1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Прикладная биохимия и микробиология
  4. T. 57, № 2, 2021

Прикладная биохимия и микробиология, 2021, T. 57, № 2, стр. 163-171

Каталитические и молекулярные аспекты функционирования изоформ глутаматдегидрогеназы в кукурузе Zea mays L.

А. Т. Епринцев 1, *, Г. Б. Анохина 1, П. С. Оя 1, Я. И. Дедов 1

1 Воронежский государственный университет
394018 Воронеж, Россия

* E-mail: bc366@bio.vsu.ru

Поступила в редакцию 05.10.2020
После доработки 30.10.2020
Принята к публикации 02.11.2020

Полный текст (PDF)

Аннотация

Исследована динамика активности глутаматдегидрогеназы (ГДГ, КФ 1.4.1.2) при прорастании в листьях и щитках кукурузы. Установлено, что изменения активности в листьях и щитках обусловлены как биохимическими, так и молекулярными аспектами функционирования фермента, что подтверждалось вариабельностью относительного уровня транскриптов генов gdh-1 и gdh-2, кодирующих субъединицы ГДГ. Показано, что фермент в листьях преимущественно локализовался в митохондриях (86.54%), и в меньшей степени в цитозоле (9.53%) и хлоропластах (3.92%). Очистка, включающая 4 этапа позволила выделить 3 ферментных препарата ГДГ из листьев кукурузы с различной степенью очистки. Форма ГДГ1 была очищена в 98 раз с выходом 8%. Удельная активность полученного препарата – 195 Е/мг белка. Форма ГДГ2 со степенью очистки 83 раза и выходом 32% имела удельную активность 166 Е/мг белка. Препарат ГДГ3 характеризовался удельной активностью 122.2 Е/мг белка, степенью очистки 61 и выходом 21%. Определены значения pH-оптимумов по реакции аминирования: для ГДГ 1 он составил 7.5, для ГДГ2 и ГДГ3 – 7.0 и 8.5 соответственно. Полученные изоформы имели разные значения Kм по 2-оксоглутарату: 0.34 мМ для ГДГ1, а для ГДГ2 и ГДГ3 – 0.6 мМ и 0.22 мМ соответственно.

Ключевые слова: глутаматдегидрогеназа, кукуруза, прорастание, очистка, изоферменты, субклеточная локализация, экспрессия, праймер

Глутаматдегидрогеназа (ГДГ, КФ 1.4.1.2) – фермент, участвующий в регуляции углеводного и азотного метаболизма, обеспечивающего обратимый катализ восстановительного аминирования 2-оксоглутарата до L-глутамата. Структурно ГДГ представляет собой олигомер. Известно, что в организме функционируют как гексамерные, так тетрамерные и димерные формы фермента с массой одной субъединицы от 40 до 60 кДа [1–3]. В зависимости от молекулярного веса мономеров выделяют три группы ГДГ: первая – с молекулярной массой около 50 кДa, вторая – ~115 кДa и третья – ~180 кДа. ГДГ является олигомером и может состоять из субъединиц различного типа: α, β, γ [4]. Известно, что преобладание α-субъединиц в структуре обеспечивает более высокое сродство к глутамату, в то время как наличие β-субъединиц повышает сродство к 2-оксоглутарату [4].

Активаторами реакций обычно служат двухвалентные ионы металлов. По данным литературы в большинстве организмов в качестве активатора выступает кальций. Также реакция может регулироваться нуклеотидами, связывающимися с ферментом в аллостерическом центре, такими как АДФ и АМФ. В редких случаях активаторами могут выступать такие аминокислоты как аспартат, аспарагин, цистеин и лейцин [5–7]. Все перечисленные выше соединения в больших концентрациях могут являться также ингибиторами глутаматдегидрогеназной активности [8].

Значения оптимума pH для прямой и обратной реакции в различных организмах могут быть различными. Так для глутаматдегидрогеназы, выделенной из Arabidopsis thaliana, оптимум pH для прямой реакции восстановительного аминирования 2-оксоглутарата – 8.3, в то время как для обратной реакции окислительного дезаминирования глутамата – 9.2 [9].

