Прикладная биохимия и микробиология, 2020, T. 56, № 5, стр. 514-520

МЕТОДИКА

Микробные клетки и условия их культивирования. В работе использовали микроорганизмы Escherichia coli XL-1 (IBPPM 632) и Azospirillum lipoferum Sp59b (IBPPM 173), полученные из коллекции ризосферных микроорганизмов ИБФРМ РАН (Россия) (http://collection.ibppm.ru/).

Для получения бульонных культур микроорганизмов использовали жидкую питательную среду LВ следующего состава (г/л): NaCl – 5; дрожжевой экстракт – 10 и пептон – 5. Культивирование проводили при интенсивном перемешивании на шейкере (160 об./мин) в течение 18 ч при 30 ± 1°С. Перед проведением измерений осуществляли троекратную отмывку клеток используемых штаммов от культуральной среды центрифугированием (3354 g, 5 мин). Cуспензию клеток доводили буферным раствором до оптической плотности D₅₄₀ = 0.40–0.42 и использовали для анализа. Концентрацию клеток определяли на спектрофотометре “Specol-221” (“Carl Zeiss”, Германия). В работе использовали стандартный 0.1 М (Na₂HPO₄ ⋅ ⋅ 2H₂O ⋅ KH₂PO₄) фосфатный буфер, pH 7.0, (проводимость 5, 10, 20, 30 и 50 мкСм/см), а также воду с проводимостью 990 мкСм/см. Проводимость растворов контролировали с помощью кондуктометра HI 8733 (“HANNA”, США).

Определение концентрации фаговых частиц. Количество фаговых частиц определяли в Центре коллективного пользования научным оборудованием в области физико-химической биологии и нанобиотехнологии “Симбиоз” ИБФРМ РАН на приборе Specord BS-250 (“Analytik Jena”, Германия). Для расчета количества фаговых частиц использовали уравнение: (A₂₆₉ – A₃₂₀) × 5 × 10¹⁴/15, где A₃₂₀ – оптическая плотность суспензии при 320 нм и A₂₆₉ – при 269 нм [10].

Описание датчика и проведение анализа. Основным элементом датчика для определения микробных клеток являлась линия задержки, изготовленная из пластины Y–X ниобата лития толщиной 200 мкм [11]. На одной из сторон пластины были нанесены встречно-штыревые преобразователи для возбуждения и приема акустической волны с поперечно-горизонтальной поляризацией. На противоположной стороне пластины с некоторым зазором помещался жидкостный контейнер, основание которого было выполнено из пластины ниобата лития Z–X + 30°, среза толщиной 500 мкм. Зазор между дном контейнера и поверхностью пьезопластины обеспечивался с помощью полосок алюминиевой фольги толщиной 16 мкм. Скорость акустической волны, распространяющейся в такой структуре, изменяется при изменении проводимости жидкости, находящейся в контейнере. Изменение скорости волны приводит к изменению выходных параметров датчика (глубины и частоты пиков резонансного поглощения на частотной зависимости полных потерь акустической линии задержки) [12].

При помощи разработанного датчика экспериментально исследовалось специфическое и неспецифическое взаимодействие бактериальных клеток и бактериофагов непосредственно в жидкой фазе. Для этого датчик подключался к измерителю S–параметров E5071C (“Agilent”, США) в режиме измерения полных потерь выходного сигнала устройства. Первоначально измерялись характеристики датчика с контейнером без внесения жидкости, при этом было показано наличие ярко выраженных резонансных пиков на частотной зависимости полных потерь, связанных с возбуждением щелевой моды в исследуемой структуре [13]. Затем жидкостный контейнер заполнялся буферным раствором с заданной проводимостью (5–50 мкСм/cм) или водопроводной водой (проводимость 990 мкСм/см) и измерялись частотные зависимости полных потерь датчика.

