Прикладная биохимия и микробиология, 2020, T. 56, № 2, стр. 198-205

МЕТОДИКА

Микробные клетки и условия их культивирования. В работе использовали микробные клетки Azospirillum brasilense Sp7 (IBPPM 150), Escherichia coli XL-1 (IBPPM 632) and A. lipoferum Sp59b (IBPPM 173), полученные из коллекции ризосферных микроорганизмов ИБФРМ РАН (Россия), (http:// collection.ibppm.ru).

Для получения бульонных культур микроорганизмов использовали жидкую питательную среду LВ следующего состава (г/л): NaCl – 5; дрожжевой экстракт – 10 и пептон – 5. Культивирование проводили при интенсивном перемешивании на шейкере (160 об./мин) в течение 18 ч при 30 ± 1°С. После достижения логарифмической фазы роста клетки промывали дистиллированной водой (электропроводность 2 мкСм/см), отделяли центрифугированием при 3354 g в течение 5 мин и затем использовали для иммобилизации.

Формирование и модификация пленок полистирола. Пленки ПС получали методом центрифугирования. В качестве подложек использовали пластины монокристаллического кремния размером 10 × 10 мм². Гранулированный ПС растворяли в четыреххлористом углероде (CCl₄, 96 мас. %). Затем полученную смесь методом центрифугирования наносили на подложки в герметичной камере в атмосфере насыщенных паров растворителя. Скорость вращения подложки составляла 2000 об./мин. Толщина полученных пленок оценивалась по сколу образцов методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) и составляла 280 ± 20 нм. Модификацию поверхности пленок ПС осуществляли в вакуумной камере установки Orion-40T (“VTC”, Южная Корея). Подложки с нанесенной пленкой ПС располагали в зоне эрозии мишени магнетрона. Высокочастотный разряд (13.56 МГц) зажигался в атмосфере аргона. Мощность разряда составляла 100 Вт, рабочее давление в камере поддерживалось на уровне 10^–3 мбар. Обработка пленок ПС осуществлялась в течение 10, 20 и 30 с. Подробные результаты изучения влияния времени плазменной обработки на морфологию и структуру поверхности пленок ПС приведены в работе [11]. Морфология образцов полимерных покрытий изучалась при помощи СЭМ Mira II (“Tescan”, Чехия).

Определение концентрации микробных клеток. Концентрацию микробных клеток определяли по величине оптической плотности при 540 нм (D₅₄₀) в кювете с толщиной оптического слоя 1.0 см на спектрофотометре “Specol-221” (“Carl Zeiss, Jena”, Германия), массу сухих клеток (г/л) рассчитывали на основании предварительно построенных калибровочных кривых.

Иммобилизация микробных клеток. Перед иммобилизацией проверяли оптическую плотность суспензии клеток. Для адсорбции ПС помещали в среду с клетками так, чтобы она полностью была покрыта суспензией, и инкубировали при интенсивной аэрации в течение ~20 мин при температуре 35°С. Процент адсорбированных микробных клеток определяли по разнице их содержания в суспензии до и после инкубации с носителем (% иммобилизации клеток на носителе). Данный вариант расчета не исключал ошибки при определении абсолютных величин сорбции, но воспроизводимость результатов свидетельствовала об их достоверности.

Атомно-силовая микроскопия. После иммобилизации микробных клеток поверхность ПС изучали методом атомно-силовой микроскопии (АСМ) с помощью зондовой нанолаборатории NtegraSpectra (“NT-MDT”, Россия). Изображения поверхности ПС получали в полуконтактном режиме с помощью кремниевого зонда NSG-10. Область сканирования составляла 5 × 5 мкм (25 мкм²). Обработку изображений проводили с помощью программного комплекса Gwyddion.

Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ). Подготовку препаратов для получения электронно-микроскопических снимков проводили, как описано в работе [12]. Изображения получали при помощи просвечивающего электронного микроскопа Libra 120 (“Carl Zeiss”, Германия) при ускоряющем напряжении 120 кВ в Центре коллективного пользования на научном оборудовании в области физико-химической биологии и нанобиотехнологии “Симбиоз” ИБФРМ РАН.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В качестве носителя при иммобилизации микробных клеток были выбраны пленки из ПС. Для улучшения адсорбционных свойств пленок ПС проводилась их обработка в плазме ВЧ разряда в течение 10, 20 и 30 с.