Исследования ГДГ в настоящее время показали, что в геноме A. thaliana обнаружены три гена, кодирующие различные типы субъединиц ГДГ, в геноме кукурузы Zea mays L. – два гена. Ген gdh-1 кодирует полипептид β-субъединицы, а ген gdh-2 ответственен за синтез α-субъединицы ГДГ. При стрессе экспрессия данных генов изменяется, что свидетельствует о тесной связи данного фермента с адаптивными реакциями клеточного метаболизма растений [6, 10].

В клетках растений фермент локализован в митохондриях и хлоропластах, а у бактерий и архей может встречаться цитоплазматическая форма [2]. ГДГ распространена во всех органах и тканях растений, но в различных органах и тканях встречаются различные изоформы фермента. Экспрессия генов ГДГ имеет органоспецифический характер. Например, ген gdh3 арабидопсиса локализован только в листьях, а ген gdh2 имеет максимальную экспрессию в корнях [11].

ГДГ участвует в метаболизме азота, включая неорганический азот в углеродный скелет при превращении 2-оксоглутарата в глутамат [12]. Кроме того, ГДГ является незаменимым звеном гамма-аминомасляного шунта, необходимого для синтеза гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК), участвующей в передаче стрессовых сигналов [3].

В растительных тканях физиологическая роль ГДГ заключается не только в ассимиляции азота, катаболизме глутамата и поставке 2-оксоглутарата для ЦТК, но также в регуляции осмотического баланса и устойчивости к высоким температурам [3]. Этот фермент выступает в качестве промежуточного звена между ЦТК и ГАМК-шунтом. Глутаматдегидрогеназа обеспечивает связь между катаболическим и анаболическим путями.

Цель работы – получение препаратов изоформ ГДГ в высокоочищенном состоянии и исследование их регуляторных и молекулярных аспектов функционирования в кукурузе Zea mays L.

МЕТОДИКА

В качестве объекта исследования использовали щитки семян, проростки и листья кукурузы (Zea mays L.) сорта Воронежская 76, выращенные гидропонным способом при 10-часовом световом дне с интенсивностью освещения 25 Вт/ м2. Температура выращивания – 25°С.

Активность ГДГ в щитках и листьях определяли в митохондриальной фракции. Для получения субклеточных фракций растения гомогенизировали (в объемном соотношении 1:10) в среде следующего состава: 0.15 М Трис-HCl буфер, pH 7.4, 0.4 М сахароза, 2.5 мМ ЭДТА, 1 мМ KCl, 4 мМ MgCl, 0.05% Тритон Х-100, после чего центрифугировали при 14 000 g. Осадок, содержащий фракцию митохондрий, разрушали осмотическим шоком в среде, содержащей 0.15 М Трис-HCl буфер, pH 7.4. Все манипуляции проводили при температуре 4°С.

Скорость реакции аминирования измеряли по изменению оптической плотности раствора, содержащего 2.5 мМ 2-оксоглутарата, 0.25 мМ НАДН, 50 мМ хлорида аммония, 100 мМ Трис-HCl буфер, рН 8.0 [12]. Реакцию инициировали добавлением фермента.

Активность ГДГ в реакции дезаминирования определяли путём измерения оптической плотности раствора, содержащего 100 мМ Трис-HCl буфер рН 8.5, 3 мМ НАД, 1.0 мМ хлорид кальция, 50 мМ глутамат натрия [13]. Реакцию инициировали добавлением фермента.

Для определения субклеточной локализации ГДГ в листьях кукурузы мембранные фракции выделяли из клеточного гомогената методом изоплотностного центрифурирования на центрифуге Backman (США) при 100000 g 90 мин при 0°С в градиенте плотности сахарозы: 2.5 М, 2.3 М, 1.8 М, 1.5 М, 1.3 М. Листья кукурузы ( 5 г) гомогенезировали в среде выделения (1:5), следующего состава: 0.15 М Трис-HCl буфер, pH 7.4, 0.4 М сахароза, 2.5 мМ ЭДТА, 1 мМ хлорид калия, 4 мМ хлорид магния, 0.05% Тритон Х-100, затем центрифугировали 3 мин при 1000 g. Супернатант центрифугировали при 11 000 g. Осадок растворяли в 10 мл той же среды выделения и наносили для разделения на ступенчатый градиент сахарозы [14].