Далее жидкостный контейнер очищали, просушивали, добавляли в него суспензию микробных клеток в буфере и измеряли параметры датчика. Измерения проводились для концентрации клеток 10⁶, 10⁴ и 10³ кл./мл. Затем в контейнер добавляли специфичный к клеткам бактериофаг и вновь проводили измерение частотной зависимости полных потерь датчика. Во всех измерениях использовали одинаковое количество бактериофага, выбранное на основании ранее проведенных экспериментов [7]. Аналитическим сигналом служило изменение глубины и частоты резонансных пиков при специфичном и неспецифичном взаимодействии бактериальных клеток с бактериофагом. Схема экспериментов представлена на рис. 1.

Рис. 1.

Общая схема эксперимента.

Все эксперименты проводились не менее пяти раз. Относительная погрешность результатов измерений составляла ±2%, т.е. при проведении нескольких экспериментов с одним и тем же взаимодействием суспензии клеток с бактериофагом значение глубины резонансных пиков на частотной зависимости полных потерь имели разброс значений на любой частоте в пределах ±2%.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Согласно принятым стандартам для оценки микробиологического качества воды проводят мониторинг бактерий группы кишечной палочки, поэтому для исследований использовали клетки представителя группы кишечной палочки E. coli. В качестве тестовой системы использовали клетки E. coli штамма XL-1 и специфичный им бактериофаг М13К07. Выбор такой модельной системы обусловлен тем, что бактериофаг М13К07 и процесс инфицирования клеток штамма XL-1 хорошо описан [14, 15]. Проведенные ранее исследования показали возможность регистрации инфекции клеток данным бактериофагом с помощью электроакустического датчика [7, 8].

Измерения проводили с помощью акустического датчика на основе щелевой моды в линии задержки с поперечно-горизонтальной волной нулевого порядка. Как уже отмечалось, при измерении характеристик датчика с пустым контейнером были обнаружены ярко выраженные пики резонансного поглощения на частотной зависимости полных потерь (α) датчика (рис. 2а). Появление этих пиков связано с распространением и пере-отражением щелевой акустической волны в структуре из двух пьезоэлектрических пластин, разделенных воздушным зазором [11–13]. Добавление буферного раствора (с проводимостью 5–50 мкСм/см) в контейнер приводило к значительному уменьшению глубины резонансных пиков. Это свидетельствовало о том, что данное устройство чувствительно к присутствию жидкости. На рис. 2б в качестве примера представлены частотные зависимости полных потерь (α) датчика при добавлении в контейнер буферного раствора с проводимостью 50 мкСм/см. Дальнейшее добавление к нему микробных клеток практически не влияло на характеристики датчика. В процессе исследований концентрация микробных клеток составляла 10⁶, 10⁴ и 10³ кл./мл На рис. 2в в качестве примера приведены частотные зависимости полных потерь датчика при добавлении клеток E. coli (10⁶ кл./мл) (кривая 2) к буферному раствору с проводимостью 50 мкСм/см (кривая 1).

Рис. 2.

Частотные зависимости полных потерь (α) датчика: пустой контейнер (а), контейнер с буферным раствором с проводимостью 50 мкСм/см (б), контейнер с буферным раствором до (1) и после (2) добавления микробных клеток E coli XL-1 (в), контейнер с буферным раствором и микробными клетками до (3) и после (4) добавления специфичного бактериофага (г).

При последующем добавлении в контейнер бактериофага, специфичного для клеток E. coli XL-1, наблюдалось значительное уменьшение глубины резонансных пиков и сдвиг их частоты по сравнению с контейнером, загруженным только буфером с клетками. На рис. 2г в качестве примера представлены частотные зависимости полных потерь датчика, в случае заполнения контейнера буферным раствором проводимостью 50 мкСм/см с клетками E. coli XL-1 (концентрация – 10⁶ кл./мл) до (кривая 3) и после (кривая 4) добавления специфичного бактериофага М13К07.

Полученные результаты свидетельствовали о чувствительности используемого датчика к регистрации инфекции микробных клеток специфичным бактериофагом. Причина регистрируемых изменений заключалась в следующем. При добавлении к суспензии клеток специфичного им бактериофага ее электрическая проводимость возрастала вследствие адсорбции фага на поверхности бактерий и повреждения клеточной мембраны. Нарушение целостности бактериальных мембран сопровождалось частичным выходом в суспензию компонентов клеточной цитоплазмы, что приводило к увеличению электрической проводимости суспензии. Это вызывало изменение скорости акустической волны в датчике, состоящем из двух разделенных зазором пьезоэлектрических пластин ниобата лития, одна из которых контактирует с исследуемой суспензией. Изменение скорости волны приводило к изменению выходных параметров датчика (глубина и частота пиков резонансного поглощения на частотной зависимости полных потерь датчика).

Для контроля полученных результатов проводили эксперименты, в которых применяли микробные клетки других штаммов и бактериофаг М13К07. В качестве балластных культур использовали клетки A. lipoferum Sp59b. Выбор клеток A. lipoferum обусловлен тем, что они имели близкие размеры с клетками кишечной палочки, но отличались таксономическим положением. Измерения проводились для тех же буферных растворов, что и в случае специфичного взаимодействия (5–50 мкСм/см) при количестве клеток в контейнере 10⁶, 10⁴ и 10³ кл./мл. Полученные результаты показали (рис. 3), что добавление к суспензии клеток A. lipoferum Sp59b бактериофага М13К07 не приводило к изменениям глубины и частоты резонансных пиков на частотной зависимости полных потерь датчика при любой проводимости буфера. Максимальное изменение глубины пика вблизи частоты 2.8 МГц составило всего – 0.5 дБ для буферного раствора проводимостью 50 мкСм/см.

Рис. 3.

Частотные зависимости полных потерь (α) датчика с контейнером, залитым буферным раствором с проводимостью 50 мкСм/см и клетками A. lipoferum Sp59b до (1) и после (2) добавления неспецифичного бактериофага М13К07.

Таким образом, датчик позволял разграничивать инфицирование бактериальных клеток специфичными бактериофагами, от контрольных экспериментов, когда такое инфицирование не происходило.

Одним из основных вопросов при разработке датчиков для определения микробных клеток является проведение исследований в реальных (или приближенных к реальным условиям) образцах. Анализ микробных клеток в воде, используемой в промышленности, муниципальных и коммерческих учреждениях и больницах, представляет существенную проблему, поскольку удельная электрическая проводимость воды в этих случаях очень высока за счет растворенных в ней ионных соединений. Для оценки чувствительности датчика при работе с реальными образцами жидкости были проведены исследования специфичного взаимодействия микробных клеток E coli XL-1 с фагом М13К07 и неспецифического взаимодействия микробных A. brasilense Sp7 с этим же фагом в водопроводной воде с проводимостью 990 мкСм/см. Методика проведения данного цикла экспериментов была аналогична описанной ранее. На рис. 4 (а, в) представлены частотные зависимости полных потерь датчика с контейнером, наполненным водопроводной водой с проводимостью 990 мкСм/см и клетками E coli XL-1 при их специфичном взаимодействии с бактериофагом М13К07. На рис 4 (б, г) представлены эти же частотные зависимости при неспецифичном взаимодействии клеток A. brasilense Sp 7 и бактериофага М13К07. Использовались суспензии клеток с концентрацией клеток 10³ кл./мл (рис. 4a, 4б) и 10⁶ кл./мл (рис. 4в, 4г). Кривые 1 соответствуют водной суспензии клеток без бактериофагов, кривые 2 – водной суспензии клеток с добавлением бактериофагов. Видно, что даже при такой высокой проводимости воды в случае специфичного взаимодействия микробных клеток с бактериофагом наблюдается изменение глубины и частоты резонансных пиков на частотной зависимости полных потерь датчика. Максимальное изменение глубины резонансного пика на частоте 2.8 MHz составляло 2.9 дБ.

Рис. 4.

Частотные зависимости полных потерь (α) датчика с контейнером, наполненным водопроводной водой проводимостью 990 мкСм/см при специфичном взаимодействии E coli XL-1 и бактериофага М13К07 (а, в) и при неспецифичном взаимодействии A. brasilense Sp 7 и бактериофага М13К07 (б, г). Концентрация клеток – 10³ (a, б) и 10⁶ (в, г) кл./мл. 1 – вода с клетками без бактериофага, 2 – вода с клетками после добавления бактериофага.

Очевидно, что регистрируемое изменение аналитического сигнала суспензии клеток при их инфицировании бактериофагом связано с наличием жизнеспособных бактерий. В табл. 1 в качестве примера представлены данные высева на среды E. coli XL-1 (начальная концентрация клеток 10³ кл./мл) после воздействия используемого раствора различной проводимости и результаты изменения глубины резонансного пика вблизи частоты 2.8 МГц после специфичного взаимодействия клеток и бактериофага M13K07. Аналогичные результаты получены для всех резонансных пиков и используемых концентраций клеток. Установлено, что проводимость среды не оказывала влияния на жизнеспособность бактерий.

Устойчивость микробных клеток к воздействию высокой проводимости среды может быть обусловлена тем, что бактерии выделяли внутренние ионы, а также различные метаболиты [16]. Клетки в условиях повышенной проводимости среды активируют открытие механико-чувствительных каналов для восстановления естественного тургора и проводят выброс осмолитов без лизиса клеток [17]. Таким образом, в этих условиях клетки остаются жизнеспособными. Однако на практике исследуемый образец может содержать смесь живых и мертвых клеток и способность различать такие клетки имеет решающее значение для практического применения. Это становится возможным при использовании бактериофагов в качестве селективного агента. При добавлении в исследуемую суспензию клеток специфичных бактериофагов можно не только определить микробные клетки, но и сделать вывод об их жизнеспособности, поскольку бактериофаги не инфицируют нежизнеспособные клетки.

Разработанный датчик на основе щелевой моды, представляет собой новую сенсорную платформу для быстрой регистрации взаимодействия микробных клеток с бактериофагами с целью обнаружения бактерий в воде. Как уже отмечалось, датчик основан на создании щелевой моды между двумя пьезоэлектрическими пластинами ниобата лития с зазором между ними. Верхняя пластина служит дном жидкостного контейнера, который заполнялся исследуемой суспензией клеток. После добавления специфичного бактериофага проводимость суспензии увеличивалась и, соответственно, изменялась скорость акустической волны, распространяющейся в такой структуре. Изменение скорости волны приводило к изменению выходных параметров датчика. По изменениям в выходных параметрах датчика для суспензии клеток до и после биологического взаимодействия можно было сделать заключение о наличии (или отсутствии) исследуемых бактерий в анализируемой суспензии. Несомненное достоинство описанной методики заключается в возможности проведения анализа жидкости без дополнительной иммобилизации компонентов сенсорной системы. Конструкция датчика, имеющего зазор между пластинами, позволяет снимать жидкостный контейнер и проводить его очистку от исследуемого образца, что являлось важным условием при работе с микроорганизмами. Наличие съемной жидкостной ячейки позволяло использовать ее многократно.

Таким образом, проведенные эксперименты показали возможность определения бактериальных клеток в воде с высоким значением проводимости (вплоть до 990 мкСм/см) путем регистрации специфичного взаимодействия бактериальной клетки с бактериофагом с помощью датчика на основе щелевой моды в акустической линии задержки с поперечно-горизонтальной волной нулевого порядка. Установлен предел детекции клеток, который оказался равным 10³ кл./мл при времени анализа 5 мин. Предварительный санитарный анализ воды с помощью биосенсорных устройств является необходимым дополнением к используемым микробиологическим исследованиям. Разработанный метод позволяет проводить скрининг большого количества образцов воды в краткие сроки, выявлять источники микробиологической опасности и оценивать риски заболевания. Полученные результаты могут служить основой для создания соответствующей сенсорной системы определения бактерий в воде.

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке гранта РФФИ (проекты №№ 19-07-00300 и 19-07-00304).