Как видно из рис. 1а поверхность необработанной пленки полистирола выглядела относительно гладкой. Обработка пленок ПС в плазме ВЧ разряда приводила к ее изменению (рис. 1б–1г). Поверхность образца после обработки представлена образованиями неправильной формы диаметром 0.21 и длиной 1.8 мкм. На рис. 1в–1г отчетливо видно, что поверхность имела микродоменную структуру, состоящую из последовательно соединенных частиц неправильной формы. Частицы представляли собой полимерные цепи, свернутые в клубки-глобулы, которые имели разный размер из-за разной длины полимерных цепей. Плазменная обработка образцов полимерных пленок в течение 30 с приводила к уменьшению глубины пор (рис. 1г).

После модификации пленок ПС плазменным травлением проводили оптимизацию условий иммобилизации микробных клеток трех штаммов A. brasilense Sp7, A. lipoferum Sp59b и E. coli XL-1, которая включала подбор оптимальной микробной нагрузки для каждого исследуемого штамма, рН раствора, в котором проходила иммобилизация, и температуры. Также изучали влияние различного времени обработки пленок в плазме (10, 20 и 30 с) на эффективность иммобилизации биологических объектов на примере микробных клеток A. brasilense Sp7, A. lipoferum Sp59b и E. coli XL-1. Оптимальное время обработки в плазме составило 30 с, так как при таком времени обработки на поверхности пленок было определено наибольшее количество микробных клеток. Были выбраны оптимальные условия адсорбции микробных клеток на пленках ПС. Так, время иммобилизации клеток составляло 15–20 мин, значение рН среды, в которой проводили сорбцию – 7.0–7.2 и количество клеток в исходной суспензии (микробная нагрузка) ~1.30–1.42 г сухих клеток/л для всех штаммов. Использование более высокого содержания клеток оказалось нецелесообразным, поскольку при этом уменьшалось количество клеток, адсорбировавшихся на носителе, а количество клеток оставшихся в свободном состоянии – увеличилось. Иммобилизацию клеток проводили при 25–27°С.

На рис. 2 представлены ПЭМ-изображения микробных клеток использованных штаммов до иммобилизации. На рис. 2г представлено АСМ-изображение поверхности полимерной пленки с иммобилизованными клетками E. coli XL-1, в качестве примера.

Как правило, иммобилизованные клетки сохраняют способность к размножению после их иммобилизации и длительного использования в биотехнологических процессах. При этом кинетические характеристики роста (удельная скорость роста и время удвоения) иммобилизованных клеток существенно не отличаются от аналогичных характеристик свободных клеток [1, 13].

Жизнеспособность микроорганизмов определяется, прежде всего, их способностью к делению. После иммобилизации клеток всех изученных штаммов на поверхности пленок ПС проводили микробиологическую оценку их жизнеспособности. Определяли наличие зон роста клеток после внесения полученного иммобилизованного биокатализатора с клетками в чашку Петри с плотной питательной средой LB (рис. 3а). В качестве контроля использовали пленки ПС, которые наносили на твердую питательную среду LB (рис. 3б) без предварительной иммобилизации на них клеток.

Далее каждые 14 сут определяли время сохранения жизнеспособности биокатализаторов на основе клеток A. brasilense Sp7, A. lipoferum Sp59b и E. coli XL-1 в процессе их хранения при 4°С. Полученный биокатализатор, содержащий иммобилизованные клетки, в некоторых случаях сохранял активность при 4°С в течение 6 мес. (табл. 1).

Предполагают, что носитель играет роль защитного барьера для иммобилизованных клеток, “экранируя” их от негативного воздействия метаболитов, препятствуя их проникновению в матрицу. Однако, согласно результатам, полученным в работе [13], матрица носителя не является препятствием для проникновения в клетки даже таких высокомолекулярных соединений, как ДНК. Можно предположить, что одной из возможных причин длительного сохранения жизнеспособности бактерий после иммобилизации является капиллярная конденсация паров воды из окружающей среды в порах модифицированных ПС покрытий при их хранении.

Известно, что процесс адсорбции клеток зависит от площади доступной поверхности, которая определяется размерами пор, превышающими размер микробных клеток [2]. Результаты анализа СЭМ-изображений поверхности модифицированных полистирольных покрытий показали, что пленки ПС имели пористую структуру с открытыми цилиндрическими порами радиусом R₀ (50–200 нм).

При капиллярной конденсации внутри капилляров модифицированных ПС-покрытий вода образовывала вогнутый мениск. При частичном заполнении капилляра (поры катализатора) жидкостью на трехфазной границе раздела жидкость–газ–твердое тело действовали поверхностные силы, которые и обусловливали существование мениска – искривленной поверхности раздела газ–жидкость. Давление насыщенного пара над искривленной поверхностью мениска p_s определяется уравнением Кельвина [14]:

где p_s0 – давление насыщенного пара над плоской поверхностью, σ – поверхностное натяжение воды на границе раздела жидкость–пар, V_m – мольный объем воды, R – универсальная газовая постоянная, T – температура окружающей среды, r = R₀/cos(θ) – радиус мениска жидкости в капилляре, R₀ – радиус капилляра и θ – краевой угол смачивания водой стенок капилляра.

Состояние равновесия между жидкостью в капилляре и окружающей средой достигается при условии:

где p_rh = p_s0$\frac{{r.h.}}{{100\% }}$ – давление паров воды над плоской поверхностью и r. h. – относительная влажность окружающего воздуха.

Капиллярная конденсация наблюдалась в порах с критическим радиусом:

При хранении микробного биокатализатора в условиях пониженных температур вплоть до 4°С относительная влажность воздуха существенно изменялась по сравнению с условиями хранения при комнатной температуре (25°С).

В процессе подготовки и хранения иммобилизованных на пленках ПС микробных клеток температура окружающего воздуха изохорически понижалась с комнатной до температуры хранения (с 25 до 4°С), что приводило к увеличению влажности окружающего воздуха:

где p(25) – давление паров воды при температуре T(25) = 25°C, p – давление паров воды при температуре хранения T°C.

Учитывая, что давление паров воды при комнатной температуре определяется влажностью окружающего воздуха, получим:

где r. h.(25) – относительная влажность при температуре 25°C.

Давление насыщенного водяного пара над плоской поверхностью p₀ зависит от температуры и приблизительно его можно определить на основании соотношения Бака [15]:

где T – температура в градусах Цельсия, p_s – давление водяного пара в ГПа.

На рис. 4 представлена температурная зависимость влажности воздуха после его охлаждения. Видно, что охлаждение воздуха с заданной влажностью до некоторой критической температуры повышает его относительную влажность до 100%, что может приводить к конденсации паров воды.

На рис. 5 представлена зависимость критического радиуса капилляра R₀ от влажности окружающего воздуха r.h. Следует отметить, что если иммобилизованный биокатализатор с открытыми порами хранить охлажденным, то при определенной влажности в порах любых размеров наблюдается конденсация паров воды (при температуре поверхности 15°С).

Таким образом, понижая температуру хранения микробного биокатализатора можно создать условия для капиллярной конденсации влаги в порах ПС-пленки, модифицированной плазменным травлением. Конденсированная в порах полимерных матриц влага может способствовать сохранению жизнеспособности иммобилизованных на ее поверхности биологических объектов (бактерий) и сохранение их активности до 6 мес.

Результативность работы иммобилизованного биокатализатора на основе микробных клеток во многом определяется эффективностью снабжения иммобилизованных клеток питательными элементами, а также легкостью отвода метаболитов. Эти факторы зависят, главным образом, от диффузионных барьеров, создаваемых материалом носителя [16]. В основе интенсификации жизнедеятельности иммобилизованных микробных клеток лежат специфичные условия, возникающие на поверхности раздела фаз “жидкость–твердая поверхность”. Можно предположить, что граница раздела жидкости и твердого тела служит микросредой, в которой клеткам легче изменить условия своей жизнедеятельности в благоприятную для себя сторону.

Иммобилизованные биокатализаторы должны работать в достаточно широких диапазонах температур, значений pH, давлений, а также обеспечивать необходимую воспроизводимость в промышленных условиях. Немаловажным критерием при выборе носителя является возможность его повторного использования, что приводит к поиску дешевых и потенциально доступных материалов [22, 26 ] . Возможности применения органических и неорганических носителей для иммобилизации микробных клеток продемонстрированы в ряде работ [13, 17–24]. Возможности использования микробных клеток, иммобилизованных на пленках ПС, модифицированных плазменным травлением, продемонстрированы в биосенсорной детектирующей системе на основе сверхвысокочастотного (СВЧ) резонатора (5–8.5 ГГц) [20, 21].

Проведенное на примере клеток A. brasilense Sp7, A. lipoferum Sp59b и E. coli XL-1 изучение показало перспективность использования пленок ПС для иммобилизации с возможностью их многократного использования. Преимущества данного носителя – простота иммобилизации (путем адсорбции) и короткое время для иммобилизации клеток (~20 мин), при этом процесс обработки ПС в плазме составлял ~30 с, а микробные клетки после иммобилизации сохраняли жизнеспособность до 6 мес.

Полученные результаты представляют интерес с практической точки зрения для применения полимерных покрытий, модифицированных плазменным травлением, в качестве носителя для иммобилизации клеток при создании биосенсоров.

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проекты № 18-29-23042-мк и 19-07-00304).