Фракции митохондрий, хлоропластов, пероксисом осторожно отбирали, разбавляли буфером до концентрации сахарозы 0.4 М, центрифугировали 30 мин при 11000 g для осаждения органелл. Мембранные органоиды разрушали осмотическим шоком в растворе 50 мМ Трис-HCl буфера, pH 7.5.

Перекрестное загрязнение митохондриальной фракции идентифицировали по величине активности маркерного фермента митохондрий – сукцинатдегидрогеназы [15]. Загрязнение цитоплазмотической и пероксисомальной фракциями определяли, измеряя активности маркерных ферментов цитозоля – алкогольдегидрогеназы [16] и пероксисом – пероксидазы [17].

Выделение тотальной РНК из растительных образцов осуществляли методом гуанидинтиоцианат-фенолхлороформной экстракции [18]. Обратную транскрипцию мРНК проводили с использованием обратной транскриптазы MMLV (“Евроген”, Россия), согласно инструкции производителя. Подбор праймеров осуществляли на основе нуклеотидных последовательностей, представленных в международной базе GeneBank, с помощью программы Primer-BLAST. Полимеразную цепную реакцию проводили с использованием специфичных праймеров на приборе LightCycler96 (“Roche”, Швеция), с использованием SybrGreen I в качестве красителя. Количество матрицы контролировали с помощью параллельной амплификации фактора элонгации ef-1α с ген-специфичными праймерами [19]. Относительный уровень экспрессии исследуемых генов определяли с применением 2–ΔΔCt-метода как описано в работе [20].

Очистку ГДГ проводили в четыре стадии при постоянной температуре 4°С. Листья кукурузы гомогенизировали в среде выделения в соотношении 1:5. Фракционирование сульфатом аммония проводили в две стадии: от 0 до до 35% насыщения раствора и от 35 до 70%. Полученный осадок ресуспендировали в 50 мМ Трис-HCl буфере, рН 7.8, в объеме 2 мл. Соли аммония удаляли гель-фильтрацией через колонку с сефадексом G-25. Эллюцию белков проводили 50 мМ Трис-HCl буфером, рН 8.0. Последующую ионообменную хроматографию осуществляли на колонке с ДЭАЭ-Sephacel (“Sigma-Aldrich”, США). Десорбцию белка проводили линейным градиентом концентрации NaCl от 0.15 до 0.35 М [21]. Десорбция фермента происходила при концентрации NaCl 115 мМ для ГДГ1, 220 мМ для ГДГ2 и 275 мМ для ГДГ3.

Электрофоретические исследования белков проводили в 7.5%-ном полиакриламидном геле [22]. Универсальное окрашивание белков в гелях осуществляли с помощью AgNO3 [23]. Специфическое проявление ГДГ осуществляли с помощью тетразолиевого метода [24].

Белок определяли по методу Лоури [25]. Содержание белка рассчитывали по формуле:

${\text{Б }} = ЕK{{{{V}_{{{\text{общ}}}}}} \mathord{\left/ {\vphantom {{{{V}_{{{\text{общ}}}}}} {{{V}_{{{\text{проб}}}}}}}} \right. \kern-0em} {{{V}_{{{\text{проб}}}}}}},$
где, Е – оптическая плотность; K – перерасчетный коэффициент; Vобщ – общий объем раствора, мл; Vпроб – объем взятой на белок пробы, мл.

Влияние величины рН на скорость ферментативной реакции полученных молекулярных форм ГДГ определяли путем проведения серии измерений скорости ферментативной реакции при различных значениях рН. Константы Михаэлиса полученных ферментных препаратов определяли с использованием в качестве субстрата 2-оксоглутарата. Kм определяли по графику Лайнуивера–Бэрка методом двойных обратных координат.

Опыты проводили в 3–4-кратной повторности, аналитические определения для каждой пробы осуществляли в трех повторностях. Предварительная оценка характера распределения проводилась по асимметрии и эксцессу (Excel, Microsoft Office), а также с помощью критерия Колмогорова–Смирнова. Полученные значения позволили оценить характер распределения как нормальный. Критерий Стьюдента использовался с применением поправки на множественные сравнения (поправка Бонферрони) [26]. Дополнительно применялся однофакторный дисперсионный анализ ANOVA, который показал, что исследуемый в работе фактор действительно оказывал влияние (влияние фактора достоверно при p < 0.05).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Измерение активности ГДГ по реакции аминирования в щитках и листьях кукурузы показало, что активность фермента в щитках можно было определить в сухих семенах (рис. 1). В первый же день прорастания активность ГДГ достигала максимального значения в 236.3 Е/г сухой массы и в дальнейшем постепенно снижалась. Появление зеленых проростков кукурузы отмечалось на 5 день прорастания семени. Активность исследуемого фермента с ростом проростков увеличивалась, достигая на 10 сут прорастания максимального значения – 125.9 Е/г. Активность ГДГ в проростках кукурузы по сравнению с щитками несколько ниже, что, вероятно может быть связано с присутствием в зеленых листьях глутаминсинтетазной активности, доминирующей в световых условиях [3].

Рис. 1.

Ферментативная активность ГДГ в листьях (2) и щитках (1) кукурузы при прорастании.

Из результатов исследования субклеточной локализации ГДГ в листьях кукурузы видно, что ее активность обнаруживалась в цитозоле (9.53%), хлоропластах (3.92%) и наибольшая часть в митохондриях 86.54%, что в целом согласовывалось с имеющимися литературными данными (табл. 1) [22]. В пероксисомальной фракции активности исследуемого фермента обнаружено не было. Как уже упоминалось, согласно данным, полученным Яковлевой с соавт. [27], ГДГ в корнях кукурузы большей частью локализована в митохондриях. Данных о субклеточной локализации фермента в листьях кукурузы в литературе не было найдено.

Таблица 1.  

Субклеточная локализация активности ГДГ в листьях кукурузы (n = 3; p ≤ 0.05)

Фракция органоидов Общая активность,
E/г сырой массы 		Активность фермента, % от общего содержания
Пероксисомы – –
Цитоплазма 15.50 9.53
Хлоропласты 6.38 3.92
Митохондрии 140.70 86.54

Степень перекрестного загрязнения для цитоплазматической фракции не превышала 4.5%, для хлоропластной и митохондриальной фракций – 10%, для пероксисомальной фракции – 1% (табл. 2).

В связи с тем, что в листьях кукурузы ГДГ в клетке имела различную локализацию, исследовали суммарную активность всех трех субклеточных фракций фермента. Исследование фракции хлоропластов не проводили, так как в них функционирует глутамин-синтетазный путь [28].

Таблица 2.  

Активность маркерных ферментов, используемых для определения чистоты фракций (n = 3; p ≤ 0.05)*

Фракция Активность
СДГ 		Активность АДГ Активность
каталазы 		Содержание хлорофилла
Е/мл % Е/мл % Е/мл % мг/мл %
Цитоплазма 0.03 4.05 5.20 86.52 н/о н/о 2.08 2.49
Хлоропласты 0.07 9.50 0.40 6.65 0.01 7.69 80.70 96.54
Митохондрии 0.64 86.50 0.35 5.82 0.01 7.69 0.81 1.51
Пероксисомы н/о н/о 0.06 1.00 0.11 84.60 н/о н/о

* н/o – не обнаружено.

При исследовании изменения изоферментного спектра ГДГ при прорастании кукурузы установлено наличие до четырех изоформ ГДГ в разные периоды прорастания со значениями Rf = 0.7, 0.4. 0.26, 0.13 (рис. 2) .

Рис. 2.

Изоферментный состав глутаматдегидрогеназы в проростах кукурузы на 5, 6 и 10 сут прорастания: P1, P2, P3, P4 – белковые полосы, F – фронт красителя.

Исследование изоферментного состава ГДГ показало, что в щитках в течение 10 сут происходило изменение общей ферментативной активности, в том числе, и за счет появления дополнительных молекулярных форм исследуемого фермента. На 7 сут прорастания в щитках кукурузы наблюдали три молекулярные формы фермента, с различными значениями электрофоретической подвижности, в то время как на 5 и 10 было обнаружено только по две изоформы, обладающие ГДГ активностью.

Из зеленых листьев кукурузы были выделены в результате четырехстадийной очистки высокоочищенные препараты изоформ ГДГ (табл. 4).

Таблица 3.  

Праймеры к генам ГДГ

Ген Праймер Нуклеотидная последовательность Температура отжига, оС
gdh-1 Прямой GCGGAGAACAAGGGGATCAA 58
Обратный ACAGGATCTCGTCTGCCTCT
gdh-2 Прямой TGATCCAGAGGCAGACGAGA 60
Обратный GTAATGCGCGGTCAATGGTC
Таблица 4.  

Стадии очистки изоформ глутаматдегидрогеназы из листьев кукурузы

Стадия Объем,
мл 		Белок,
мг 		Общая активность, Е Удельная активность, Е/мг белка Выход, % Степень очистки
Гомогенат 110.0 241.0 478.0 1.9 100.0 1.0
Фракционирование сульфатом аммония, 70% насыщения 3.0 72.7 313.0 4.3 65.4 2.2
Гель-фильтрация через сефадекс G-25 6.0 57.5 298.6 5.2 62.0 2.6
ДЭАЭ- сефадекс ГДГ1 2.5 0.2 38.6 195.0 8.0 98.0
ГДГ2 2.5 0.9 156.2 166.0 32.0 83.0
ГДГ3 2.0 0.8 101.3 122.2 21.0 61.0

Фракционирование сульфатом аммония (до 70% насыщения) и гель-фильтрация на сефадексе G-25 позволили получить препарат с удельной активностью 5.19 Е/мг белка. Проведение ионообменной хроматографии на колонке с ДЭАЭ-Sephacel позволило обнаружить 3 пика активности ГДГ, которые десорбировали хлористым натрием.

Очищенная ГДГ1 имела удельную активность 195 Е/мг белка, при этом степень очистки составила 98 раз с выходом 8%. Вторая форма (ГДГ2) имела удельную активность 166 Е/мг белка, степень очистки – 83 и выход 32%. Ферментный препарат ГДГ3 имел удельную активность 122.2 Е/мг белка, степень очистки 61 и выход 21%.

Проведение электрофореза в ПААГ с универсальным окрашиванием белков нитратом серебра позволило установить, что ГДГ1 была получена в гомогенном состоянии, в то время как две других формы ГДГ2 и ГДГ3 являлись высокоочищенными, так как присутствовали сопровождающие белки (рис. 3а). Модифицированным тетразолиевым методом окрашивания была показана принадлежность полученного очищенного белка к ГДГ (рис. 3б). Значения Rf для трех форм фермента составили: для ГДГ1 – 0.26, для ГДГ2 – 0.3 и ГДГ3 – 0.7.

Рис. 3.

Электрофореграмма очищенного препарата ГДГ (а): P – белковая полоса, окраска ГДГ1 с использованием нитрата серебра, б – специфическое проявление ГДГ. P1, P2, P3 – белковые полосы для препаратов ГДГ1 (1), ГДГ2 (2) и ГДГ3 (3), F – фронт красителя.

Для очищенных изоферментов были определены оптимумы pH: для ГДГ1 – 7.5, ГДГ2 – 7.0 и ГДГ3 – 8.5 (рис. 4).

Рис. 4.

Зависимость активности полученного препарата глутаматдегидрогеназы от значения pH для реакции восстановительного аминирования 2-оксоглутарата: а – ГДГ1; б – ГДГ2; в – ГДГ3.

Все три ферментных препарата имели различные значения Kм при использовании в качестве субстрата 2-оксоглутарата (рис. 5, табл. 5), что указывало на различные скорости протекания реакции восстановительного аминирования, катализируемого различными изоформами ГДГ.

Рис. 5.

Определение константы Михаэлиса полученного ферментного препарата: а – ГДГ1; б – ГДГ2; в – ГДГ3 по 2-оксоглутарату.

Таблица 5.  

Значения констант Михаэлиса и оптимальных значений pH для изоферментов глутаматдегидрогеназы (n = 3, р ≤ 0.05)

Изоформа ГДГ pH оптимум Км по 2-ОГ, мМ
ГДГ1 7.5 0.34 ± 0.01
ГДГ2 7.0 0.60 ± 0.01
ГДГ3 8.5 0.22 ± 0.01

Можно предположить, что субъединичный состав полученных изоформ ГДГ также различен, поскольку полипептиды ГДГ кодируются различными генами – gdh-1 и gdh-2.

Из литературных данных известно, что активация ферментов при набухании семени возможна двумя способами: путем пост-трансляционной модификации и синтезом de novo с помощью активации работы соответствующих генов [29–33]. В связи с этим, были исследованы молекулярные аспекты функционирования генов, кодирующих ГДГ в клетках кукурузы. Количественную оценку уровня транскриптов генов осуществляли путём проведения полимеразной цепной реакции в реальном времени с использованием специфических праймеров (табл. 3). Изменение относительного уровня транскриптов гена gdh-1 в щитках при прорастании семян кукурузы показало, что начиная с момента их набухания в щитках кукурузы наблюдалась значительная транскрипционная активность, которая постепенно снижалась вплоть до 3 сут прорастания, после чего на 6 сут восстанавливалась (рис. 6а). Максимум значений относительного уровня транскриптов гена gdh-1 отмечался на 7 сут прорастания семян. В последующие дни транскрипционная активность гена снижалась более чем в 7 раз.

Рис. 6.

Относительный уровень транскриптов гена gdh-1 (а) и гена gdh-2 (б) глутаматдегидрогеназы в щитках при прорастании семян кукурузы.

Транскрипция гена gdh-1 приводит к синтезу β-субъединиц ГДГ, что в свою очередь способствует смещению равновесия ферментативной реакции в сторону аминирования, то есть образования глутамата. Исследование транскрипционной активности гена gdh-1 показало, что в первые 5 сут прорастания семян активность этого гена минимальна. Начиная с шестого дня прорастания отмечается скачок относительного уровня транскриптов гена gdh-1, что, вероятно, связано с включением фотосинтезирующей системы, обеспечивающей приток глутамата через глутаминсинтетазную систему [28].

Известно, что ген gdh-2 в геноме кукурузы кодирует α-субъединицу ГДГ, преобладание которой в структуре фермента приводит к смещению равновесия в сторону реакции дезаминирования глутамата [4]. Исследование относительного уровня транскриптов гена gdh-2 в щитках показало, что в первые 5 сут прорастания транскрипционная активность гена минимальна (рис. 6б). Однако, начиная с седьмых суток прорастания концентрация мРНК гена gdh-2 увеличивалась более чем в 13 раз относительно значений, зарегистрированных для семян через несколько часов после набухания.

При набухании и прорастании семян активация метаболических процессов происходит по каскадному механизму. Еще до наступления момента набухания и последующего прорастания в семени содержится определенный набор ферментов, обеспечивающих в первое время нормальное развитие растения. Активация этого “минимального набора” в семени происходит в момент его набухания [33].

Исследование транскрипционной активности генов ГДГ в прорастающих растениях показало, что транскрипционная активность гена gdh-1, кодирующего β-субъединицу ГДГ, имела нисходящий характер (рис. 7а). Однако, следует отметить, что относительный уровень транскриптов другого гена gdh-2, кодирующего α-субъединицу, наоборот, возрастал, что свидетельствовало об увеличении роли ГДГ в листьях прорастающей кукурузы как поставщика 2-оксоглутарата (рис. 7б). Полученные результаты измерения относительного уровня транскриптов исследуемого гена полностью согласовывались с результатами измерения общей ферментативной активности (рис. 1).

Рис. 7.

Относительный уровень транскриптов gdh-1 (а) и гена gdh-2 (б) глутаматдегидрогеназы при прорастании в проростках кукурузы.

Таким образом, исследование активности ГДГ в щитках и листьях кукурузы показало его важную роль в качестве первого фермента, участвующего в прорастании семени. Изменение относительного уровня транскриптов генов gdh-1 и gdh-2 показало, что активация ГДГ при прорастании семени происходит путем посттрансляционной модификации пре-ГДГ, находящейся в семени в состоянии покоя. Фермент менее активен в листьях, что связано, в первую очередь, с наличием в них доминирующего глутаминсинтетазного пути. Следует обратить внимание на изменение транскрипционной активности обоих генов в кукурузе в процессе прорастания. Клетки растений снижают синтез полипептидов β-субъединицы, пропорционально увеличивая синтез α‑субъединиц, что обуславливает увеличение скорости дезаминирования, обеспечивающего синтез 2-оксоглутарата.

Список литературы

  1. Bown A.W., Shelp B. // Plant Science. 2016. V. 21. № 10. P. 811–813.

  2. Hudson R.C., Daniel R.M. // Comp. Biochem. Physiol. 1993. V. 106. № 4. P. 767–792.

  3. Santero E., Ana B. Hervás, Canosa I. and Govantes F. // INTECH. 2012. P. 289–318. https://doi.org/10.5772/47767

  4. Purnell M.P., José R. Botella // Plant Physiol. 2007. V. 143. № 1. P. 530–539.

  5. Consalvi V., Chiaraluce R., Millevoi S., Pasquo A., Politi L., De Rosa M., Scandurra R. // Comp. Biochem. Physiol. B. 1994. V. 109. P. 691–699.

  6. Grabowska A., Zdunek-Zastocka E., Kutryn E., Kwinta J. // Acta Physiol Plant. 2017. V. 24. doi.org/https://doi.org/10.1007/s11738-016-2322-4

  7. Hudson R.C., Daniel R.M. // Comp Biochem Physiol. 1993. V. 106. P. 767–792.

  8. Dubois F., Tercé-Laforgue T., Gonzalez-Moro M.B., Estavillo J.M., Sangwan R., Gallais A., Hirel B. // Plant. Physiol. Biochem. 2003. V. 41. P. 565–576

  9. Anderson B.M. // Arch. Biochem. Biophys. 1993. V. 300. P. 483–488.

  10. Fontaine Jean-Xavier, Tercé-Laforgue T., Bouton S., Pageau K., Lea P., Dubois F., Hirel B // Plant Signaling and Behavior. 2013. V. 8. № 10. P. 4161–4163.

  11. Флоренская Т.Г., Космачевская О.В, Топунов А.Ф. // Изд-во Науч.-исслед. ин-т сел. хоз-ва Крыма. Симферополь. 2017. № 4(12). С. 18–30.

  12. Sarasketa A., Gonzalez-Moro M.B., Gonzalez-Murua C., Marino D. // Front. Plant Sci. 2016. V. 7. P. 1–12.

  13. Yamaya T., Oaks A., Matumoto H. // Plant Physiology. 1984. V. 76. P. 1009–1013.

  14. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование . М.: Наука, 1981. 288 с.

  15. Попов В.Н., Епринцев А.Т., Федорин Д.Н. // Физиология растений. 2007. Т. 54. № 3. С. 409–415.

  16. Pathuri I.P., Reitberger I.E., Hückelhoven R., Proels R.K. // J. Exp. Bot. 2011. V. 10. P. 3449–3457.

  17. Ермаков А.И. Методы биохимического исследования растений. Л.: Колос, 1972. С. 107–108.

  18. Chomczynski P., Sacchi N. // Anal. Biochem. 1987. V. 162. P. 156–159.

  19. Livak K.J., Schmittgen T.D. // Methods. 2001. V. 25. № 4. P. 402–408.

  20. Nicot N., Hausman J.F., Hoffmann L., Evers D. // J. Exp. Bot. 2005. V. 56. P. 2907–2914.

  21. Hudson R.C., Daniel R.M. // Comp. Biochem. Physiol. 1993. V. 106. P. 767–792.

  22. Davis B.J. // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1994. V. 121. P. 404–427.

  23. Shevchenko A., Wilm M., Vorm O., Mann M. // Anal. Chem. 1996. V. 68. P. 850–858.

  24. Magalhaes J.R., Ju G.C., Rich P.J., Rhodes D. // Plant Physiol. 1990. V. 94. P. 647–656.

  25. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. // J. Biol. Chem. 1951. V. 193. P. 265–275.

  26. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, 1990. 351 с.

  27. Яковлева В.И., Кретович В.Л., Гильманов М.К. // Биохимия. 1964. Т. 29. №3. С. 463–469.

  28. Измайлов С.Ф. Азотный обмен в растениях. М.: Наука, 1986. 320 с

  29. Kruger J.E., La Berge D.E. // Cereal Chem. 1974. V. 51. № 5. P. 578–585.

  30. Anstine W., Jacobsen J.V., Scandalios J.G., Varner J.E. // Plant Physiol. Lancaster. 1970. V. 45. P. 148–152.

  31. Tao K.L., Khan A.A. // Plant Physiology. 1975. V. 56. № 6. P. 797–800.

  32. Eprintsev A.T., Fedorin D.N., Karabutova L.A., Igamberdiev A.U. // J. Plant Physiol. 2016. V. 205. P. 33–40.

  33. Томас Г. Жизнеспособность семян. М.: Колос, 1978. С. 341–373.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Прикладная биохимия и микробиология

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал