori K., Takikawa H. // Tetrahedron. 1990. V. 46. P. 4473–4486.

  5. Spengler J., Albericio F. // Curr. Org. Synth. 2008. V. 5. № 2. P. 151–161.

  6. Liu Q., Ouyang S.P., Chung A., Wu Q., Chen G.Q. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007. V. 76. № 4. P. 811–818.

  7. Tseng H.C., Martin C.H., Nielsen D.R., Prather K.L. // Appl. Environ. Microbiol. 2009. V. 75. № 10. P. 3137–3145.

  8. Lee S.H., Park S.J., Lee S.Y., Hong S.H. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2008. V. 79. № 4. P. 633–641.

  9. Dellomonaco C., Clomburg J.M., Miller E.N., Gonzalez R. // Nature. 2011. V. 476. № 7360. P. 355–359.

  10. Clomburg J.M., Vick J.E., Blankschien M.D., Rodríguez-Moyá M., Gonzalez R. // ACS Synth. Biol. 2012. V. 1. P. 541–554.

  11. Gulevich A.Y., Skorokhodova A.Y., Sukhozhenko A.V., Shakulov R.S., Debabov V.G. // Biotechnol. Lett. 2012. V. 34. № 3. P. 463–469.

  12. Гулевич А.Ю., Скороходова А.Ю., Стасенко А.А., Шакулов Р.С., Дебабов В.Г. // Прикл. биохимия и микробиология. 2016. Т. 52. № 1. С. 21–29.

  13. Gulevich A.Y., Skorokhodova A.Y., Sukhozhenko A.V., Debabov V.G. // J. Biotechnol. 2017. V. 244. P. 16–24.

  14. Скороходова А.Ю., Зименков Д.В., Гулевич А.Ю., Минаева Н.А., Бирюкова И.В., Машко С.В. // Биотехнология. 2006. № 3. С. 6–16.

  15. Гулевич А.Ю., Скороходова А.Ю., Моржакова А.А., Антонова С.В., Сухоженко А.В., Шакулов Р.С., Дебабов В.Г. // Прикл. биохимия и микробиология. 2012. Т. 48. № 4. С. 383–388.

  16. Sambrook J., Fritsch E., Maniatis T. // Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd Ed., N.Y.: Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989. 1659 p.

  17. Datsenko K.A., Wanner B.L. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. № 12. P. 6640–6645.

  18. Каташкина Ж.И., Скороходова А.Ю., Зименков Д.В., Гулевич А.Ю., Минаева Н.И., Дорошенко В.Г., Бирюкова И.В., Машко С.В. // Молекулярная биология. 2005. Т. 39. № 5. С. 823–831.

  19. Гулевич А.Ю., Скороходова А.Ю., Ермишев В.Ю., Крылов А.А., Минаева Н.И., Полонская З.М., Зименков Д.В., Бирюкова И.В., Машко С.В. // Молекулярная биология. 2009. Т. 43. № 3. С. 547–557.

  20. Fischer C.R., Tseng H.C., Tai M., Prather K.L., Stephanopoulos G. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2010. V. 88. № 1. P. 265–275.

  21. Koebmann, B.J., Westerhoff H.V., Snoep, J.L., Nilsson, D., Jensen, P.R. // J. Bacteriol. 2002. V. 184. № 14. P. 3909–3916.

  22. Zhuang Z., Song F., Zhao H., Li L., Cao J., Eisenstein E., Herzberg O., Dunaway-Mariano D. // Biochemistry. 2008. V. 47. № 9. P. 2789–2796.

  23. Chen M., Ma X., Chen X., Jiang M., Song H., Guo Z. // J. Bacteriol. 2013. V. 195. № 12. P. 2768–2775.

  24. Fujita Y., Matsuoka H., Hirooka K. // Mol. Microbiol. 2007. V. 66. № 4. P. 829–389.

  25. Campbell J.W., Morgan-Kiss R.M., Cronan J.E. // Mol. Microbiol. 2003. V. 47. № 3. P. 793–805.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Прикладная биохимия и микробиология

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал