Прикладная биохимия и микробиология, 2020, T. 56, № 6, стр. 577-586

МЕТОДИКА

В работе использовали: трис-основание (трис-OH), трис-гидрохлорид (трис-HCl), агарозу (Type I, Low EEO), ДДС-Na, борную кислоту, ЭДТА – (“Sigma”, США), бромистый этидий, персульфат аммония, N, N, N', N'-тетраметилэтилендиамин – “Fluka” (Швейцария), акриламид, N,N'-метилен-бис-акрилиамид (“Serva”, Германия), триптон “Bacto”, агар “Bacto”, дрожжевой экстракт “Bacto” (“Difco”, США), ампициллин (“AppliChem”, Германия), дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (“MBI Fermentas”, Литва). Неорганические соли – фирмы “Merck” (Германия), реактивы квалификации х. ч. и о. с. ч. (Россия). Белковые маркеры молекулярной массы – “Unstained Protein Molecular Weight Marker” фирмы “MBI Fermentas” (Литва).

Taq-полимеразу, рестрицирующие эндонуклеазы (BamHI и HindIII) и ДНК-лигазу фага Т4 производства “MBI Fermentas” (Литва) использовали в соответствии с рекомендациями фирм-производителей.

Выделение ДНК, очистку, гидролиз эндонуклеазами рестрикции, лигирование фрагментов ДНК, а также трансформацию клеток E. coli плазмидами проводили согласно [8].

Штаммы E. coli JM110 и С600ΔudpRecA- (thi thrB leuB lacY supE tonA recA Tn10) предоставлены Всероссийской коллекцией промышленных микроорганизмов (НИЦ “Курчатовский институт"-ГосНИИгенетика”, Россия).

Источниками рекомбинантных ТТР и UDP служили полученные нами ранее штаммы-продуценты этих ферментов Escherichia coli, Klebsiella aerogenes, Salmonella typhimurium, Halomonas chromatireducens, Shewanella oneidensis –MR-1 [9–13].

При конструировании экспрессионных плазмид в качестве реципиентного использовали сконструированный ранее бактериальный вектор pUU18 [14], содержащий в своем составе промотор-операторную область гена UDP из E. coli.

Полимеразную цепную реакцию проводили в амплификаторе “Eppendorf Mastercycler gradient” (“Eppendorf”, Германия).

Синтез олигодезоксирибонуклеотидов и сиквенс ДНК проводился фирмой “Синтол” (www.syntol.ru) на коммерческой основе.

Ген гибридного белка (Hyb111) конструировали методом ПЦР аналогично ранее опубликованной работе [15]. Структуры использованных в работе олигодезоксирибонуклеотидов приведены в табл. 1. В качестве матрицы при амплификации структурной части гена TPP из Geobacillus stearothermophilus использовали ДНК самого микроорганизма, а при конструировании Hyb111 – плазмиду, полученную в работе [9].

Выделение плазмид проводили с использованием набора “GeneJet™ Plasmid Miniprep Kit” (“MBI Fermentas”, Литва). Клетки E. coli, содержащие плазмиду, культивировали в течение 16–18 ч в стеклянных пробирках (или колбах) со средой LB (ампициллин – 150 мкг/мл) при 37°С и 250 об./мин в шейкере-инкубаторе “Excella E25” (“New Brunswick Scientific”, США).

Концентрацию белка определяли по методу Бредфордa [16] с окраской реагентом “Bio-Rad Protein Assay” (“Bio-Rad”, США). В качестве стандарта использовали раствор бычьего сывороточного альбумина (“Sigma”, США).

Электрофоретическое разделение белков проводили по Леммли [17].

Ферментативную активность рекомбинантных NP и их гибридных и мутантных форм определяли в К-фосфатном буфере согласно [9, 18].

Термостабильность белков определяли согласно [19]. Раствор исследуемого белка выдерживали в буфере (20 мM трис-HCl, pH 8.0) при выбранной температуре в течение запланированного времени. Затем пробу этого белка переносили в заранее прогретый до 40°С раствор соответствующих субстратов (5 мM тимидин или 5мM уридин в 20 мМ К-фосфатном буфере, рН 7.4) и инкубировали в течение 5 мин, после чего спектрофотометрически определяли остаточную активность фермента [9, 18]. Температуру инкубации раствора белка при определении термостабильности фермента задавали на 5–10°С ниже значения Т_опт.

Четвертичную структуру рекомбинантных NP подтверждали методом аналитической гель-фильтрации на колонке Tricorn 10/300 c сорбентом Superdex 200 с использованием прибора AKTA FPLC (“GE Healthcare”, Великобритания) в 10 мM Na-фосфатном буфере, pH 7.4, содержащем 150 мM NaCl. Регистрацию осуществляли при длине волны 280 нм. Объем образца – 100 мкл, скорость элюции – 1 мл/мин. В качестве белков-маркеров использовали набор “Gel Filtration Calibration Kits” (“GE Healthcare Life Sciences”, Великобритания), а также рекомбинантные тимидин- и уридинфосфорилазы из E. coli.

Выделение и очистку рекомбинантных NP и их мутантных форм проводили, как описано нами ранее для UDP [11].

Первичную структуру выделенных рекомбинантных белков подтверждали методом MALDI-TOF/TOF-масс-спектрометрического анализа их триптических гидролизатов.

Статистическую обработку результатов серии измерений проводили с использованием программы StatPlus2007 (http://analystsoft.com).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В научной литературе широко обсуждается вопрос природы термостабильности белков из различных микроорганизмов (психрофилы, археи, мезофилы, термофилы) [20–26]. Однако приведенные в работах [21, 26] данные сравнительного анализа термостабильности белков из мезо- и термофильных микроорганизмов показывают, что ни показатель плотности упаковки белков, ни сравнительный структурный анализ, ни величина температурного оптимума NP не позволяли отнести эти ферменты к термостабильным или термолабильным. Более того, в ряде случаев, у авторов существуют определенные разногласия при эксприментальном определении этих параметров для аналогичных ферментов [27]. Поэтому определение свойств белков-аналогов, желательно проводить в условиях не только одной лаборатории, но и с использованием одинаковых реагентов и аппаратурного оформления.

К настоящему времени NP из различных организмов (в том числе и термофильных) выделены и достаточно хорошо охарактеризованы. Учитывая, что эти белки хорошо кристаллизуются, для многих из них изучена пространственная организация. Наличие такого большого объема информации о свойствах и структурах этого класса ферментов, казалось бы, может способствовать эффективному решению вопроса об основных принципах формирования термостабильных белков и, в частности, NP. Однако попытки целенаправленно исследовать функциональную роль как фрагментов первичной структуры, так и отдельных а. о. в придании NP термостабильных свойств, не приводили к успеху при объяснении проявления термотолерантности этих ферментов. Среди этих публикаций можно выделить только несколько работ [28, 29].

В литературе на основе анализа множества белков-аналогов из термофильных и мезофильных организмов обнаружено, что они имели аналогичную третичную упаковку. Было показано, что эти белки не организуют в своем составе вторичных или третичных структур, которые можно было бы рассматривать как определяющие в формировании термостабильных белковых молекул. Высказывалось предположение, что именно электростатические взаимодействия заряженных а. о., наряду с водородными связями, являются основным регулятором термотолерантности белков. Кроме того, отмечается, что термостабильные белки как правило не содержат в своей структуре гидрофобных а. о. [26].

Одним из направлений исследования термостабильности белков стало предсказание этого параметра с применением биоинформатических подходов [30–34]. Следует признать, что, несмотря на предпринятые усилия, программное обеспечение еще далеко от совершенства и не дает четкой возможности предсказать термостабильность белков в целом, а также прогнозировать этот параметр при планировании точечных изменений в первичной структуре полипептидов. Причиной этого может являться многофакторность изменений свойств белков и невыясненная до конца природа фолдинга, как самих белков, так и их мутантных форм. Наиболее полно состояние этой проблемы отражено в работах [30, 35], где авторы высказывают пессимистичное мнение что, “несмотря на общий характер супермедленного разворачивания белков, эволюция может использовать (и использует) все, что направлено на стабилизацию белковой молекулы, и поэтому мы никогда не найдем всеобъемлющее химическое, биофизическое и энергетическое объяснение гипертермостабильности белка”. С этими выводами практически согласны и авторы обзора [20], в котором рассмотрены предполагаемые принципы формирования термостабильных белков у архей и эубактерий.

Настоящее исследование, направленное на изучение термостабильности одного класса белков – NP, несущих искусственно введенные точечные и протяженные (гибридные белки) замены в первичной структуре ферментов, может дать дополнительную информацию к дальнейшему построению биоинформационных технологий при решении фундаментальной проблемы – выяснению принципов формирования устойчивых к термической денатурации белков.

Ранее на основе клеток E. coli нами была сконструирована серия штаммов-продуцентов рекомбинантных NP и их мутантных форм из различных мезофильных и экстремофильного микроорганизмов (E. coli, K. aerogenes, S. typhimurim, S. oneidensis MR-1, H. chromatireducens AGD 8-3), что позволило создать “библиотеку” этих белков (табл. 2).

В данной библиотеке в качестве своеобразного контроля отсутствовала NP из термофильного микроорганизма. На первом этапе нами были предприняты эксперименты по конструированию штамма-продуцента такой рекомбинантной NP из термофильного микроорганизма. В качестве источника гена термостабильной TPP был выбран штамм Geobacillus stearothermophilus (GeneBank CP016552.1). Амплификацию гена ТРР из этого микроорганизма проводили с использованием праймеров CPYRgs и NPYRgs (табл. 1) аналогично описанному в работе [11]. После проведения амплификации целевой фрагмент ДНК (1336 п. о.) был выделен и клонирован по сайтам BamH1 и HindIII в составе экспрессионного вектора pUU18 под контроль промотор-операторной области гена UDP из E. coli. Соответствие нуклеотидной последовательности клонированного фрагмента запланированной подтверждали секвенированием. Сконструированный рекомбинантный экспрессионный вектор (рис. 1) был обозначен как pTPP(Gb). Экспрессионной плазмидой рTPP(Gb) трансформировали клетки штамма E.coli С600Δudp и анализировали уровень накопления целевого рекомбинантного белка. Полученные результаты (рис. 2) свидетельствовали о том, что TPP из G. stearothermophilus накапливался в растворимой фракции клеток штамма-продуцента. Следовательно, промотор-операторная область гена udp из E. coli способна осуществлять высокоэффективную транскрипцию гибридного гена TPP (deoA) из данного термофильного микроорганизма в условиях гетерологичной экспрессии. Рекомбинантный белок был выделен и показано, что он осуществлял обратимый фосфоролиз дезокситимидина, то есть обладал целевой ферментативной активностью.

Рис. 1.

Общая схема экспрессионных векторов, полученных в работе. Структурные части генов (TPP(Gb) или Hyb111) находятся под контролем промотор-операторной части (Pudp) гена UDP из E. coli.

Рис. 2

Электрофоретический анализ рекомбинантных белков в клетках E. coli C600Δudp в 12.5%-ном ПААГ с ДСН-Na. М – маркеры молекулярной массы белков; 1, 2, 4 – белки растворимых фракций штамма-реципиента и штаммов-продуцентов, полученные после разрушения ультразвуком клеток E. сoli; 3, 5, 6 – очищенные рекомбинантные ферменты: TPP из G. stearothermophilus, гибридный белок Hyb111 и TPP из E. coli соответственно.

Все рекомбинантные NP (табл. 2), исследованные в данной работе, были очищены ионообменной хроматографией и проявляли специфическую активность. Первичная структура белков была определена как сиквенсом соответствующих генов, так и MALDI-TOF/TOF-масс-спектрометрическим анализом их триптических гидролизатов. Методом аналитической гель-фильтрации была также подтверждена четвертичная структура выделенных нативных ферментов, их мутантных и гибридных форм: гексамерная для UDP и димерная для TPP.

Для корректного исследования устойчивости данных белков к тепловой денатурации необходимо было, прежде всего, определить условия проведения данных экспериментов. При этом цель достигнуть полной денатурации белков не ставилась, а в качестве показателя нарушения структуры изучаемых белков был выбран основной показатель – изменение или потеря ферментативной активности NP, имеющий не только теоретический, но и практический смысл [6, 37]. На начальном этапе исследования термальной стабильности изучаемых белков было важно определить влияние на фермент стабилизирующих факторов, в частности субстратов. Следует отметить, что степень этого влияния может зависеть не только от вида субстрата, но и структуры изучаемого белка, то есть, данный фактор не относится к числу предсказуемых и мог вносить существенный вклад в трактовку получаемых данных. В связи с этим были проведены предварительные эксперименты по выявлению стабилизирующего действия субстратов. Исследование проводили с использованием рекомбинантной TPP из E. coli. Эксперименты проводили в реакционной смеси, следующего состава: 5 мM тимидин и 10 мM фосфат-ион, 50°С. Полученные результаты (рис. 3а) показали, что Pi в концентрации 10 мM, действительно, оказывал существенное стабилизирующее действие на рекомбинантный фермент. Для подтверждения этого факта было проведено исследование влияния концентрации (дозозависимость) Pi на термальную стабильность ТРР (рис. 3б). Выявленный эффект стабилизации NP субстратами, определил тактику постановки исследования термостабильности изучаемых ферментов (см. раздел Методика).

Рис. 3.

Влияние субстратов на термостабильность ТРР из E. coli: а – 1 – без субстрата, 2 – 5 мМ тимидин, 3 –10 мМ фосфат; б: 1 – без субстрата, 2 – 10 мМ фосфат, 3 – 20 мМ фосфат, 4 – 40 мМ фосфат. Фермент инкубировали при температуре 50°С.

Важно также отметить, что в данной работе были выявлены оптимальные температуры проявления ферментативной активности (Т_опт) для каждого из исследуемых белков (табл. 2). Этот параметр был важен для определения температуры инкубации раствора белков при исследовании термотолерантности NP (значение температуры понижали на 5–10°С от значения Т_опт). При определении значения Т_опт для анализа предсказательного потенциала программы Tm Predictor (www.tm.life.nthu.edu.tw) был проведен теоретический расчет температур плавления исследуемых белков. Результаты сравнения экспериментальных и предсказанных T_м в целом показали хорошее совпадение (табл. 2) этих величин не только для нативных белков, но и их мутантных форм, хотя программа T_м Predictor и дает довольно широкое значение этого параметра по сравнению с экспериментально выявленными. В случае же мутантного белка UDP (Asp27Gly) из E. coli, предсказанная величина T_м значимо отличалась от экспериментальной Т_опт.

Обращает на себя внимание характер графиков при определении Т_опт для исследуемых ферментов. На рис. 4 приведено типичное изменение ферментативной активности под воздействием температуры при экспериментальном анализе T_опт для термостабильной ТРР из G. stearothermophilus и ее аналога из мезофильного микроорганизма (E. coli).

Рис. 4.

Влияние температуры на активность ТТР из G. stearothermophilus (1) и H. chromatireducens (2).

Из рис. 4 видно, что после достижении T_опт ферментативная активность термолабильной TPP из H. chromatireducens резко снижалась, в то время как аналогичный показатель у TPP из G. stearothermophilus снижался более плавно. Вероятно, характер кривой может быть объяснен тем, что изучаемые белки формируют активную форму в мультимерном комплексе, поэтому даже частичная диссоциация на субъединицы под воздействием температуры может приводить к относительно резкому снижению ферментативной активности. Кроме того, денатурация, вероятно, носит кооперативный характер, что и приводит к резкому падению ферментативной активности у ТРР из H. chromatireducens.

Из полученных нами экспериментальных результатов (табл. 2) можно сделать предварительный вывод о том, что само значение температурного оптимума не указывало на термостабильность белковой молекулы у NP в целом, но характер изменения активности при температурном воздействии может служить, по крайней мере, предварительной оценкой термостабильности для этого класса ферментов. Во многом этот факт отмечен и в работе [38]. Исследование термостабильности TPP из G. stearothermophilus (рис. 5), действительно показало, что этот показатель значительно превышал таковой для аналогичного белка из экстремофильного галофильного микроорганизма H. chromatireducens.

Рис. 5.

Термостабильность ТРР из G. stearothermophilus (1 ) при 60°С и из H. chromatireducens (2) при 50°С. Нижняя временная шкала для фермента 2, верхняя – для фермента 1.

В литературе описано исследование, направленное на получение термостабильной формы UDP из E. coli методом насыщающего итеративного мутагенеза [28]. Было получено две мутантных формы этого белка UPL7 (Met38Val, Lys40Asp, Lys235Arg, Gln236Ala) и UPL8(Lys235Arg, Gln236Ala), проявлявших повышенную, по сравнению с исходным ферментом, термостабильность. Авторы статьи объяснили влияние замен в мутанте UPL8 тем, что эти а.о. входят в состав спирального участка, сближенного с N-концом белка и сделали предположение, что указанные мутации стабилизируют весь этот район белковой молекулы, тем самым, осуществляя термостабилизацию фермента в целом. Таким образом, вторичная и третичная структуры этого домена (взаимодействие N- и C‑концевых а. о. в структуре NP) во многом могут определять как активность самого фермента, так и, предположительно, его термостабильность.

Анализ роли N-концевых а. о. в функционировании UDP, проведенный нами ранее с использованием сайт-направленного мутагенеза показал, что этот участок важен для формирования активной молекулы белка. Были исследованы также ферментативные свойства нативных, мутантных и гибридных (несущих протяженные замены в составе первичной структуры) NP [9–13, 15, 36]. В частности, было показано [15], что замещение N-концевого фрагмента (1–43 а. о.) в UDP из E. coli на аналогичный участок UDP из S. typhimurium приводило к увеличению ферментативной активности исходного белка. В работе [39] на основе рентгеноструктурного анализа обнаружено, что в гексамере UDP из E.coli присутствуют ионы калия, которые попарно координируют именно N-концевые а. о. (I69, E49 и S73) в соседних субъединицах этого фермента. Аналогичная координация а.о. ионами калия была выявлена и у ТРР [40]. Важность именно этой координации в проявлении ферментативной активности белка нами была подтверждена при исследовании свойств мутантной (C212S) формы фермента из S. oneidensis MR-1 [41]: ферментативная активность мутантной формы белка была в 5.5 раз выше при использовании К-фосфатного буфера по сравнению с Na-фосфатным. Аналогичные результаты повышения ферментативной активности были отмечены нами при исследовании других мутантных форм UDP из S. oneidensis MR-1 [36].

Вышеприведенные факты указывали на важность именно этого участка первичной структуры белка и предопределили проведение исследования, направленного на выяснение роли N-концевых а. о. в проявлении термоустойчивости NP. С этой целью нами был сконструирован ген гибридного белка (Hyb111), в котором фрагмент из 62 а. о. первичной структуры ТРР из E. coli заменены на соответствующий фрагмент ТРР из G. stearothermophilus.

Конструирование гена гибридного белка проводили как описано в [15] с использованием праймеров 11N и 11C (табл. 1). Общая структура экспрессионного вектора приведена на рис. 1, а схематическое представление структуры гибридного белка дана на рис. 6. Уровень накопления рекомбинантного белка Hyb111 при гетерологичной экспрессии его гена в клетках E. coli и гомогенность выделенного фермента показаны на рис. 2.

Рис. 6.

Структура гибридной (Hyb111) молекулы TPP. Полипептид TPP из E. coli выделен зеленым цветом, фрагмент (1–62 а. о.) TPP из G. stearothermophilus – синим. Стрелками указан переход первичных структур в гибридном белке. Построено на основе PDB ID 4EAF с использованием программы PyMol (www.pymol.org).

Исследование термостабильности гибридного белка Hyb111 показало (рис. 7, табл. 2), что введенная в N-концевую часть первичной структуры ТРР из E. coli протяженная замена (1–62 а. о.) на фрагмент аналогичного белка из G. stearothermophilus, действительно, повышала толерантность NP к температурному воздействию. Более того, исследование гибридного белка ES1 (гибрид E. coli–S. typhimurium) [15], также показало существенное увеличение термостабильности гибридного белка (табл. 2). В работе [36] было доказано, что именно эффективность связывания Pi является решающим и, во многом, лимитирующим фактором в проявлении активности у NP.

Рис. 7.

Термостабильность ТРР ( в % от исходной активности) из E. coli (1) при 50°С, G. stearothermophilus (2) при 60°С и гибридная молекула Hyb111 (3) при 50°С. Нижняя временная шкала для ферментов 1 и 3, верхняя – для фермента 2.

В литературе также описано [28] успешное применение искусственного эволюционного мутагенеза UDP из E. coli для получения ее термостабильной формы.

Анализ особенностей пространственной структуры UDP из E. coli и ее мутантных форм, а также результатов для других NP, в табл. 2, позволил предположить, что именно архитектура фосфат-связывающего сайта у NP может во многом определять термостабильность этого класса ферментов. Действительно, полученная в работе [28] термостабильная форма UDP из E. coli (рис.8), несет замены (Lys235Arg, Gln236Ala), которые расположены на N-конце альфа-спирального участка (Met234 – Leu253) и пространственно сближены с участком связывания Pi (рис. 8). Именно в этом же районе белковой молекулы находится и проведенная нами замена Asp27Gly. Следует отметить, что а. о. Asp27 находится в окружении Pro25 и Pro28, которые могут создавать жесткие конформационные ограничения для пространственной ориентации боковой цепи этого остатка. Важная роль остатка Asp27, как и всей архитектуры именно этого фрагмента в связывании Pi, подтверждается и резким повышением K_м для фосфат-иона у данной мутантной формы белка [15]. Аналогичные данные по уменьшению значения K_м для Pi отмечались нами ранее и для других мутантных форм UDP при изучении особенностей функционирования фосфат-связывающей области у этого фермента из различных микроорганизмов [36]. Совокупность данных, приведенных в табл. 2 и результаты работы [36] позволяют предположить, что уменьшение сродства мутантных белков к Pi сопровождалось повышением термостабильности NP. Одной из структурных особенностей формирования фосфат-связывающего сайта у NP являются малоструктурированные участки первичной структуры этих белков. Эти участки характерны для всех NP, например, у UDP из S. oneidensis MR1 один из таких фрагментов представлен 226–236 а. о. [41] и принимает участие в формировании “открытой” и “закрытой” конформаций белка. Термодинамическая подвижность такой петлевой структуры может во многом нарушать элемент третичной структуры белковой молекулы и, как следствие, приводить к потере эффективности связывания белком Pi, потере ферментативной активности белка и, в конечном итоге, инактивации фермента. Анализ фрагмента третичной структуры UDP из E. coli показал, что максимально термостабильная форма этого белка, полученная в работе [28], несет мутации Lys235Arg, Gln236Ala (рис. 8), которые находятся в непосредственной близости к малоструктурированному участку Met234 – Pro229. Этот факт позволил предположить, что внесенные замены могут приводить к существенному уменьшению подвижности указанной петли и стабилизировать как ее, так всю молекулу UDP.

Рис. 8.

Элемент третичной структуры мономера UDP из E. coli (PDB ID 1RXS) и расположение а. о., подвергавшихся мутагенезу в работах [15, 28]. Построение проводили с использованием программы PyMol (www.pymol.org). Pi – ион неорганического фосфата, K⁺ – ион калия. Петля: Pro229 – Met234, aльфа-спираль: Met234 – Leu253.

К настоящему времени для мутантной (UDP, E. coli, Asp27Gly) и гибридной (ES1, E. coli–S. typhimurium) NP, получены кристаллические формы и проводится рентегноструктурный анализ их вторичной, третичной и четвертичной структур.

Таким образом, на основании исследования сформированной библиотеки природных и мутантных форм NP получены новые данные о механизме стабилизации белка у этого класса ферментов при температурном воздействии. Сделано предположение об определяющей роли архитектуры фосфат-связывающей области этих белков в приобретении ими термостабильности. Определена роль как отдельных аминокислотных остатков, так и фрагментов полипептидной цепи NP в придании этим ферментам термотолерантности. Важную роль в термальной дестабилизации NP могут играть также малоструктурированные петлевые участки вторичной и третичной структуры, роль которых предполагается выяснить в последующем исследовании.

При проведении исследований использовали оборудование Центра коллективного пользования “Промышленные биотехнологии” Федерального исследовательского центра “Фундаментальные основы биотехнологии” Российской академии наук.

Исследование выполнено при частичной поддержке РФФИ (Грант № 18-04-00784А).